胃癌組織核轉錄因子κB p65蛋白表達與腫瘤多藥耐藥性的關系

李 勇，耿建磊，檀碧波，范立僑，趙 群，劉 羽，劉慶偉

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胃癌組織核轉錄因子κB p65蛋白表達與腫瘤多藥耐藥性的關系

李 勇，耿建磊，檀碧波，范立僑，趙 群，劉 羽，劉慶偉

【摘要】目的分析胃癌組織中核轉錄因子κB(NF-κB)p65蛋白表達與腫瘤多藥耐藥性(MDR)的關系，并探討其意義。方法選取2013年1—12月在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院外三科手術切除并經(jīng)病理證實的68例胃癌患者的腫瘤組織及癌旁組織。采用免疫組化(SP)法檢測胃癌組織及癌旁組織NF-κB p65、P-gp、Bcl-2、Bax蛋白表達；采用體外藥物敏感實驗(MTT法)檢測胃癌組織細胞對氟尿嘧啶(5-FU)、長春新堿(VCR)、紫杉醇(PTX)、奧沙利鉑(L-OHP)、表阿霉素(eADM)的體外化療藥物敏感性。結果胃癌組織NF-κB p65、P-gp、Bcl-2蛋白強表達率均高于癌旁組織，Bax蛋白強表達率低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Spearman相關分析結果顯示，胃癌組織NF-κB p65與P-gp蛋白表達呈正相關(rs=0.321，P=0.008)，NF-κB p65與Bax蛋白表達呈負相關(rs=-0.333，P=0.006)，NF-κB p65與Bcl-2蛋白表達無直線相關關系(rs=0.231，P=0.058)。在胃癌組織中，5-FU、PTX對NF-κB p65強表達者腫瘤細胞抑制率低于弱表達者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；5-FU、PTX、L-OHP對P-gp強表達者腫瘤細胞抑制率低于弱表達者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；5-FU、PTX、eADM對Bcl-2強表達者腫瘤細胞抑制率低于弱表達者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；5-FU、L-OHP、eADM對Bax強表達者腫瘤細胞抑制率高于弱表達者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論胃癌組織中NF-κB p65表達增高，其可能通過調控P-gp、Bax蛋白表達而參與胃癌MDR。

化療是胃癌綜合治療的重要措施之一，但目前常用的化療方案效果均不能令人滿意，主要是由于胃癌細胞存在較強的多藥耐藥性(multidrugs resistance，MDR)[1-2]。闡明胃癌MDR的機制并進行逆轉可能提高化療效果、改善預后。但迄今關于胃癌MDR的機制還不完全明確。核轉錄因子кB(NF-κB)是轉錄因子蛋白家族，作為信號通路，NF-κB可調控多個下游基因表達，NF-κB p65蛋白是其中的重要成員[3-5]。有關NF-κB p65蛋白在胃癌MDR中作用的報道還不多見。為了解NF-κB p65蛋白在胃癌組織中表達情況及與胃癌MDR的關系，本研究檢測了NF-κB p65蛋白及胃癌MDR相關的P-糖蛋白(P-gp)、Bcl-2、Bax的表達情況，同時應用噻唑藍(MTT)方法檢測了腫瘤細胞的體外化療敏感性，進一步對NF-κB p65蛋白與胃癌MDR因子和化療敏感性的關系進行分析，為探討NF-κB p65蛋白在胃癌MDR中發(fā)揮的作用提供了依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑兔抗人NF-κB p65單克隆抗體為美國Bioworld Technology公司產品，兔抗人P-gp、Bcl-2、Bax多克隆抗體為美國Santa Cruz公司產品，免疫組化試劑盒購自美國ZYMED公司。RPMI 1640培養(yǎng)基、MTT、胰蛋白酶為美國Gibico公司產品。氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)為上海旭東海普公司產品，長春新堿(Vincristine，VCR)、紫杉醇(Paclitaxel，PTX)、表阿霉素(Epidoxorubicin，eADM)為浙江海正藥業(yè)公司產品，奧沙利鉑(Oxaliplatin，L-OHP)為江蘇恒瑞藥業(yè)公司產品。

