上調(diào)miR-101對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株的增殖、侵襲、遷移及化療敏感性的作用

陳樂(lè)高，崔盈

·講座與綜述·

上調(diào)miR-101對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株的增殖、侵襲、遷移及化療敏感性的作用

陳樂(lè)高，崔盈

目的研究miR-101在結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)水平及其對(duì)HT-29和RKO結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖、侵襲和遷移的作用。方法采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)42對(duì)結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織中miR-101的表達(dá)情況；利用重組miR-101腺病毒上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29和RKO中miR-101的表達(dá)，克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖的影響，遷徙試驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響，侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響，并用噻唑藍(lán)（MTT）檢測(cè)相對(duì)增值率以及對(duì)5-氟尿嘧啶（5-FU）和順鉑（DDP）的化療效果影響。結(jié)果miR-101在結(jié)腸癌組織中表達(dá)降低，上調(diào)miR-101的表達(dá)能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29和RKO的增殖，降低其遷徙和侵襲能力，上調(diào)miR-101的表達(dá)能夠增強(qiáng)5-FU和DDP對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29的殺傷作用。結(jié)論miR-101在結(jié)腸癌組織中表達(dá)降低，上調(diào)miR-101的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具有抑制增殖和降低侵襲能力的作用，miR-101可能對(duì)結(jié)腸癌化療效果有協(xié)同作用。

結(jié)腸癌；miR-101；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷徙；侵襲；化療

結(jié)腸癌是一種常見(jiàn)的消化道腫瘤，由于腫瘤生長(zhǎng)迅速，早期轉(zhuǎn)移、化療耐藥等原因使得結(jié)腸癌患者的生存率難以提高［1］。microRNA（miRNA）是一種由約22個(gè)核苷酸構(gòu)成的單鏈非編碼RNA分子，它能與靶基因mRNA的3'-UTRs結(jié)合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后沉默［2］。異常表達(dá)的miRNA，如miR-1260b［3］、miR-195-5p［4］等在結(jié)腸癌的疾病發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。已有研究表明miR-101與乳腺癌［5］、肺癌［6］及卵巢癌［7］等疾病相關(guān)，在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況及生物學(xué)功能尚不清楚。本研究主要分析miR-101在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料收集浙江省人民醫(yī)院2015年4—12月收治的42例新鮮結(jié)腸癌手術(shù)切除標(biāo)本及癌旁正常組織（距腫瘤組織5 cm以上），術(shù)前均未接受過(guò)放化療，且術(shù)后病理診斷明確。其中男26例，女16例；年齡43～87歲，中位年齡57歲。腫瘤位置：左半結(jié)腸22例，右半結(jié)腸10例；病例類型：管狀腺癌29例，腺癌13例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期36例，Ⅳ期6例。新鮮組織標(biāo)本切除后，凍存于-80℃超低溫冰箱中。

1.2材料結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29和RKO購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；OneStepPrimeScriptmiRNA cDNA Synthesis Kit、SYBR Premix Ex TaqTMII定量PCR試劑盒購(gòu)自TAKARA公司；重組miR-101腺病毒（Ad-miR-101）和重組EGFP腺病毒（Ad-EGFP）由浙江省胃腸病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合成［8］；遷徙試劑盒（TranswellsChamberassays）購(gòu)自美國(guó)BD公司；侵襲試劑盒（Boyden Chambers assays）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.3結(jié)腸癌組織及癌旁組織中miR-101的檢測(cè)

1.3.1總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄按RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。利用miRNAcDNA SynthesisKit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系：2×miRNA Reaction Buffer Mix 10 l，0.1%PBS 2 l，miRNA PrimeScrip RT Enzyme Mix 2l，Total RNA 1 l，RNase Free dH2O 5 l；反應(yīng)條件：37℃60 min，85℃5 s。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCRmiR-101的正向特異性引物序列為：5’TACAGTACTGTGATAACTGAA3’，內(nèi)參U6B的正向特異性引物序列為：5’ACGCAAATTCGTGAAGCGTT3’；反向引物為逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中提供的通用引物。PCR反應(yīng)體系：SYBRPremix 10 l，Rox 0.4 l，正反向引物各0.5 l，模板1 l，dH2O 7.6 l；反應(yīng)條件：94℃4min，1個(gè)循環(huán)；94℃5s，55℃20 s，72℃20 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線程序：95℃1min，55℃30s，95℃30s，1個(gè)循環(huán)。miR-101的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算公式為2-△ct，△ct=Ct（miR-101）-Ct（U6B）。

