FTC-CD133納米微粒抑制肝癌干細胞耐藥性的研究

黃長文，蔣星星，殷香保，黃躍英，雷 康，熊 虎

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FTC-CD133納米微粒抑制肝癌干細胞耐藥性的研究

黃長文，蔣星星，殷香保，黃躍英，雷 康，熊 虎

【摘要】目的制備包裹乳腺癌耐藥蛋白(BCRP/ABCG2)多藥轉(zhuǎn)運體的特異抑制劑FTC且連接CD133抗體的納米微粒，并評價其特性和治療作用。方法運用復(fù)乳蒸發(fā)法制備以聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)為載體的包封FTC的載藥納米微粒，通過碳化二亞胺法在其表面連接CD133抗體，得到納米微粒FTC-PLGA-NP-C；分析制備得到的納米微粒的粒徑分布、FTC包封率、載藥量和納米微粒的抗體連接效率；免疫磁珠法分選出細胞，MTT法檢測細胞的增殖能力，Western blotting檢測SP細胞中ABCG2的表達；熒光顯微鏡下觀察FTC-PLGA-NP-C與細胞的結(jié)合效率；將細胞加入不同濃度的FTC-PLGA-NP-C納米微粒，Western blotting檢測其ABCG2的表達；以同體積PBS為對照，在細胞中加入FTC-PLGA-NP-C納米微粒，同時加入阿霉素，HPLC檢測孵育不同時間后細胞內(nèi)阿霉素的濃度。裸鼠腋下荷瘤，成瘤后尾靜脈注射FTC-PLGA-NP-C或者0.9%氯化鈉溶液，48 h后再由尾靜脈注射阿霉素，測量瘤體直徑，并采用高效液相色譜法檢測裸鼠腫瘤組織中阿霉素的濃度。結(jié)果FTC-PLGA-NP-C呈規(guī)則球形，粒徑分布為60～120 nm，載藥量為11.27%，包封率為37.18%，與細胞有較好的結(jié)合能力；Western blotting檢測顯示ABCG2在細胞中表達，且隨著FTC-PLGA-NP-C納米微粒劑量的增加，ABCG2的表達量逐漸降低，到4 mg/ml FTC-PLGA-NP-C時已幾乎檢測不到ABCG2的表達。從24 h開始，PBS中細胞內(nèi)阿霉素濃度很快下降至1 μg/ml及以下；而FTC-PLGA-NP-C中細胞內(nèi)阿霉素濃度一直維持在2～3 μg/ml。生理鹽水組小鼠瘤體直徑為(1.845±0.076)cm，高于FTC-PLGA-NP-C組的(1.238±0.072)cm(t=5.802，P<0.001)；生理鹽水組瘤內(nèi)阿霉素濃度為(2.005±0.154)μg/ml，低于FTC-PLGA-NP-C組的(3.853±0.261)μg/ml(t=6.088，P<0.001)。結(jié)論制備的載藥納米微粒FTC-PLGA-NP-C可較好地靶向肝癌干細胞，并抑制其耐藥蛋白ABCG2的表達，降低腫瘤細胞對常規(guī)治療藥物的耐藥性，提高化療藥物的治療效果。

腫瘤是一種嚴重危害人類健康的疾病。化學(xué)藥物治療是目前常用的治療手段。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中存在含量極少但具有無限增殖潛能的腫瘤干細胞，這些細胞具有高致瘤性，是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的根源[1]。有學(xué)者通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，某些化療藥物可以殺死腫瘤細胞，但對腫瘤干細胞卻無效[2-3]，這就決定了腫瘤復(fù)發(fā)的必然性。因此，只有探索殺滅腫瘤干細胞的治療方式，才能最終徹底治愈腫瘤。