1.1.2標本來源及處理標本來源于2013年1—12月在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院外三科手術切除并經(jīng)病理證實的68例胃癌患者的腫瘤組織。68例患者中男38例，女30例；年齡42～77歲，中位年齡65歲。排除復發(fā)胃癌、合并其他惡性腫瘤及術前應用過放化療者。術中標本離體后取新鮮腫瘤組織1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm置入RPMI 1640培養(yǎng)液保存，在離體1 h內由專人進行研磨分散，準備用于化療藥物敏感實驗。另取標本一份經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片后用于免疫組化(SP)染色。同時取癌旁組織一份(1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm)，距腫瘤邊緣≥3 cm，術后鏡下證實無癌細胞，4%多聚甲醛溶液固定進行SP法染色。

1.2實驗方法

1.2.1SP法檢測NF-κB p65、P-gp、Bcl-2、Bax蛋白表達采用SP法對腫瘤石蠟組織進行染色，嚴格按照試劑盒說明進行染色操作。用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片作為陽性對照。由2位病理專業(yè)人員分別閱片進行結果判斷。切片隨機取5個(×400)高倍視野，每視野計數(shù)100個細胞，NF-κB p65以細胞核著染呈棕黃色為染色陽性，P-gp、Bcl-2、Bax以細胞膜和/或細胞質著染呈棕黃色為染色陽性，按腫瘤細胞著色強度和陽性細胞率分別進行計分。著色強度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；腫瘤細胞陽性細胞率計分標準：陽性細胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分；兩種計分標準所得分值的乘積為0或1分表示陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～7分為陽性(++)，≥8分為強陽性(+++)。表達強度標準：≤3分為弱表達，≥4分為強表達。

1.2.2體外藥物敏感實驗(MTT法)腫瘤組織經(jīng)研磨分散，無菌條件下，用0.9%氯化鈉溶液漂洗組織2次，剪碎，放入0.25%胰蛋白酶消化液。細胞消化液經(jīng)200目細胞篩過濾，制成單細胞懸液。用已配置的RPMI 1640完全培養(yǎng)液配制成單個細胞懸液；經(jīng)苔盼藍染色計數(shù)活細胞，用完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為5×105/ml接種于96孔板，100 μl/孔(含5×104個細胞)。使用前將腫瘤藥敏檢測板和DMEM培養(yǎng)基預溫至37 ℃。將5種受試藥物分別加入腫瘤細胞懸液中，分別為5-FU 10 μg/ml、VCR 0.5 μg/ml、PTX 10 μg/ml、L-OHP 20 μg/ml、eADM 0.4 μg/ml[6]。空白組加入磷酸鹽緩沖液(PBS)作為對照。接種細胞懸液200 μl/孔，微量振蕩器振蕩混勻，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加MTT(5 mg/ml)20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)3～24 h，依據(jù)顯微鏡下觀察MTT還原形成藍色針狀結晶終止培養(yǎng)。將細胞培養(yǎng)板以1 000 r/min離心10 min，棄上清液，吸水紙吸去殘留液體。加入DMSO 100 μl/孔，輕輕振蕩混勻，酶標儀570 nm測各孔吸光度(A)值。腫瘤細胞平均抑制率(IR)=(1-給藥孔平均A值)/對照孔平均A值×100%。