1.4HT-29和RKO細(xì)胞株中重組miR-101腺病毒的感染取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT-29和RKO細(xì)胞接種于6孔板中（細(xì)胞濃度2×105個(gè)/孔）。將Ad-miR-101作用于細(xì)胞（感染指數(shù)=100），作為實(shí)驗(yàn)組；將Ad-EGFP作用于細(xì)胞，作為對(duì)照組。感染24h后，利用qRT-PCR檢測(cè)感染效果及進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.5細(xì)胞克隆試驗(yàn)將200個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞種植于6孔板上，每5天更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)2周以后，集落用100%的甲醇固定15 min，然后用Giemsa染色液染色，最后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6遷徙試驗(yàn)采用24孔的Transwells Chamber試劑盒，上室中加入200l含有4×104個(gè)細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)基（不含牛血清），下室中加入含30%牛血清的DMEM培養(yǎng)基。經(jīng)過(guò)24 h孵化，黏附于膜下層表面的細(xì)胞被固定，染色后拍照計(jì)數(shù)。

1.7侵襲試驗(yàn)利用Matrigel Invasion chamber試劑盒，在上室中加入300 l不含牛血清DMEM培養(yǎng)基，將5×105實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞懸于其中；把含30%牛血清的500l DMEM基質(zhì)作為下層膠質(zhì)，創(chuàng)造一個(gè)趨化梯度。經(jīng)過(guò)48 h孵化，細(xì)胞固定染色P拍照計(jì)數(shù)。

1.8噻唑藍(lán)（MTT）試驗(yàn)收集上述實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×103個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜后分別加入PBS（5 l）或5-FU（5 g/ml）或順鉑（1 g/ml），恒溫箱孵育24、48、72h，每孔加入20 lMTT液（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出培養(yǎng)板。吸凈上清液，每孔加入150 lDMSO，振蕩15min。以630nm為參考波長(zhǎng)，570 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的吸光度（A）。設(shè)加入PBS的對(duì)照組細(xì)胞株為空白對(duì)照組，按以下公式計(jì)算相對(duì)增值率。相對(duì)增殖率（%）=實(shí)驗(yàn)組（A 570 nm-A 630 nm）/空白對(duì)照組（A570nm-A630nm）×100%。

1.9統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，配對(duì)計(jì)量資料采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；等級(jí)資料采用2或Fisher確切概率檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1miR-101在結(jié)腸癌組織中表達(dá)降低結(jié)腸癌組織中miR-101的相對(duì)表達(dá)量（7.40±1.22）×10-2，顯著低于癌旁正常組織（1.31×10-1±3.11×10-2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.677，P＜0.05）。

2.2Ad-miR-101對(duì)miR-101表達(dá)的影響qRT-PCR的檢測(cè)結(jié)果表明感染了Ad-miR-101的實(shí)驗(yàn)組的HT-29和RKO細(xì)胞株的miR-101相對(duì)表達(dá)水平（6.75×10-2±2.14×10-4、7.32×10-3±8.01×10-4）相對(duì)于對(duì)照組（3.06×10-3±9.70×10-4、2.73×10-3±1.21×10-3）明顯上調(diào)（t=4.701、19.413，均P＜0.05）。

2.3miR-101對(duì)HT-29和RKO細(xì)胞增殖的影響上調(diào)miR-101對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和RKO的增殖有明顯的抑制作用，過(guò)表達(dá)miR-101的HT-29細(xì)胞的克隆形成能力（90.3±7.23）較對(duì)照組明顯降低（145.7±25.2）；過(guò)表達(dá)miR-101的RKO細(xì)胞的克隆形成能力（24.5±4.2）較對(duì)照組明顯降低（52.8±7.9），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.900、46.697，均P＜0.05）。

2.4miR-101對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷徙、侵襲的影響過(guò)表達(dá)miR-101的細(xì)胞的遷徙侵襲能力較對(duì)照組明顯減弱，HT-29細(xì)胞的遷徙能力和侵襲能力分別下降了約45.3%和50.4%（t=37.863和19.234，均P＜0.05）；RKO細(xì)胞的遷徙能力和侵襲能力下降了約33.3%和60.1%（t=6.239、53.642，均P＜0.05）。

