火炬松生長和松脂性狀相關(guān)候選基因的單核苷酸多樣性分析

楊會(huì)肖， 劉天頤， 徐　斌， 劉純鑫， 王金榜， 黃少偉

(1 廣東省林業(yè)科學(xué)研究院， 廣東 廣州 510520； 2 廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院， 廣東 廣州 510642； 3 英德市林業(yè)科學(xué)研究所， 廣東 英德 513000)

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火炬松生長和松脂性狀相關(guān)候選基因的單核苷酸多樣性分析

楊會(huì)肖1，2， 劉天頤2， 徐斌1， 劉純鑫2， 王金榜3， 黃少偉2

(1 廣東省林業(yè)科學(xué)研究院， 廣東 廣州 510520； 2 廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院， 廣東 廣州 510642； 3 英德市林業(yè)科學(xué)研究所， 廣東 英德 513000)

摘要：【目的】對(duì)火炬松Pinustaeda生長和松脂產(chǎn)量相關(guān)功能基因單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)進(jìn)行篩選與分析，為分子標(biāo)記輔助育種提供技術(shù)基礎(chǔ)?！痉椒ā坷蒙镄畔W(xué)對(duì)火炬松cDNA文庫進(jìn)行整理、比對(duì)、剪接、注釋，挑選出與生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素及蒎烯合成相關(guān)的非重復(fù)序列基因(Unigene)作為候選基因片段，利用MEGA5.0和DnaSP4.0軟件對(duì)火炬松36個(gè)單株的8個(gè)候選基因片段進(jìn)行序列比對(duì)和分析?！窘Y(jié)果】 所測(cè)序列總長為5 177 bp，檢測(cè)到184個(gè)SNP位點(diǎn)，平均36.9 bp的基因序列中出現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)，其中123個(gè)為非同義突變、61個(gè)為同義突變SNP位點(diǎn)。核苷酸多態(tài)性πa和θw分別為0.020和0.016。對(duì)8個(gè)候選基因片段內(nèi)SNP位點(diǎn)進(jìn)行的連鎖不平衡分析顯示，隨著核苷酸序列長度的延伸，SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡在基因內(nèi)部迅速衰退(R2≤0.2)?！窘Y(jié)論】在火炬松中，基于候選基因內(nèi)SNP位點(diǎn)間的連鎖不平衡作圖是可行的。

關(guān)鍵詞：火炬松； 候選基因； 單核苷酸多態(tài)性； 連鎖不平衡

林木的重要性狀大多屬于數(shù)量性狀，由許多基因和環(huán)境共同作用來調(diào)控其生長與發(fā)育。傳統(tǒng)的數(shù)量遺傳學(xué)不能檢測(cè)控制數(shù)量性狀的基因的數(shù)量、基因在染色體上的位置、每個(gè)位點(diǎn)的貢獻(xiàn)大小以及基因間的關(guān)系。在數(shù)量性狀的多基因體系中，盡管可能存在效應(yīng)較大的主效基因，但多數(shù)基因?qū)δ繕?biāo)性狀可能只表現(xiàn)微效作用，而且表型受環(huán)境影響很大，因而采用傳統(tǒng)的育種途徑對(duì)這些性狀進(jìn)行選擇有很大的局限性[1-2]。近年來，連鎖分析和連鎖不平衡作圖已成為許多樹種檢測(cè)復(fù)雜性狀的手段。關(guān)聯(lián)分析是對(duì)控制數(shù)量性狀的多基因系統(tǒng)進(jìn)行遺傳剖析的有效手段，而關(guān)聯(lián)作圖則是植物遺傳學(xué)研究最重要的工具之一[3]。對(duì)某一植物種而言，篩選出的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)在進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析之前，有必要對(duì)目標(biāo)基因的群體遺傳學(xué)特征如核苷酸多樣性、基因進(jìn)化動(dòng)力及連鎖不平衡特征進(jìn)行分析，以便為SNP基因型分析位點(diǎn)的確定提供參考[4]。