2結果

2.1胃癌組織NF-κB p65、P-gp、Bcl-2及Bax蛋白表達情況胃癌組織NF-κB p65、P-gp、Bcl-2蛋白強表達率均高于癌旁組織，Bax蛋白強表達率低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2胃癌組織NF-κB p65、P-gp、Bcl-2、Bax蛋白表達的關系Spearman相關分析結果顯示，胃癌組織NF-κB p65與P-gp蛋白表達呈正相關(rs=0.321，P=0.008)，NF-κB p65與Bax蛋白表達呈負相關(rs=-0.333，P=0.006)，Bcl-2與Bax蛋白表達呈負相關(rs=-0.401，P=0.001)，NF-κB p65與Bcl-2、P-gp與Bax蛋白表達無明顯相關關系(rs=0.231，P=0.058；rs=-0.196，P=0.108)。

2.3胃癌組織NF-κB p65、P-gp、Bcl-2、Bax蛋白表達與化療藥物敏感性的關系在胃癌組織中，5-FU、PTX對NF-κB p65強表達者腫瘤細胞抑制率低于弱表達者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；5-FU、PTX、L-OHP對P-gp強表達者腫瘤細胞抑制率低于弱表達者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；5-FU、PTX、eADM對Bcl-2強表達者腫瘤細胞抑制率低于弱表達者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；5-FU、eADM、L-OHP對Bax強表達者腫瘤細胞抑制率高于弱表達者(P<0.05，見表2)。

3討論

研究證明胃癌細胞對不同作用機制的化療藥物存在明顯抵抗作用，稱為MDR[7]。胃癌細胞的這種特性是導致化療失敗的直接原因，也是胃癌患者復發(fā)轉移及死亡的重要因素。胃癌MDR是多種相關基因及信號通路相互調控、共同作用的結果[8]。胃癌MDR的作用機制復雜，但迄今尚未發(fā)現(xiàn)其中的關鍵調控分子，因而胃癌MDR逆轉的研究也尚未取得突破性進展。NF-κB是具有廣泛作用的真核細胞轉錄調節(jié)因子家族，參與細胞的多種生理病理過程。NF-κB p65蛋白是NF-κB家族中重要成員，研究發(fā)現(xiàn)NF-κB p65蛋白在多種惡性腫瘤中存在表達增高現(xiàn)象，并參與多種腫瘤的MDR[9-11]。本研究結果也顯示，NF-κB p65蛋白在胃癌組織中表達高于癌旁組織，且5-FU、PTX對NF-κB p65蛋白強表達者腫瘤細胞的抑制率明顯低于弱表達者，提示NF-κB p65蛋白可能參與了胃癌發(fā)生，并且NF-κB p65蛋白強表達時胃癌細胞對5-FU、PTX的敏感性降低，參與了胃癌MDR。但本研究也發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞對VCR、L-OHP、eADM的敏感性與NF-κB p65蛋白表達無關，提示NF-κB p65蛋白可能僅參與了部分化療藥物的耐藥調控，但具體情況還應擴大研究規(guī)模并進行實驗予以證實。

為了解NF-κB p65蛋白參與胃癌MDR的可能機制，本研究進一步檢測了胃癌MDR相關蛋白P-gp、Bcl-2、Bax的表達，分析了其與NF-κB p65蛋白的關系。P-gp是經(jīng)典MDR的重要蛋白，與VCR、VP-16等植物化療藥的耐藥有關。P-gp的主要功能是將進入腫瘤細胞的藥物以主動轉運(藥泵)的方式排出細胞外，從而導致藥物的效果降低[12]。本研究結果顯示，P-gp在胃癌組織中表達高于癌旁組織，P-gp表達增高時胃癌細胞對5-FU、PTX、L-OHP的耐藥性增強。與本課題組前期研究結果符合[1]。本研究結果亦顯示，胃癌組織NF-κB p65蛋白與P-gp蛋白表達呈正相關，提示NF-κB p65可能通過促進P-gp表達而參與胃癌MDR。Bcl-2是細胞中線粒體途徑的凋亡抑制基因，具有通過增強細胞的凋亡抵抗能力而導致腫瘤細胞耐藥的作用[13]。而Bax則具有促進細胞凋亡的作用，可與Bcl-2結合成Bcl-2/Bax二聚體而發(fā)揮作用，Bcl-2與Bax的比值決定了細胞凋亡水平的改變[14]。本研究結果顯示，胃癌組織較癌旁組織Bcl-2表達增高、Bax表達降低，提示胃癌細胞具有較強的凋亡抵抗能力，這是胃癌MDR的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2強表達與5-FU、PTX、eADM的耐藥性有關，而Bax強表達則與5-FU、L-OHP、eADM的耐藥性有關。進一步研究發(fā)現(xiàn)NF-κB p65蛋白與Bax蛋白表達呈負相關，提示NF-κB p65蛋白可能具有抑制Bax表達的作用，是其參與胃癌MDR的另一機制。

