沉默MACC1的表達對卵巢癌細胞系SKOV-3順鉑化療敏感性的影響*

李　霞，史惠蓉，鄧佑興，張瑞濤

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科；河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室 鄭州 450052

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沉默MACC1的表達對卵巢癌細胞系SKOV-3順鉑化療敏感性的影響*

李霞，史惠蓉#，鄧佑興，張瑞濤

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科；河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室 鄭州 450052

關(guān)鍵詞結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子1；RNA干擾；順鉑敏感性；卵巢癌；SKOV-3細胞

摘要目的：探討沉默結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(MACC1)對卵巢癌上皮性癌細胞SKOV-3順鉑化療敏感性的影響。方法：SKOV-3細胞分為shRNA轉(zhuǎn)染組(重組質(zhì)粒psuper-EGFP-s3轉(zhuǎn)染)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(psuper-EGFP-neo轉(zhuǎn)染)和對照組(未作轉(zhuǎn)染)，采用RT-PCR法和Western blot法檢測各組細胞MACC1 mRNA和蛋白的表達，MTT法檢測細胞對順鉑的耐藥性。結(jié)果：3組SKOV-3細胞MACC1 mRNA和蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，shRNA轉(zhuǎn)染組較未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組下降。shRNA轉(zhuǎn)染組對順鉑的IC50較對照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組下降(P<0.05)。結(jié)論：沉默MACC1的表達能增加卵巢癌SKOV-3細胞對順鉑的敏感性。

AbstractAim: To investigate the relationship of RNA interfering MACC1 and cisplatin sensibility of ovarian cancer cell line SKOV-3.Methods: SKOV-3 cells were divided into 3 groups:shRNA group(recombinant plasmid psuper-EGFP-s3 transfected SKOV-3 cells), empty plasmid transfection group(psuper-EGFP-neo transfected SKOV-3 cells) and control group (non transfected SKOV-3 cells). RT-PCR and Western blot were used to detect the expressions of MACC1 mRNA and protein. IC50of cisplatin in different groups was determined by MTT assay.Results: The expressions of MACC1 mRNA and protein in the 3 groups were significantly different(P<0.05), and those of the shRNA transfection group were lower than those in the control group and empty plasmid group. The shRNA transfection group had lower IC50than the control group and empty plasmid group(P<0.05).Conclusion: The sensitivity of SKOV-3 cells to cisplatin could be enhanced by RNA interfering MACC1 gene.

卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤，患者對化療藥物產(chǎn)生耐藥是限制其臨床療效的主要原因之一。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis-associated in colon cancer 1,MACC1)是Stein等[1]于2009年通過全基因表達分析在結(jié)腸癌原發(fā)和轉(zhuǎn)移灶中發(fā)現(xiàn)的一個與結(jié)腸癌密切相關(guān)的基因。MACC1在胃癌[2]、肺癌[3]、肝細胞癌[4]、胰腺癌[5]和卵巢癌[6]組織中高表達可促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，可作為評價其預(yù)后和轉(zhuǎn)歸的腫瘤標志物。該研究應(yīng)用真核質(zhì)粒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)抑制MACC1基因的表達，探討MACC1基因沉默后對卵巢癌細胞SKOV-3順鉑敏感性的影響。

1材料與方法

1.1主要試劑靶向MACC1基因的重組shRNA質(zhì)粒psuper-EGFP-MACC1和空質(zhì)粒psuper-EGFP-neo由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科實驗室構(gòu)建；感受態(tài)大腸桿菌DH5α、人卵巢癌敏感細胞株SKOV-3由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科實驗室保存。RPMI 1640培養(yǎng)液購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清購自南美Thermo Scientific Hyclone公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；兔抗人MACC1多克隆抗體購自英國Abcam公司；羊抗兔單克隆IgG抗體購自美國LifeSpan BioSciences 公司；兔抗人β-actin單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；MTT購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；增強化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色試劑盒購自美國Advansta公司。

1.2細胞培養(yǎng)SKOV-3細胞在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2條件下，常規(guī)培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中。