ABCG2(ATP-binding cassette superfamily G member 2)是ABC轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette)家族中的成員，主要存在于干細胞、某些腫瘤細胞和上皮細胞的頂膜，是具有廣泛底物作用的特異性外排泵，在SP細胞中呈高表達，還可使進入細胞中的藥物被排出胞外，故該功能被認為參與了腫瘤細胞的多藥耐藥性[5-6]。

本研究擬應(yīng)用包裹乳腺癌耐藥蛋白(BCRP/ABCG2)多藥轉(zhuǎn)運體的特異抑制劑FTC(fumitremorgin C)且連接CD133抗體的納米微粒，通過其特異性作用于肝癌SP細胞，使納米微粒中FTC在SP細胞中高效、持續(xù)發(fā)揮作用，有效逆轉(zhuǎn)SP細胞的耐藥性，進而使普通化療藥物(如阿霉素)更容易進入SP細胞并大量蓄積。這種直接以腫瘤干細胞為靶向，并且針對腫瘤干細胞耐藥性的治療思路或許能尋找到徹底治愈腫瘤的突破口。

1材料與方法

1.1試劑與動物阿霉素(Adriamycin，ADM)，購自意大利Farmitalia公司；FTC，購自上海博升生物科技有限公司；聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)，購自濟南岱罡生物科技有限公司；碳化二亞胺(EDC)，購自美國Pierce公司；Micro BCA蛋白質(zhì)定量試劑，購自美國Pierce公司；離心機，Eppendorf 5810R式，德國Eppendorf公司；流式細胞儀，BD FACSCalibur，美國BD公司；Zeta分析儀，英國Malvern公司；酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司；熒光顯微鏡，日本Olympus公司；Chemidoc XRS凝膠成像儀，美國Alpha公司；人肝癌細胞株MHCC97-H，本實驗室培養(yǎng)保存；裸鼠，購自北京華阜康生物科技有限公司。

1.2包裹FTC且連接CD133抗體納米微粒的制備將適量FTC溶液在超聲條件下加入PLGA二氯甲烷溶液中，在所得溶液中加入少量Tween 80與Span 80混合乳化劑(Tween 80∶Span 80=5∶1)，超聲5 min使之成為均一穩(wěn)定的初乳液。將所得初乳液在超聲條件下滴加到50 ml O-羧甲基殼聚糖水溶液中，超聲10 min形成復(fù)乳液。然后將此復(fù)乳液在室溫下電磁攪拌4 h以上，使有機溶劑完全揮發(fā)，形成FTC-PLGA-NP混懸液。將此混懸液以2 000 r/min離心5 min，離心半徑17.8 cm，取沉淀用蒸餾水離心洗滌3次，除去未包埋藥物，將所得沉淀冷凍干燥即得FTC-PLGA-NP。將CD133抗體通過EDC法(每1 mg FTC-PLGA-NP中加入2 mg CD133抗體)連接在FTC-PLGA-NP上，制備得到納米微粒FTC-PLGA-NP-C。

1.3表征及FTC載藥量、包封率和抗體連接效率

1.3.1微粒表征的檢測將樣品稀釋后取約1 ml加至樣品池中，然后將樣品池放入儀器中進行檢測。

1.3.2FTC載藥量和包封率檢測通過MicroBCA蛋白測定試劑盒測定FTC濃度，嚴格按照說明書進行操作。載藥量(%)=納米粒中藥物重量/納米粒重量×100%；包封率(%)=納米粒中藥物重量/給藥量×100%。

1.3.3CD133連接效率的檢測將樣品稀釋不同倍數(shù)，通過MicroBCA蛋白測定試劑盒測定CD133的連接效率，嚴格按照說明書操作。

1.5MTT法檢測SP細胞的增殖能力將分離得到的SP細胞富集并重懸，調(diào)整細胞濃度為5×104/ml。取96孔板，每孔加細胞懸液200 μl，然后放入37 ℃，5% CO2恒溫箱孵育24 h～1周。加入MTT 15 μl/孔，敲打均勻后放入培養(yǎng)箱中孵育4 h。取出培養(yǎng)板，以2 500 r/min離心25 min，完全棄上清液，加入200 μl DMSO，吹勻后放入酶標(biāo)儀，在630 nm波長下讀取吸光度A50值(OD值)。