表1　胃癌組織與癌旁組織NF-κB p65、P-gp、Bcl-2及Bax蛋白表達比較〔n(%)〕

注：NF-κB p65=核轉錄因子кB p65，P-gp=P-糖蛋白

Table 2Comparison of inhibition rate of chemotherapy drugs between gastric cancer tissues with weak expression of NF-κB p65，P-gp，Bcl-2 and Bax and tissues with strong expression

蛋白表達例數(shù)化療藥物抑制率5-FU VCR PTX eADM L-OHP蛋白表達例數(shù)化療藥物抑制率5-FU VCR PTX eADM L-OHPNF-κBp65Bcl-2 弱表達3135.38±7.4331.83±9.9442.68±11.4626.84±7.3239.34±6.26 弱表達3236.75±10.2633.80±9.4145.07±11.2932.82±6.2537.63±7.36 強表達3731.27±8.7632.95±10.6835.62±9.8925.42±8.3737.38±7.21 強表達3631.64±9.7331.02±7.4638.16±8.2724.60±5.9135.62±5.38 t值2.063-0.4442.7270.7371.185 t值2.1071.3572.9015.5721.295 P值0.043 0.6580.0080.4640.240 P值0.0390.1790.005<0.0010.200P-gpBax 弱表達2834.68±6.1833.42±6.7343.24±10.2629.61±8.3640.63±8.32 弱表達5130.84±8.5431.44±7.3338.91±9.2324.18±6.1630.34±6.82 強表達4028.42±7.2230.43±9.2234.36±8.9326.82±7.0834.32±7.94 強表達1738.39±7.3233.16±6.5343.64±6.3832.21±8.8238.14±9.37 t值3.7291.4633.7951.4843.162 t值-3.263-0.860-1.958-4.156-3.705 P值<0.0010.148<0.0010.1430.002 P值0.0020.3930.054<0.001<0.001

注：5-FU=氟尿嘧啶，VCR=長春新堿，PTX=紫杉醇，eADM=表阿霉素，L-OHP=奧沙利鉑

本研究發(fā)現(xiàn)NF-κB p65蛋白在胃癌組織中表達增高，可能通過調控P-gp、Bax表達而參與胃癌MDR。但本研究僅對數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計分析，所得結論多為推測而來。進一步研究中準備應用NF-κB通路阻斷劑及基因干擾技術對胃癌細胞中NF-κB通路進行干預，對干預后腫瘤細胞MDR特性的改變及機制進行深入研究，以發(fā)現(xiàn)NF-κB參與腫瘤MDR的確切機制。

多藥耐藥性(MDR)

腫瘤MDR并非多重耐藥。MDR是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥產生耐藥性的同時，對其他結構不同、作用靶點相異的抗腫瘤藥也產生交叉性耐藥的現(xiàn)象。MDR包括原發(fā)性(先天性)耐藥(natural MDR)和繼發(fā)性耐藥(acquired MDR)：原發(fā)性耐藥是腫瘤細胞固有的對化療藥物不敏感，故首次使用化療藥物就產生耐藥；繼發(fā)性耐藥指腫瘤初始對化療藥物敏感，但經(jīng)過化療藥物作用后產生的MDR現(xiàn)象。