1.3細胞分組、轉(zhuǎn)染和篩選轉(zhuǎn)染前24 h，將生長狀態(tài)良好的SKOV-3細胞按1.5×105/孔接種于24孔板，37 ℃、體積分數(shù)5%CO2條件下恒溫培養(yǎng)。次日待細胞70%～80%融合時，將細胞分為shRNA轉(zhuǎn)染組(重組質(zhì)粒psuper-EGFP-s3轉(zhuǎn)染SKOV-3細胞)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(super-EGFP-neo轉(zhuǎn)染細胞)和對照組(未轉(zhuǎn)染的SKOV-3細胞)，每組設(shè)3個復(fù)孔。具體轉(zhuǎn)染步驟嚴格按照轉(zhuǎn)染說明書進行, 用含體積分數(shù)10%胎牛血清的無抗生素RPMI 1640培養(yǎng)液將G418溶液稀釋至800 mmol/L，篩選3周，然后用含體積分數(shù)15%小牛血清的400 mmol/L G418無抗生素RPMI 1640培養(yǎng)液維持培養(yǎng)30 d，挑選細胞克隆集落。

1.4RT-PCR技術(shù)檢測MACC1 mRNA的表達收集轉(zhuǎn)染48 h后的SKOV-3細胞和未轉(zhuǎn)染的SKOV-3細胞，按Trizol Reagent說明書的要求提取各組細胞的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。MACC1基因的上游引物5’-CCT TCGTGGTAATAATGCTTCC-3’，下游引物5’-AGGGCTTCCATTGTATTGAGGT-3’；以磷酸甘油醛脫氫(GAPDH)為內(nèi)參照，上游引物5’-TGAACGG GAAGCTCACTGG-3’，下游引物5’-TCCACCACCCT GTTGCTGTA-3’；引物由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,35個循環(huán)；94 ℃ 延伸4 min, 4 ℃保存。以MACC1/GAPDH比值表示MACC1 mRNA的表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.5Western blot 檢測MACC1蛋白的表達取3組細胞均勻種植于6孔板中，待細胞30%～ 50%融合，用Bio-Rad 蛋白測定試劑盒測定上清中蛋白濃度，并據(jù)此調(diào)整上樣量，保持上樣量一致。配制二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，其中分離膠濃度120 g/L、濃縮膠濃度50 g/L。恒壓120 V 電泳，恒壓45V、90 min轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜。50 g/L脫脂奶粉封閉轉(zhuǎn)印膜2 h，500倍稀釋的兔抗人MACC1 單克隆抗體孵育過夜。用TBS緩沖液低速搖床漂洗2次，每次10 min，然后放入TBST溶液中漂洗10 min。再加入1 000倍稀釋的鼠抗兔IgG，常溫孵育2 h，TBS溶液洗滌2次，每次10 min，最后放入TBST中漂洗10 min。于凝膠成像系統(tǒng)利用ECL化學(xué)發(fā)光試劑曝光，保存圖片。以β-actin作為內(nèi)參，應(yīng)用Quantity One 軟件對各條帶進行灰度分析, 計算MACC1/β-actin比值表示MACC1蛋白的表達水平。實驗重復(fù)3 次。

1.6MTT法檢測SKOV-3細胞對順鉑的耐藥性取對數(shù)生長期的SKOV-3細胞，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，按2×103mL-1接種于96孔板中，置37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后加入終濃度0.000、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 μmol/L的順鉑，每濃度設(shè)3個復(fù)孔。孵育3 h后更換成完全培養(yǎng)基。72 h后每孔加入 5 g/L MTT 20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h后小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，置于搖床上低速振蕩10 min，酶標儀測量490 nm波長處的吸光度(A)值。細胞生長抑制率=(對照組A值-各濃度組A值)/對照組A值×100%，并繪制藥物-劑量反應(yīng)曲線，以Bliss法計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。實驗重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13. 0進行分析，各組細胞MACC1 mRNA和蛋白的表達差異、對順鉑的IC50值的比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2結(jié)果

2.1各組SKOV-3細胞MACC1的mRNA和蛋白表達見表1和圖1、2。

M：Marker；1：shRNA轉(zhuǎn)染組；2：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；3：對照組。圖1　各組細胞MACC1 mRNA表達的RT-PCR法檢測結(jié)果

1：對照組；2：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；3：shRNA轉(zhuǎn)染組。圖2　各組細胞MACC1蛋白表達的Western blot檢測結(jié)果