火炬松Pinustaeda材性偏軟，具有粗糙的質(zhì)感，適用于船舶樓宇及一般建筑。生長素(IAA)、細(xì)胞分裂素與赤霉素在樹木生長過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用?；鹁嫠珊休^豐富的松脂，可為制藥和化工等行業(yè)提供原料。當(dāng)松樹受到甲蟲危害時(shí)，能在傷口處產(chǎn)生組成型或誘導(dǎo)型的松脂[5]，松脂是一種復(fù)雜的混合物，它包含單萜烯(松節(jié)油)，二萜類樹脂酸(松香)和較少量的倍半萜烯，而松節(jié)油的主要成分為蒎烯[6]。目前，關(guān)于松樹SNP標(biāo)記的研究較多，主要集中在生長[7]、材性[8-9]、代謝[10]、抗旱抗性[4,11]等方面，鮮見火炬松激素和蒎烯相關(guān)候選基因SNP標(biāo)記研究的報(bào)道。本研究以生長和松脂產(chǎn)量為目標(biāo)，從引自美國的火炬松基因資源試驗(yàn)林中選出36個(gè)單株為材料，并選擇8個(gè)相應(yīng)的候選基因片段進(jìn)行研究。通過PCR擴(kuò)增、純化回收后連接于T載體上，對(duì)目的片段的SNP位點(diǎn)進(jìn)行了篩選，分析了目標(biāo)基因核苷酸多樣性，連鎖不平衡特征。研究結(jié)果為后續(xù)SNP標(biāo)記與表型性狀的關(guān)聯(lián)分析提供參考。

1材料與方法

1.1植物材料

通過美國北卡羅萊納州立大學(xué)林木改良工業(yè)協(xié)作組織引進(jìn)的258個(gè)不同改良程度的火炬松家系，營造了基因資源林，以生長(樹高和胸徑)和松脂產(chǎn)量為目標(biāo)性狀，利用ASReml軟件估算了258個(gè)家系的生長和松脂產(chǎn)量育種值，選取能夠最大程度地反映基因資源變異水平的36個(gè)家系，每家系1株，共36個(gè)單株(36個(gè)基因型)，采集嫩芽或1年生新鮮松針，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2基因組DNA提取

取出保存的松針或嫩芽，稱取0.3 g，放入2 mL離心管中，加入小鋼珠，利用Qiagen的MM301磨樣儀將其磨碎，期間用液氮浸泡數(shù)次?；蚪MDNA的提取按照新型植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)描述的方法進(jìn)行。

1.3引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

從公共數(shù)據(jù)庫(GenBank和http://pinetree.ccgb.umn.edu)下載火炬松cDNA文庫的所有記錄，約32萬條，利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行序列的比對(duì)、剪接、組裝、注釋，獲得非重復(fù)序列基因(Unigene)。選取與生長、松脂蒎烯合成相關(guān)的8個(gè)候選基因片段，采用Primer6和Oligo7軟件設(shè)計(jì)和評(píng)估正反向PCR擴(kuò)增引物[12]。

以選取的36個(gè)單株樣本為材料，對(duì)8個(gè)候選基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，含30～60 ng模板DNA，每種dNTP 0.2 mmol·L-1，正、反向引物各0.2 mmol·L-1，1×PCR Buffer，1 UTaq聚合酶和體積分?jǐn)?shù)為1%的DMSO。采用PTC-200型PCR儀運(yùn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)；每個(gè)循環(huán)94 ℃變性30 s，45～62 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s,反應(yīng)共36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.4PCR產(chǎn)物的克隆、測(cè)序及計(jì)算機(jī)分析