作者貢獻：李勇進行試驗設計與實施、資料收集整理、研究質量控制、撰寫論文、成文并對文章負責；耿建磊、檀碧波、范立僑、趙群、劉羽、劉慶偉進行了資料收集、實驗實施及結果分析、統(tǒng)計處理等工作。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：賈萌萌)

·用藥分析·

【關鍵詞】胃腫瘤；多藥耐藥相關蛋白質類；核轉錄因子κB

李勇，耿建磊，檀碧波，等.胃癌組織核轉錄因子κB p65蛋白表達與腫瘤多藥耐藥性的關系[J].中國全科醫(yī)學，2016，19(2)：238-241.[www.chinagp.net]

Li Y，Geng JL，Tan BB，et al.Relationship between the protein expression of nuclear transcription factors κB p65 and multidrug resistance in gastric cancer[J].Chinese General Practice，2016，19(2)：238-241.

Relationship Between the Protein Expression of Nuclear Transcription Factors κB p65 and Multidrug Resistance in Gastric CancerLIYong，GENGJian-lei，TANBi-bo，etal.ThirdDepartmentofGeneralSurgery，theFourthAffiliatedHospital，HebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050011，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between the protein expression of gastric cancer tissue nuclear transcription factors κB(NF-κB)p65 and the multidrug resistance(MDR)of tumor and explore its significance.MethodsWe collected the tumor tissue and para-carcinoma tissue of 68 patients who were pathologically diagnosed with gastric carcinoma and underwent excision surgery in the Third Department of General Surgery of the Fourth Affiliated Hospital，Hebei Medical University from January 2013 to December 2013.Using immunohistochemical SP method，the protein expression levels of NF-κB p65，P-gp，Bcl-2 and Bax in the collected tissues were detected.Using MTT method，the sensitivity of gastric cancer cells towards 5-FU，VCR，PTX，L-OHP and eADM was measured.ResultsThe strong expression incidence of NF-κB p65，P-gp，Bcl-2 proteins in cancer tissues was higher than that in para-carcinoma tissues，while Bax protein in cancer tissues was lower than that in para-cancer tissues(P<0.05).Spearman correlation analysis showed that positive relationship was found between the expression levels of NF-κB p65 and P-gp(rs=0.321，P=0.008)；expression of NF-κB p65 and that of Bax had negative correlation(rs=-0.333，P=0.006)，and the expression of NF-κB p65 had no significant correlation with that of Bcl-2(rs=0.231，P=0.058).In gastric cancer tissues with strong expression of NF-κB p65，the inhibition rates of 5-FU and PTX for cancer cells were lower than those tissues with weak expression of NF-κB p65(P<0.05)；in tissues with strong expression of P-gp，the inhibition rates of 5-FU，PTX and L-OHP for cancer cells were lower than tissues with weak expression of P-gp(P<0.05)；inhibition rates of 5-FU，PTX，eADM to cancer cells were lower in tissues with strong expression of Bcl-2 than tissues with weak expression of Bcl-2(P<0.05)，whereas in tissues with strong expression of Bax，inhibition rates of 5-FU，L-OHP and eADM to cancer cells were higher than tissues with weak expression of Bax(P<0.05).ConclusionGastric cancer tissues have higher expression of NF-κB p65 which might be involved in MDR of gastric cancer by regulating P-gp and Bax proteins.

【Key words】Stomach neoplasms；Multidrug resistance-associated proteins；NF-κB

收稿日期：(2015-07-21；修回日期：2015-11-06)

【中圖分類號】R 735.2

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.02.024

通信作者：李勇，050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院外三科；E-mail：liyonghbth@126.com

基金項目：作者單位：050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院外三科(李勇，檀碧波，范立僑，趙群，劉羽，劉慶偉)；河北省兒童醫(yī)院普外科(耿建磊)