2.5miR-101對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及化療藥物敏感性的影響培養(yǎng)24、48、72 h后，HT-29細(xì)胞相對(duì)增殖率分別為（87.3±7.74）%、（76.4±5.63）%、（72.9±8.15）%（P＜0.05）；RKO細(xì)胞相對(duì)增殖率分別為（82.5±6.26）%、（78.1±3.78）%、（75.3±4.17）%（P＜0.05）。加入小劑量的5-FU培養(yǎng)24、48、72 h后，HT-29細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組的增值率［（38.7±6.53）%、（25.6±3.11）%、（22.1±5.97）%］顯著低于對(duì)照組的增值率［（43.2±4.89）%、（25.9±4.73）%、（23.5±2.87）%］（t≥9.726，均P＜0.05）。在加入小劑量順鉑24、48、72 h后，HT-29細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)組的增值率［（48.5±5.32）%、（23.6±5.99）%、（23.9±8.67）%］顯著低于對(duì)照組的相對(duì)增殖率［（52.3±3.26）%、（27.8±6.12）%、（29.6±4.84）%］（t≥4.675，均P＜0.05）。HT-29細(xì)胞株在加入小劑量的5-FU和順鉑后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的相對(duì)增值率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

3　討論

miRNA的異常表達(dá)和人類多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系，如胃癌、腎癌及肝癌等［9］。最近研究表明，miRNA作為癌基因或者抑癌基因參與結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中。如Tang等［10］研究表明，miR-345能夠通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞甲基化水平來(lái)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。Eyking等［11］研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸黏液腺癌中，miR-373刺激異常有絲分裂和細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化導(dǎo)致癌癥發(fā)生和發(fā)展；miR-205能夠促進(jìn)KLF4、MUC2和 TGF 1的分泌，從而導(dǎo)致化療耐藥。

miR-101是近年才被研究的miRNA分子，目前關(guān)于miR-101腫瘤的報(bào)道基本上認(rèn)為它是抑癌基因。Long等［12］發(fā)現(xiàn)miR-101在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)降低，它可以抑制膀胱癌細(xì)胞株T24的增殖和侵襲，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明其調(diào)控的靶基因?yàn)閏-FOS。Lei等［13］證實(shí)miR-101可以抑制PRDM16基因的表達(dá)，破壞星形細(xì)胞瘤線粒體功能，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Goto等［14］研究發(fā)現(xiàn)，miR-101在舒尼替尼耐藥的腎細(xì)胞癌組織中表達(dá)降低，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明miR-101能夠抑制Caki-1和786-O細(xì)胞的遷徙和侵襲，miR-101直接調(diào)控UHRF1信號(hào)通路，UHRF1的過(guò)表達(dá)已經(jīng)被證實(shí)和舒尼替尼耐藥密切相關(guān)。此結(jié)果與本文結(jié)果有相似之處。本研究證實(shí)，miR-101在結(jié)腸癌組織中表達(dá)降低，上調(diào)了miR-101表達(dá)的HT-29和RKO細(xì)胞，生長(zhǎng)速度明顯減慢，侵襲和遷徙的能力減弱。

化療是治療結(jié)腸腫瘤的重要手段之一，然而細(xì)胞耐藥一直是困擾結(jié)腸癌患者治療的一個(gè)巨大難題?？茖W(xué)家們努力在尋找一種藥物能夠幫助解決這個(gè)問(wèn)題，MicroRNA作為化療輔助用藥逐漸成為研究的熱點(diǎn)。Liu等［15］研究證明，miR-203在結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)都降低，它可以抑制SIK2的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的化療敏感。Hu等［16］研究發(fā)現(xiàn)，miR-205在乳腺癌耐藥細(xì)胞株中表達(dá)降低，上調(diào)miR-205的表達(dá)能夠顯著提高這兩個(gè)細(xì)胞株對(duì)多柔比星和紫杉醇的化療敏感性。Zhu等［17］發(fā)現(xiàn)在順鉑耐藥的胃癌患者中，miR-20a在腫瘤標(biāo)本和血漿中表達(dá)增高。上調(diào)miR-20a抑制CYLD的表達(dá)，誘導(dǎo)NF B信號(hào)通路，激活下游基因livin和survivin，導(dǎo)致細(xì)胞耐藥。本研究證明，miR-101能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，在HT-29細(xì)胞株中，miR-101顯著增加了化療藥物5-FU和順鉑對(duì)細(xì)胞的殺傷作用；然后在RKO細(xì)胞株中，化療藥物的作用卻沒(méi)有被miR-101顯著增強(qiáng)。這可能是與細(xì)胞株的生物學(xué)行為區(qū)別、藥物敏感度差異及藥物作用機(jī)制不同等原因相關(guān)，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究證實(shí)，miR-101在結(jié)腸癌組織中表達(dá)降低，上調(diào)miR-101的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具有抑制增殖和降低侵襲能力的作用，還能夠增強(qiáng)5-FU和順鉑對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29的殺傷作用。筆者推測(cè)，miR-101可能成為結(jié)腸癌治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

［1］Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012［J］.CACancerJClin，2015，65（2）:87-108.