依據(jù)所選的8個(gè)候選基因片段的核苷酸序列設(shè)計(jì)基因特異的引物，以36個(gè)樣本的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的目的基因片段純化回收后連接于pMD19-T載體上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌EscherichiacoliDH5α，篩選陽性克隆，送華大基因公司測(cè)序。應(yīng)用DNAMAN 6.0軟件和CLUSTALX軟件包推導(dǎo)出氨基酸序列并在NCBI進(jìn)行檢索分析，初步判斷候選序列位于編碼區(qū)還是非編碼區(qū)。將去除載體后的序列采用BioEdit的ClustalW2程序進(jìn)行聯(lián)配分析，獲得基因片段的一致序列，結(jié)合每條序列測(cè)序圖，在BioEdit中確定SNP位點(diǎn)并做記錄。

1.5基因的SNP多樣性分析和連鎖不平衡檢測(cè)

利用MEGA5.0和DnaSP4.0軟件對(duì)每個(gè)基因的36個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)分析，計(jì)算SNP頻率、顛換和轉(zhuǎn)換的SNP數(shù)量，估算各基因的核苷酸多樣性水平[13]。分別用參數(shù)θw和πa表示核苷酸多樣性水平，其中θw的估算以序列間每位點(diǎn)差異核苷酸的平均數(shù)為基礎(chǔ)[14]，πa的估算以分離位點(diǎn)的數(shù)量(S)為基礎(chǔ)[15]。單倍型多樣性(He)按照Nei[14]的公式計(jì)算。除以上定義外，核苷酸多樣性的描述還包括：靜默位點(diǎn)多樣性(θwsil)、非同義突變多樣性(πnsyn)和同義突變多樣性(πsyn)。將所有位點(diǎn)依次對(duì)應(yīng)的物理距離(bp)及其R2進(jìn)行組合，利用非線性回歸模型估算8個(gè)候選基因片段整體水平上的連鎖不平衡(LD)延伸。

2結(jié)果與分析

2.1候選基因片段的序列分析

8個(gè)候選基因片段序列分析結(jié)果見表1。每一候選基因片段的擴(kuò)增長度為431～1 007 bp(不包括插入或缺失位點(diǎn))，8個(gè)候選基因片段的測(cè)序總長度為5 177 bp，其中，編碼區(qū)的序列長度為3 322 bp，非編碼區(qū)的序列長度為1 855 bp(5′-UTR，3′-UTR 和內(nèi)含子)。共有24個(gè)樣本發(fā)生插入或缺失突變，總的插入片段長度為18 bp，缺失片段長度為80 bp。

表1　火炬松生長和松脂性狀候選基因片段序列分析

2.2SNP位點(diǎn)篩選

SNP位點(diǎn)篩選和分析結(jié)果見表2，對(duì)8個(gè)候選基因片段的序列進(jìn)行整合后共檢測(cè)到184個(gè)SNP位點(diǎn)，平均36.9 bp的基因序列中出現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)。SSGP_VOLCA基因片段上檢測(cè)了41個(gè)SNP位點(diǎn)，平均14.8 bp的基因序列中出現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)，而在Pt30-2基因片段上檢測(cè)了18個(gè)SNP位點(diǎn)，平均55.9 bp的基因序列中出現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)。非同義突變的位點(diǎn)有123個(gè)，靜默突變(同義突變)有61個(gè)SNP 位點(diǎn)。