組別nmRNA蛋白對照組31.00±0.001.00±0.00空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組31.06±0.051.07±0.08shRNA轉(zhuǎn)染組30.88±0.02*0.79±0.03*F11.12010.980P0.0230.008

*:與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和shRNA轉(zhuǎn)染組比較，P<0.05。

2.2各組SKOV-3細胞對順鉑的耐藥情況見表2。

表2　各組SKOV-3細胞對順鉑IC50值　μmol/L

F=26.510，P=0.017;*：與其他2組比較，P<0.05。

3討論

卵巢癌作為一種惡性程度極高的腫瘤，發(fā)病率不斷上升，有70%～80%的患者一經(jīng)確診就已屬于晚期[7]。腫瘤細胞減滅術(shù)加鉑類和紫杉醇為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療已成為當前卵巢癌的標準治療手段，然而由于化療耐藥的存在，5 a生存率僅為30%[7]。因此，探討鉑類化療耐藥機制、尋找特異性強且患者可耐受的治療卵巢癌的有效方法是當前的腫瘤研究熱點之一。順鉑耐藥性產(chǎn)生的確切機制尚不明確，以糖蛋白P-gp、耐藥相關(guān)蛋白、拓撲異構(gòu)酶、蛋白激酶C的活性、細胞解毒功能及DNA損傷修復(fù)能力等分子[8]作為靶點的耐藥逆轉(zhuǎn)研究目前仍存在許多難以克服的問題，因此尋找新的耐藥分子靶點仍是當前研究的重點。

RNAi是一種新興的基因干擾技術(shù)，已經(jīng)用于惡性腫瘤化療耐藥及逆轉(zhuǎn)方面的研究，并成為探索基因功能和耐藥關(guān)系等領(lǐng)域研究的熱點[9]。Wang等[5]發(fā)現(xiàn)MACC1在胰腺癌患者血清中呈高表達，且隨著淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移和腫瘤病理分期的提高而顯著升高，可作為胰腺癌輔助診斷的有用標志物之一；且下調(diào)MACC1的表達增加了胰腺癌細胞系CFPAC-1對吉他西濱的化療敏感性。

作者前期研究[6,10]結(jié)果顯示MACC1的異?？赡軈f(xié)同HGF和C-met參與了卵巢癌的惡性進展。作者還成功構(gòu)建了MACC1特異性shRNA真核表達載體，轉(zhuǎn)染后獲得穩(wěn)定表達該組載體的卵巢癌SKOV-3細胞株。該研究結(jié)果表明，將靶向MACC1基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入卵巢癌SKOV-3細胞，細胞中MACC1的mRNA和蛋白水平均下降；對順鉑的IC50較對照和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞下降。在MACC1基因沉默效果最顯著的細胞株中檢測到MACC1、C-met和MAPK信號通路關(guān)鍵活性蛋白的表達降低，提示MACC1可能通過HGF/C-met和MAPK信號通路參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展[11-12]。而MAPK信號通路在多種惡性腫瘤細胞的增殖、凋亡和化療耐藥產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用，阻斷上述信號通路后不僅能夠抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移，還能逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤細胞的化療耐藥[13-14]。

總之，通過干擾MACC1在卵巢癌SKOV-3細胞的表達，SKOV-3細胞中MACC1的mRNA和蛋白的表達下降，細胞對順鉑的敏感性明顯增高。由此推測，MACC1基因可能在卵巢癌順鉑原發(fā)性耐藥中發(fā)揮重要作用。深入研究MACC1基因在順鉑原發(fā)性耐藥中的機制，有助于加深對卵巢癌順鉑原發(fā)性耐藥的認識，為指導(dǎo)臨床治療提供實驗基礎(chǔ)。

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*河南省重點科技攻關(guān)計劃項目122102310545

Effect of silencing MACC1 gene on cisplatin chemosensibility of ovarian cancer cell line SKOV-3

LIXia,SHIHuirong,DENGYouxing,ZHANGRuitao

Key-DisciplinesLaboratoryofClinical-MedicineofHenan;DepartmentofGynecologyandObstetrics,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsmetastasis-associated in colon cancer 1；RNA interference；cisplatin sensibility；ovarian cancer；SKOV-3 cell

中圖分類號R737.3

通信作者#，女，1956年4月生，博士，教授，研究方向：婦科腫瘤，E-mail:hrshi2011@163.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.023