1.6Western blotting檢測SP細胞中ABCG2的表達細胞處理完成后提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。采用SDS-PAGE電泳法電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；結(jié)合特異性抗體及相應(yīng)二抗孵育；將PVDF膜放入Chemidoc XRS凝膠成像儀，滴加適量顯影液后獲取樣品蛋白圖像。

1.7FTC-PLGA-NP-C與SP細胞結(jié)合取分離后的SP細胞接種于6孔板中，加入FTC-PLGA-NP-C，使其終濃度為5 g/L。培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)基換成PBS，加入FITC-CD133抗體，避光孵育1 h后在熒光顯微鏡下觀察納米微粒與細胞的結(jié)合效率。

1.9FTC-PLGA-NP-C對瘤體及其耐藥性的影響裸鼠腋下荷瘤。成瘤后尾靜脈注射5 mg/kg的FTC-PLGA-NP-C或者0.9%氯化鈉溶液，48 h后，再由尾靜脈注射阿霉素，測量瘤體直徑；然后將腫瘤研碎制成單細胞懸液，取相同數(shù)量的細胞，破壁后用1 ml PBS懸起，離心后取上清液，高效液相色譜法檢測裸鼠腫瘤組織中阿霉素的濃度。

2結(jié)果

2.1FTC-PLGA-NP-C檢測

2.1.1FTC-PLGA-NP-C的粒徑分布制備得到FTC-PLGA-NP-C，其粒徑分布為60～120 nm，平均粒徑為107 nm(見圖1)。

圖1　FTC-PLGA-NP-C的粒徑分布

2.1.2載藥量和包封率FTC載藥量為11.27%，包封率為37.18%。

2.1.3抗體連接效率通過MicroBCA蛋白測定試劑盒測定CD133的連接效率，結(jié)果顯示該載藥納米微粒表現(xiàn)出對靶抗原良好的免疫結(jié)合活性，其效價與游離抗CD133抗體基本相當(dāng)(見圖2)。

2.1.4FTC-PLGA-NP-C與SP細胞的結(jié)合能力通過熒光顯微鏡觀察納米微粒與SP細胞的結(jié)合能力，結(jié)果顯示，F(xiàn)TC-PLGA-NP-C與SP細胞有較好的結(jié)合能力(見圖3)。

圖2　FTC-PLGA-NP-C中CD133表達

注：A為在綠色熒光下觀察，B為在白光下觀察

圖3FTC-PLGA-NP-C與SP細胞的結(jié)合效率

Figure 3Binding efficiency of FTC-PLGA-NP-C and SP cells

圖5　MTT法檢測細胞的增殖

圖6　ABCG2在細胞中的表達

2.3.1最佳FTC-PLGA-NP-C納米微粒劑量的確定隨著納米微粒劑量的增加，ABCG2的表達量逐漸降低，到4 mg/ml FTC-PLGA-NP-C時已幾乎檢測不到ABCG2的表達(見圖7)。

圖7　不同濃度FTC-PLGA-NP-C對ABCG2表達的影響

Figure 7Effect of different concentrations of FTC-PLGA-NP-C on the expression of ABCG2

圖8　培養(yǎng)不同時間后 SP細胞內(nèi)阿霉素濃度

2.4FTC-PLGA-NP-C對瘤體及其耐藥性的影響生理鹽水組小鼠瘤體直徑為(1.845±0.076)cm，F(xiàn)TC-PLGA-NP-C組小鼠瘤體直徑為(1.238±0.072)cm，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.802，P<0.001)。生理鹽水組瘤內(nèi)阿霉素濃度為(2.005±0.154)μg/ml，F(xiàn)TC-PLGA-NP-C組瘤內(nèi)阿霉素濃度為(3.853±0.261)μg/ml，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.088，P<0.001)。