表2　火炬松生長和松脂候選基因片段序列核苷酸變異

1)平均值。

2.3核苷酸多樣性

采用MEGA5.0和DnaSP4.0軟件對(duì)各候選基因36個(gè)樣本序列進(jìn)行分析，計(jì)算8個(gè)候選基因的核苷酸多樣性系數(shù)(表3)。8個(gè)候選基因平均核苷酸多態(tài)性πa和θw分別為0.020和0.016，處于較高水平，其中核苷酸多態(tài)性πa的變化范圍介于0.006～0.034，核苷酸多態(tài)性θw的變化范圍介于0.003～0.030。這比先前報(bào)道的相同樹種其他性狀或不同樹種同類性狀相關(guān)基因的核苷酸多態(tài)性高(表4)。有報(bào)道顯示，火炬松的材性和生長性狀相關(guān)基因的核苷酸多態(tài)性平均為0.005 9[4,8,16]，是本研究的0.3倍。Pot等[17]報(bào)道，海岸松P.pinaster和輻射松P.radiata材性方面的核苷酸多態(tài)性是0.002 41和0.001 86，分別是本研究的0.12和0.09倍。核苷酸多態(tài)性的研究也在其他針葉樹種中有所報(bào)道，例如樟子松P.sylvestrisvar.monglica[18-19]，花旗松Pseudotsugamenziesii[9,16,20]和柳杉Cryptomeriajaponica[21]。

在8個(gè)候選基因片段中，具有最高核苷酸多態(tài)性πa和θw的基因片段分別是ARR17_ARATH(πa=0.034)和SSGP_VOLCA(θw=0.030)，具有最低核苷酸多態(tài)性πa和θw的基因片段是Pt30-4和CKX7_ARATH(πa=0.006，θw=0.003)。靜默位點(diǎn)的平均核苷酸多樣性(θwsil)為0.022，該值與非同義突變位點(diǎn)多樣性(πnsyn=0.014)基本相同。本研究與同一樹種的其他性狀如抗旱性、材性和抗性的候選基因相比，核苷酸多樣性θw高出其他相關(guān)研究3.2和4.0倍[4,8]?；蚱蜟OGT2_ARATH的非同義突變多樣性(πnsyn)是基因片段CKX7_ARATH的14.5倍，非同義突變位點(diǎn)多樣性在0.029～0.002之間變化(表3)，這表明基因間在適應(yīng)性進(jìn)化歷史中變化較大[22]?；蚱蜳t30-2、Pt30-4和CKX7_ARATH的非同義分歧很低，即0.002～0.004，表明這些基因具有很強(qiáng)的保守核苷酸序列。8個(gè)候選基因片段中的2個(gè)基因片段(Pt30-1和Pt30-4)的Ka/Ks比值大于1，說明這些基因受正向選擇的影響較大。其余基因片段的Ka/Ks比值都小于1，說明他們受負(fù)向選擇的影響較大，核苷酸序列相對(duì)保守。

表3　火炬松生長和松脂性狀候選基因片段核苷酸多樣性分析1)

1)S為分離位點(diǎn)的數(shù)量，θw、πa為總核苷酸多樣性，πsyn、πnsyn分別為同義和非同義突變多樣性，θwsil為靜默位點(diǎn)多樣性，Ks為編碼區(qū)同義突變平均數(shù)，Ka為編碼區(qū)非同義突變平均數(shù)，Nh為單倍型個(gè)數(shù)，He為單倍型多樣性，Rm為歷史重組事件最小數(shù)。

單倍型的平均數(shù)(Nh)和單倍型多樣性(He)平均值分別為11.25和0.909。在8個(gè)候選基因片段中發(fā)現(xiàn)核苷酸數(shù)和核苷酸多樣性有較大的變化，其中單倍型個(gè)數(shù)的變化范圍介于6～21，單倍型多樣性變化范圍介于0.625～1.000。采用四配子檢測(cè)進(jìn)行最小歷史重組事件(Rm)估算，結(jié)果表明8個(gè)候選基因片段的Rm為1～7。

2.4連鎖不平衡和重組

將8個(gè)候選基因片段的位點(diǎn)間連鎖不平衡數(shù)據(jù)(R2)匯總后進(jìn)行綜合分析，期望從總體上了解火炬松基因組中連鎖不平衡情況。對(duì)R2值的非線性回歸分析結(jié)果見圖1，隨著候選基因片段核苷酸序列長度的增加，SNPs的連鎖不平衡程度迅速削弱，當(dāng)長度達(dá)400 bp左右時(shí)，R2<0.2，連鎖不平衡迅速衰退。這一結(jié)果表明，在火炬松中，SNP的連鎖不平衡在候選基因片段內(nèi)部就已衰退。這與其他的針葉樹種的報(bào)道一致[8-9]。連鎖不平衡衰退率在不同的植物中的變化較大，玉米Zeamays的候選基因片段長度為1 500 bp，當(dāng)在200 bp左右時(shí)，R2降低到0.2以下；擬南芥Arabidopsisthaliana的候選基因片段長度為100 000 bp，當(dāng)在50 000 bp左右時(shí)，R2降低到0.2以下[25]。