［2］Barteild P.MicroRNAs:genomics，biogen esis，mechanism，andfunction［J］.Cell，2004，2:281-297.

［3］LiuDR，GuanQL，GaoMT，etal.miR-1260b is apotential prognosticbiomarkerincolorectalcancer［J］.MedSciMonit，2016，22:2417-2423.

［4］Luo Q，Zhang Z，Dai Z，et al.Tumor-sup pressive microRNA-195-5p regulates cell growth and inhibits cell cycle by targeting cyclin dependent kinase 8 in colon cancer［J］.AmJTransl Res，2016，8（5）:2088-2096.

［5］Li JT，Jia LT，Liu NN，et al.MiRNA-101 inhibitsbreast cancer growthand metastasis by targeting CX chemokine receptor 7［J］.Oncotarget，2015，6（31）:30818-30830.

［6］LvP，ZhangP，LiX，etal.Microribonucleic acid（RNA）-101 inhibits cell proliferation and invasion of lung cancer by regulating cyclooxygenase-2［J］.ThoracCancer，2015，6:778-784.

［7］ZhengHB，ZhengXG，LiuBP.miRNA-101 inhibitsovariancancercellsproliferationand invasionbydown-regulatingexpressionofSOCS-2［J］.IntJClinExpMed，2015，8（11）:20263-20270.

［8］WangHJ，RuanHJ，HeXJ，etal.MicroRNA-101 is down-regulatedingastriccancerandinvolved in cell migration and invasion［J］. Eur J Cancer，2010，46（12）:2295-2303.

［9］Thind A，Wilson C.Exosomal miRNAs as cancer biomarkers and therapeutic targets［J］.JExtracell Vesicles，2016，5:31292.

［10］TangJT，WangJL，DuW，et al.MicroRNA 345，amethylation-sensitivemicroRNAis involved in cell proliferation and invasion in human colorectal cancer［J］.Carcinogenesis，2011，32（8）:1207-1215.

［11］EykingA，ReisH，F(xiàn)rankM，etal.MiR-205 and miR-373 are associated with aggressive human mucinous colorectal cancer［J］.PLoS One，2016，11（6）:e0156871.

［12］LongY，WuZ，YangX，etal.MicroRNA-101 inhibitstheproliferationandinvasionofbladder cancer cells via targeting c-FOS［J］.Mol MedRep，2016，14（3）:2651-2656.

［13］Lei Q，Liu X，F(xiàn)uH，et al.miR-101reverses hypomethylation of the PRDM16 promoter to disrupt mitochondrial function in as trocytoma cells［J］.Oncotarget，2016，7（4）: 5007-5022.

［14］Goto Y，Kurozumi A，Nohata N，et al.The microRNA signature of patientswithsunitinibfailure:regulationofUHRF1pathways by microRNA-101 in renal cell carcinoma［J］.Oncotarget，2016.［Epubaheadofprint］.

［15］LiuY，GaoS，ChenX，etal.Overexpression of miR-203 sensitizes paclitaxel（Taxol）-resistant colorectal cancer cells through target ingthesalt-induciblekinase2（SIK2）［J］.Tumour Biol，2016.［Epub ahead of print］.

［16］Hu Y，Qiu Y，Yagüe E，et al.miRNA-205 targets VEGFA and FGF2 and regulates resistance to chemotherapeutics in breast cancer［J］.CellDeathDis，2016，7（6）:e2291.

［17］ZhuM，ZhouX，DuY，et al.miR-20a induces cisplatin resistance of a human gastric cancercelllineviatargetingCYLD［J］.Mol Med Rep，2016，14（2）:1742-1750.

（本文編輯：陳志翔）

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.09.046

R363

A

1671-0800（2016）09-1215-03

310014杭州，浙江省人民醫(yī)院

崔盈，Email：ing313 @126.com

2016-03-01