3討論

腫瘤是人類健康的一大殺手，腫瘤的治療方法和效果也是廣泛關(guān)注的熱點?；瘜W(xué)藥物治療在經(jīng)歷了長期的發(fā)展和完善后，仍然是目前腫瘤治療的主要手段。但長期使用化學(xué)藥物治療存在兩大難題：一是大部分抗腫瘤藥物靶向性差，在殺死腫瘤的同時對正常的組織器官也存在嚴重的損傷；二是長期大量使用化學(xué)藥物治療后，腫瘤細胞會產(chǎn)生耐藥性，即對藥物的殺傷作用不敏感或是將進入細胞的藥物排出胞外，需加大給藥量才能起到抗腫瘤作用。

實驗和臨床均證實，腫瘤對化療藥物有耐藥性主要表現(xiàn)為腫瘤干細胞耐藥。腫瘤干細胞雖然數(shù)量少，但有無限增殖的潛能，同時對化學(xué)藥物具有耐藥性，所以決定了腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的必然性[9-10]。因此，針對腫瘤干細胞的治療方式才是有效的腫瘤治療方案，才能最終徹底治愈腫瘤。

ABCG2是ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族中的一個成員，多藥抗性的產(chǎn)生常常伴隨ABC家族中一個或幾個成員的過表達，特別是ABCG2蛋白的過表達。該轉(zhuǎn)運蛋白是P-糖蛋白，由多藥抗性蛋白1(multidrug resistance protein 1，MDR1)和多藥抗性相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MAP)的基因編碼。研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2是SP細胞主要的ABC轉(zhuǎn)運蛋白，SP細胞通過ABCG2將熒光活性染料Hoechst33342排出細胞外，正是據(jù)于此，SP細胞被鑒定、分離。ABCG2在SP中呈高表達可使進入細胞中的藥物被排出胞外，故該功能被認為參與了腫瘤細胞的多藥耐藥性[21-22]。

綜上所述，本研究合成的FTC-PLGA-NP-C，由于納米微粒良好的靶向作用和ABCG2抑制效果，可明顯削弱肝癌干細胞的耐藥性，提高胞內(nèi)化療藥物的濃度、增強藥物的治療效果，是一種安全有效的新型肝癌靶向治療制劑，具備良好的臨床應(yīng)用前景。

本文鏈接：

作者貢獻：黃長文進行試驗設(shè)計，殷香保進行試驗設(shè)計與實施，黃躍英資料收集整理，蔣星星撰寫論文，黃長文成文并對文章負責(zé)；黃躍英、雷康、熊虎進行實驗實施、評估、資料收集；黃長文進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

參考文獻

[1]Korkaya H，Wicha MS.Selective targeting of cancer stem cells：a new concept in cancer therapeutics[J].BioDrugs，2007，21(5)：299-310.

[2]Reya T，Morrison SJ，Clarke MF，et al.Stem cells，cancer，and cancer stem cells[J].Nature，2001，414(6859)：105-111.

[3]Zhou S，Li F，Xiao J，et al.Isolation and identification of cancer stem cells from human osteosarcom by serum-free three-dimensional culture combined with anticancer drugs[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2010，30(1)：81-84.

[5]Xie C，Pei XT.ABCG2/Bcrp1 transporter as phenotype markets and regulators of side population stem cells[J].Progress in Physiological Sciences，2003，34(1)：57-59.(in Chinese)

謝超，裴雪濤.ABCG2/Bcrp1轉(zhuǎn)運蛋白：側(cè)群干細胞的表型標(biāo)記與功能調(diào)控蛋白[J].生理科學(xué)進展，2003，34(1)：57-59.