表4　不同性狀的候選基因核苷酸多樣性在其他林木中的應(yīng)用1)

1)θw為總核苷酸多態(tài)性，πnsyn和πsyn分別為非同義和同義突變多樣性，He為單倍型多樣性。

圖18個(gè)候選基因片段總體連鎖不平衡分析的R2隨堿基對(duì)長度衰減情況

Fig.1Scatter plot of distances in base pairs and linkage disequilibrium estimates (R2) between SNP sites in eight candidate genes in Pinus teada

3討論與結(jié)論

火炬松是南方商品林的主要樹種之一，適宜在粵北和粵東北低山種植?；鹁嫠傻倪z傳改良時(shí)間較長，目前正處在第2代向第3代過渡階段。在火炬松第1、2代育種過程中，生長量獲得顯著提高，但忽略了對(duì)產(chǎn)脂量的選擇。為了適應(yīng)林業(yè)生產(chǎn)對(duì)松樹多用途的需求，本研究以高產(chǎn)脂和速生為目標(biāo)，選擇了8個(gè)候選基因片段，其中4個(gè)基因片段與松脂合成有關(guān)，4個(gè)基因片段與火炬松生長(包括生長素和細(xì)胞分裂素)有關(guān)，將8個(gè)候選基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，共得到5 177 bp的基因片段序列，其中編碼區(qū)的序列長度為3 322 bp，非編碼區(qū)的序列長度為1 855 bp。非同義突變SNP位點(diǎn)(123)多于靜默SNP位點(diǎn)(61)。8個(gè)候選基因片段的SNP篩選分析研究表明，編碼區(qū)的SNP數(shù)量高于非編碼區(qū)，與其他松樹的SNP分析結(jié)果一致，表明火炬松的編碼區(qū)比其他部位具有更高的保守性。但是不同候選基因的 SNP 頻率不一樣，說明各個(gè)基因的保守性不同，可能是由于在進(jìn)化過程中受到的選擇壓力不同所致。

8個(gè)候選基因片段的平均核苷酸多樣性πa和θw分別為0.020和0.016，與先前報(bào)道的核苷酸多樣性相比，本研究8個(gè)候選基因片段的核苷酸多樣性較高，這可能是因?yàn)椴牧暇擢?dú)立的變遷歷史和地理分布，不同的遺傳基礎(chǔ)造成了核苷酸多樣性的差異，今后應(yīng)更大范圍取樣以便更全面地了解該樹種的遺傳多樣性水平。另一部分原因可能是本研究所用的材料為針葉部位，這個(gè)部位的基因組比大配子體復(fù)雜。8個(gè)候選基因片段的單倍型個(gè)數(shù)(Nh)和單倍型多樣性(He)平均值分別為11.25和0.909，單倍型多樣性的平均標(biāo)準(zhǔn)誤為0.065，Rm為1～7。本文檢測(cè)到了較高程度的核苷酸多樣性，表明利用SNP標(biāo)記對(duì)火炬松進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)需要較多的SNP 標(biāo)記。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著LD衰退距離的增加，總體趨勢(shì)基本平穩(wěn)，但火炬松8個(gè)候選基因片段總體的LD水平稍高，這可能是由于所選樣品數(shù)量較少。Kim等[26]提出當(dāng)個(gè)體遺傳背景差異較小時(shí)，較大的樣本量一般具有較低的LD水平。大量研究表明林木具有較低的LD水平，適宜基于候選基因片段的連鎖不平衡作圖研究。在楊樹中，基于SNP的連鎖不平衡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，楊屬Populus近緣種的候選基因片段內(nèi)LD衰退距離為300～1 700 bp不等[22,27-29]。Thumma等[30-31]發(fā)現(xiàn)亮果桉EucalyptusnitensLD水平在基因CCR和COBRA-like內(nèi)已衰退至不明顯。在針葉樹種中，基于SNP標(biāo)記的LD水平在幾千個(gè)堿基長度內(nèi)已衰退至不明顯[8-10,32]，這些研究結(jié)果與本研究的LD檢測(cè)基本一致，揭示了基于候選基因片段的關(guān)聯(lián)遺傳研究是可行的。本研究進(jìn)行的連鎖不平衡分析僅限于候選基因片段內(nèi)部,火炬松基因間隔區(qū)域、不同染色體及全基因組水平的LD需要更多的標(biāo)記去驗(yàn)證。隨著火炬松全基因組測(cè)序、拼接、注釋完成及重測(cè)序研究的開展，該物種基因組水平的LD衰退趨勢(shì)將會(huì)得到更深入全面的檢測(cè)。

