全反式維甲酸聯(lián)合LY294002對(duì)食管癌EC1細(xì)胞增殖、遷移及PI3K、MMP-2表達(dá)的影響*

崔會(huì)娟，李　娜，路彥娟，李珊珊，王珍珍，路太英#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052　2)焦作市第二人民醫(yī)院腫瘤科 焦作 454002

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全反式維甲酸聯(lián)合LY294002對(duì)食管癌EC1細(xì)胞增殖、遷移及PI3K、MMP-2表達(dá)的影響*

崔會(huì)娟1)，李娜1)，路彥娟1)，李珊珊1)，王珍珍2)，路太英1)#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 4500522)焦作市第二人民醫(yī)院腫瘤科 焦作 454002

關(guān)鍵詞全反式維甲酸；LY294002；EC1細(xì)胞；PI3K；MMP-2

摘要目的：探討全反式維甲酸(ATRA)、磷脂酰肌醇激酶-3(PI3K)抑制劑LY294002單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)食管癌EC1細(xì)胞增殖、遷移及PI3K和MMP-2表達(dá)的影響。方法：將常規(guī)培養(yǎng)的EC1細(xì)胞隨機(jī)分為ATRA組、LY294002組、ATRA+LY294002組和對(duì)照組4組，采用CCK-8檢測各組細(xì)胞的增殖情況，通過劃痕實(shí)驗(yàn)測定各組細(xì)胞的遷移能力，采用RT-PCR和Western blot方法檢測各組細(xì)胞中PI3K及MMP-3 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：作用24、48和72 h后，ATRA+LY294002組的細(xì)胞增殖抑制率均高于其他2組(P<0.05)；作用24 h后，ATRA+LY294002組細(xì)胞遷移能力均低于其他3組(P<0.05)；作用48 h后，ATRA+LY294002組細(xì)胞PI3K及MMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)量均低于其他3組(P<0.05)。結(jié)論：ATRA聯(lián)合LY294002可協(xié)同抑制EC1細(xì)胞的增殖、遷移和PI3K、MMP-2的表達(dá)，進(jìn)而可能協(xié)同抑制腫瘤血管生成。

AbstractAim: To investigate effects of all-trans retinoic acid(ATRA)，LY294002 alone or combined on proliferation，migration and phosphoinositide 3-kinase(PI3K)，matrix metalloproteinase-2(MMP-2) expressions of EC1 cells in vitro.Methods: The cultured EC1 cells were randomly allocated into four groups: ATRA group, LY294002 group, ATRA plus LY294002 group and control group. The proliferation rate was detected by CCK-8 assay. Wound healing assay was used to observe the migration rate. The mRNA and protein expressions of PI3K and MMP-2 in the cells were detected by RT-PCR and Western blot assay.Results: The cell proliferation inhibition rate of ATRA plus LY294002 was higher than those of the other three groups after 24,48, and 72 h treatment(P<0.05). The migration rate of ATRA plus LY294002 group was lower than those of the other three groups after 24 h treatemnt(P<0.05). The relative expressions of PI3K and MMP-2 mRNA and protein of ATRA plus LY294002 group were lower than those of the other three groups after 48 h treatment(P<0.05).Conclusion: ATRA combined with LY294002 could inhibit EC1 cells′ proliferation, migration and the expressions of PI3K and MMP-2, which may be related to the inhibition of tumor angiogenesis.

研究[1]發(fā)現(xiàn)腫瘤新生血管的生長是惡性腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要因素之一，當(dāng)腫瘤超過2 mm3時(shí)，要維持其生長則需要新生血管或血管生成擬態(tài)(VM)來維持腫瘤細(xì)胞的血液供應(yīng)。另有研究[2-5]表明，在多種實(shí)體腫瘤如侵襲性卵巢癌、炎性乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、喉頭鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)VM的存在。磷脂酰肌醇激酶-3(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)信號(hào)通路在VM形成中有著重要的作用。PI3K及其下游MMPs家族可調(diào)控VM的形成，與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、VM及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解等相關(guān)[6-8]。全反式維甲酸(ATRA)作為重要的誘導(dǎo)分化劑已經(jīng)成功應(yīng)用于臨床，有研究[9-10]發(fā)現(xiàn)ATRA能夠抑制食管癌細(xì)胞的增殖、遷移。該研究通過體外選用ATRA及PI3K抑制劑LY294002作用于食管癌EC1細(xì)胞系，觀察對(duì)細(xì)胞的增殖、遷移以及PI3K、MMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，探索ATRA、LY294002單藥或聯(lián)合作用能否抑制食管癌細(xì)胞VM，為食管癌抗血管治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要藥物和試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、DMSO為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，ATRA(用無水乙醇配制成1 mmol/L的儲(chǔ)備液，4 ℃避光保存)為美國Sigma公司產(chǎn)品，LY294002為碧云天生物科技有限公司產(chǎn)品，CCK-8試劑為日本同仁公司產(chǎn)品；兔抗人PI3K、MMP-2抗體購自美國Abcam公司，TRIzol購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa，PCR試劑購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組EC1細(xì)胞由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院腫瘤實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。EC1細(xì)胞單層貼壁生長于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔日換液，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)傳代的EC1細(xì)胞隨機(jī)分為3組：ATRA組(ATRA終濃度為10 μmol/L)、LY294002組(LY294002終濃度為30 μmol/L)、ATRA+LY294002組，同時(shí)設(shè)對(duì)照組(只含細(xì)胞)。