[6]Xie J，Jin B，Li DW，et al.ABCG2 regulated by MAPK pathways is associated with cancer progression in laryngeal squamous cell carcinoma[J].Am J Cancer Res，2014，4(6)：698-709.

[7]Zhao X，Ran YL，Yu L，et al.Isolation，cultivation and identification of cancer stem-like cells from human liver cancer tissues[J].Chinese Journal of Cancer Biotherapy，2009，16(5)：436-441.(in Chinese)

趙璇，冉宇靚，遇瓏，等.人肝癌組織中腫瘤干細胞樣細胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J].中國腫瘤生物治療雜志，2009，16(5)：436-441.

[8]Nigavekar SS，Sung LY，Llanes M，et al.3H dendrimer nanoparticle organ/tumor distribution[J].Pharm Res，2004，21(3)：476-483.

[9]Chiba T，Kita K，Zheng YW，et al.Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties[J].Hepatology，2006，44(1)：240-251.

[10]Phesse TJ，Clarke AR.Normal stem cells in cancer prone epithelial tissues[J].Br J Cancer，2009，100(2)：221-227.

[11]Lai DM，Liu T，Huang Y，et al.Identification and characterization of ovarian cancer stem-like cells from primary tumor[J].Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2009，44(12)：936-940.

[12]Kuzmanov A，Hayrabedyan S，Karaivanov M，et al.Basal cell subpopulation as putative human prostate carcinoma stem cells[J].Folia Histochem Cytobiol，2007，45(2)：75-80.

[13]O′Brien CA，Pollett A，Gallinger S，et al.A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice[J].Nature，2007，445(7123)：106-110.

[14]Ma S，Chan KW，Hu L，et al.Identification and characterization of tumorigenic liver cancer stem/progenitor cells[J].Gastroenterology，2007，132(7)：2542-2556.

[15]Yin S，Li J，Hu C，et al.CD133positive hepatocellular carcinoma cells possess high capacity for tumorigenicity[J].Int J Cancer，2007，120(7)：1444-1450.

[16]Zhang H，Li SY.Research progression of CD133as a marker of cancer stem cells[J].Chinese J Cancer，2010，29(3)：243-247.

[17]陳書德，宋文杰，張福琴，等.干細胞表面標(biāo)志物CD133在肝癌組織中的表達及其臨床意義[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2009，30(5)：458-461.

[18]Bari S，Seah KK，Poon Z，et al.Expansion and homing of umbilical cord blood hematopoietic stem and progenitor cells for clinical transplantation[J].Biol Blood Marrow Transplant，2015，21(6)：1008-1019.

[19]Bahnassy AA，Zekri AR，El-Bastawisy A，et al.Circulating tumor and cancer stem cells in hepatitis C virus-associated liver disease[J].World J Gastroenterol，2014，20(48)：18240-18248.

[20]Varna M，Gapihan G，F(xiàn)eugeas JP，et al.Stem cells increase in numbers in perinecrotic areas in human renal cancer[J].Clin Cancer Res，2015，21(4)：916-924.

[21]Basu S，Hertsenberg AJ，F(xiàn)underburgh ML，et al.Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring[J].Sci Transl Med，2014，6(266)：266ra172.

[22]Weiss J，Theile D，Dvorak Z，et al.Interaction potential of the multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor dovitinib with drug transporters and drug metabolising enzymes assessed in vitro[J].Pharmaceutics，2014，6(4)：632-650.

(本文編輯：賈萌萌)

·論著·

【關(guān)鍵詞】納米復(fù)合物；腫瘤干細胞；FTC；CD133；ABCG2

黃長文，蔣星星，殷香保，等.FTC-CD133納米微粒抑制肝癌干細胞耐藥性的研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(2)：184-189.[www.chinagp.net]

Huang CW，Jiang XX，Yin XB，et al.Research of FTC-CD133nanoparticles inhibiting the drug resistance of liver cancer stem cell[J].Chinese General Practice，2016，19(2)：184-189.