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【責(zé)任編輯李曉卉】

Analysis of single nucleotide polymorphisms within candidate genes

involved in growth and resin biosynthesis of loblolly pine

YANG Huixiao1,2， LIU Tianyi2, XU Bin1, LIU Chunxin2, WANG Jinbang3, HUANG Shaowei2

(1 Guangdong Academy of Forestry, Guangzhou 510520, China; 2 Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and

Utilization of Forest Plant Germplasm/College of Forestry and Landscape Architecture, South China

Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 3 Yingde Institute of Forestry, Yingde 513000, China)

Abstract：【Objective】 Single nucleotide polymorphisms (SNPs) within candidate genes involved in growth and resin biosynthesis of loblolly pine，Pinustaeda, were screened and analyzed, preparing technical basis for later marker-assisted breeding.【Method】The candidate unigenes related to auxin, gibberellins, cytokinins or pinene synthesis were selected from loblolly pine cDNA library using bioinformatics. The sequences of eight candidate genes from 36 loblolly pine individuals were aligned and compared using MEGA5.0 and DnaSP4.0 softwares.【Result】 The total length of measured sequences was 5 177 bp. There were 184 SNPs to be detected, and in average there was one SNP site in every 36.9 bp sequence. Among them, 123 were nonsynonymous SNPs and 61 were silent SNPs. The levels of nucleotide diversity for sequenced regions represented byπaandθwwere 0.020 and 0.016, respectively. The linkage disequilibrium(LD) of SNPs in the eight candidate genes declined rapidly (R2≤0.2) with the nucleotide sequences increased in length. 【Conclusion】 LD mapping of SNPs in the five candidate genes are useful for loblolly pine breeding.

Key words：loblolly pine; candidate gene; single nucleotide polymorphism (SNP); linkage disequilibrium (LD)

中圖分類號(hào)：S722.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-411X(2016)01-0075-07

基金項(xiàng)目：廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新專項(xiàng)資金(2011KJCX013-02)；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃專題(2012BAD01B0203)；聯(lián)合國發(fā)展計(jì)劃署援建的火炬松改良種子園項(xiàng)目(CPR/91/153，1992-1996)

作者簡介：楊會(huì)肖(1981—)，女，助理研究員，博士研究生，E-mail: hxyang@sinogaf.cn；通信作者：黃少偉(1964—)，男，教授，博士，E-mail: shwhuang@scau.edu.cn

收稿日期：2015-04-07優(yōu)先出版時(shí)間：2015-12-07

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20151207.1133.028.html

楊會(huì)肖， 劉天頤， 徐斌，等.火炬松生長和松脂性狀相關(guān)候選基因的單核苷酸多樣性分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,37(1):75-81.