1.3各組細(xì)胞增殖抑制率的CCK-8法檢測取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為5×104個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μL，待細(xì)胞貼壁后吸去原培養(yǎng)液，按1.2分組培養(yǎng)，每組設(shè)6個(gè)平行孔，分別培養(yǎng)24、48和72 h，每24 h取出一個(gè)培養(yǎng)板，每孔加入CCK-8試劑(5 g/L)10 μL，繼續(xù)孵育2～4 h后，選擇450 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度(OD)值，記錄結(jié)果。然后按[(OD對(duì)照孔-OD實(shí)驗(yàn)孔)/(OD對(duì)照孔-OD空白孔)]×100%公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.4各組細(xì)胞遷移能力的劃痕實(shí)驗(yàn)檢測取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中，每孔加2 mL單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，用無菌槍頭沿細(xì)胞中部劃一條直線，繼續(xù)培養(yǎng)。按1.2分組處理，每組設(shè)6個(gè)平行孔。分別在0、12和24 h拍照，用圖像處理軟件測量劃痕寬度，按(1-實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組)×100%計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.5各組細(xì)胞中PI3K和MMP-2 mRNA表達(dá)的RT-PCR法檢測收集各組培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞(1×106個(gè)/mL)，PBS洗3次，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度法檢測總RNA的純度及濃度，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳測定RNA的完整性。將純度合格的總RNA稀釋成500 μg/L后取1 μL總RNA，按反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR：cDNA模板1 μL，Taq PCR Master Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，用無RNA酶水補(bǔ)足反應(yīng)體系50 μL。PI3K上游引物：5’-GAATCAGAACAATGCCTCCA-3’，下游引物：5’-CTTCACGGTTGCCTACTGGT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為339 bp；MMP-2上游引物：5’-ACTTAGACCGCTTGGCTTCA-3’，下游引物：5’-TCTGGTTCTTGTCCCACTTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為378 bp；GAPDH上游引物：5’-TGATTC CACCCATGGCAAATTCC-3’，下游引物：5’-ACAGCCT TGGCAGCGCCAGTAGA-3’ ，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為504 bp。PI3K、MMP-2和GAPDH擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次；最后再72 ℃延伸10 min。循環(huán)完成后取10 μL PCR產(chǎn)物，10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳后，溴化乙錠紫外燈下觀察并拍照。用Gel Analyzer 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度值分析。以目的條帶與GAPDH條帶灰度值之比作為目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6各組細(xì)胞中PI3K及MMP-2蛋白表達(dá)的Western blot 檢測收集各組培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。配置10%分離膠和5%濃縮膠，上樣，蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入兔抗人PI3K、MMP-2及β-Tublin一抗(均按11 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。次日取出膜片，TBST溶液中洗滌3次，5 min/次，分別加入HRP標(biāo)記的二抗(按12 000稀釋)室溫、水平搖床上孵育1 h，暗室ECL發(fā)光液發(fā)光，顯影、定影并測定。利用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，以目的條帶和β-Tublin條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析比較同一時(shí)間點(diǎn)不同組別細(xì)胞增殖抑制率的差異；應(yīng)用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析比較不同組間遷移能力、PI3K、MMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)量的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1ATRA、LY294002對(duì)EC1細(xì)胞增殖的影響見表1。

表1　各組藥物作用不同

*：與其他2組相比，P均<0.05。

A：對(duì)照組；B：ATRA組；C：LY294002組；D：ATRA+LY294002組。圖1　各組EC1細(xì)胞劃痕后培養(yǎng)24 h的遷移情況(×200)

2.2細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，劃痕后培養(yǎng)24 h，ATRA+LY294002組細(xì)胞遷移能力[(24.63±1.74)%]較對(duì)照組[(74.50±1.06)%]及單藥組[(50.43±1.36)%和(50.36±0.79)%]明顯減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FATRA=105.164，F(xiàn)LY294002=97.670，F(xiàn)交互=73.082；P均<0.001)。

2.3各組細(xì)胞中PI3K和MMP-2 mRNA及蛋白的表達(dá)結(jié)果見圖2、3和表2。

M：Marker；A：對(duì)照組；B：ATRA組；C：LY294002組；D：ATRA+LY294002組。 圖2　各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后PI3K、MMP-2 mRNA表達(dá)的結(jié)果