Research of FTC-CD133Nanoparticles Inhibiting the Drug Resistance of Liver Cancer Stem CellHUANGChang-wen，JIANGXing-xing，YINXiang-bao，etal.DepartmentofHepatobiliarySurgery，theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity，Nanchang330006，China

【Abstract】ObjectiveTo prepare the nanoparticles packing FTC，a specific inhibitor of multidrug transporter BCRP/ABCG2，and connecting CD133antibody，and to evaluate its features and therapeutic effect.MethodsNanoparticles packing FTC and with PLGA as carrier were prepared using multiple emulsion-solvent evaporation method，and carbodiimide reaction was undertaken to connect CD133antibody on the surface of the nanoparticles，forming the nanoparticles of FTC-PLGA-NP-C；the particle size distribution，F(xiàn)TC encapsulation efficiency，drug loading capacity and the antibody connection efficiency of nanoparticles were analyzed； SP cells were sorted by magnetic activated cell sorting(MACS)，MTT method was used to measure the multiplication capacity of SP cells，and western blotting method was employed to detect the expression of ABCG2 in SP cells；the combination efficiency of FTC-PLGA-NP-C and SP was observed under fluorescence microscope； SP cells were added into nanoparticles of FTC-PLGA-NP-C of different concentrations，and western blotting was used to detect the expression of ABCG2；with PBS of the same volume taken as control，F(xiàn)TC-PLGA-NP-C nanoparticles were added into SP cells with adriamycin added at the same time，and the concentration of adriamycin in the cells was determined by HPLC at different time points of incubation.Tumor was transplanted to the armpit of nude mice，and tail intravenous injection of FTC-PLGA-NP-C or 0.9% sodium chloride solution was undertaken after the formation of tumor；48 hours later，tail intravenous injection of adriamycin was conducted，tumor diameter was measured，and high efficiency liquid chromatography was employed to measure the concentration of adriamycin in the tumor tissue of mude mice.ResultsFTC-PLGA-NP-C was in sphere shape，with a size distribution of 60-120 nm，a drug loading capacity of 11.27% and an encapsulation efficiency of 37.18%，and had a better combining capacity with SP cells；western blotting showed that ABCG2 expression existed in SP cells and decreased with the increase of the dosage of FTC-PLGA-NP-C nanoparticles with no ABCG2 expression detected when the dosage of FTC-PLGA-NP-C was 4 mg/ml.At 24 hours of incubation，the concentration of adriamycin began to decrease quickly to below 1 μg/ml in the SP cells in PBS，while the concentration of adriamycin in the SP cells in FTC-PLGA-NP-C remained at 2-3 μg/ml.The diameter of the mice tumor of normal saline group was(1.845±0.076)cm，higher than(1.238±0.072)cm of FTC-PLGA-NP-C group(t=5.802，P<0.001)；the concentration of adriamycin in the tumor of normal saline group was(2.005±0.154)μg/ml，lower than (1.238±0.072)cm of FTC-PLGA-NP-C group(t=6.088，P<0.001).ConclusionPrepared drug-loading nanoparticle FTC-PLGA-NP-C could effectively target liver cancer stem cells，inhibit the expression of drug resistance protein ABCG2，reduce the drug resistance of tumor cells to conventional drugs and improve the therapeutical effect of chemotherapeutic drug.

【Key words】Nanocomposites；Neoplastic stem cells；FTC；CD133；ABCG2

收稿日期：(2015-10-13；修回日期：2015-12-12)

【中圖分類號】R 730.21

【文獻標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.02.013

通信作者：黃長文，330006 江西省南昌市，南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科；E-mail：hcw02ys@163.com

基金項目：作者單位：330006 江西省南昌市，南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科(黃長文，殷香保，黃躍英，雷康，熊虎)；新余市人民醫(yī)院外科(蔣星星)