A：對(duì)照組；B：ATRA組；C：LY294002組；D：ATRA+LY294002組。圖3　各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后PI3K及MMP-2蛋白表達(dá)的結(jié)果

表2　各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后PI3K、MMP-2 mRNA及蛋白的表達(dá)結(jié)果(n=6)

3討論

食管癌是發(fā)病率高、預(yù)后較差的實(shí)體瘤之一。食管癌患者在確診時(shí)多數(shù)已屬于晚期，失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)，目前多采用放療聯(lián)合化療等綜合治療措施來控制疾病，但是其復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率居高不下，成為威脅食管癌患者生存的重要因素之一。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特性，是患者治療失敗以致死亡的重要原因，而腫瘤新生血管的生長則是惡性腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要因素之一。有研究[11]表明短期抗血管內(nèi)皮因子治療，可通過誘導(dǎo)VM的形成來促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，可見靶向VM治療顯得尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)[6-12]腫瘤ECM重塑是VM形成過程中的重要改變，而參與ECM重塑的主要是PI3K信號(hào)通路。該信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞的血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[8]。PI3K是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子，能夠調(diào)控VM，與腫瘤細(xì)胞的遷移、黏附，腫瘤血管生成以及ECM降解等相關(guān)。一些可以形成VM的惡性腫瘤高度表達(dá)PI3K,其上游分子(如VE-cadherin)通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活PI3K，進(jìn)而調(diào)節(jié)膜型-基質(zhì)金屬蛋白酶1(MT1-MMP)的功能，MT1-MMP協(xié)同金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP-2)活化基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)，而激活的MMP-2作為PI3K下游分子，是一種重要的ECM降解酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)中層粘連蛋白5γ2鏈裂解為γ2’和γ2x片段，裂解片段沉積于ECM，參與基質(zhì)重塑及ECM的形成[6-13]。因此應(yīng)用PI3K特異性抑制劑LY294002可以通過抑制PI3K及其下游分子MMP-2的表達(dá)及活性進(jìn)而抑制ECM重塑，減少VM的生成，進(jìn)而影響腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。

ATRA是迄今為止研究最為深入、作用最強(qiáng)的分化誘導(dǎo)劑之一，最初應(yīng)用于白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)分化成熟。有研究[14]表明ATRA能顯著降低膠原Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、纖維結(jié)合素及層粘連蛋白的合成，降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。近來有學(xué)者[15]將ATRA作用于消化道實(shí)體瘤如：食管癌、胃癌、結(jié)腸癌細(xì)胞等，發(fā)現(xiàn)ATRA通過影響B(tài)cl-2/Bax、Survivin等蛋白的表達(dá)，抑制食管癌細(xì)胞的活性及誘導(dǎo)其凋亡。多數(shù)學(xué)者[16-17]研究發(fā)現(xiàn)ATRA能通過PI3K信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，并可抑制VEGF、MMPs等相關(guān)因子的表達(dá)[18-19]，而VEGF亦可通過調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)及活性而影響血管重塑和血管密度[20]。但是ATRA對(duì)可能抑制腫瘤VM生成的相關(guān)分子靶向機(jī)制仍不明。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ATRA和LY294002聯(lián)合作用于EC1細(xì)胞，細(xì)胞增殖抑制率明顯高于各單藥作用及對(duì)照組；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ATRA和LY294002均能降低EC1細(xì)胞的遷移能力，但是兩藥聯(lián)合作用更加明顯；RT-PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示，ATRA和LY294002聯(lián)合應(yīng)用下調(diào)PI3K及MMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)的能力較單藥應(yīng)用更加顯著。

綜上所述，ATRA和LY294002均能夠抑制EC1細(xì)胞的生長，可能與下調(diào)PI3K及MMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)有關(guān)，兩者聯(lián)合應(yīng)用可以下調(diào)PI3K和MMP-2的表達(dá)，協(xié)同抑制PI3K信號(hào)通路，進(jìn)而抑制腫瘤VM，為食管癌的治療帶來一定的希望。

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(2015-04-22收稿責(zé)任編輯趙秋民)

*河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目112102310154

Effect of all-trans retinoic acid combined with LY294002 on proliferation,migration and expressions of PI3K and MMP-2 in EC1cells

CUIHuijuan1)，LINa1)，LUYanjuan1)，LIShanshan1)，WANGZhenzhen2)，LUTaiying1)

1)DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)DepartmentofOncology,theSecondPeople′sHospitalofJiaozuoCity,Jiaozuo454002

Key wordsall-trans retinoic acid；LY294002；EC1 cell；phosphoinositide 3-kinase；matrix metalloproteinase-2

中圖分類號(hào)R735.1

通信作者#，女，1966年9月生，博士，教授，研究方向：惡性腫瘤的臨床綜合治療，E-mail:wanlucying@163.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.001