河南漢族男性原發(fā)性不育與SHBG基因啟動子(TAAAA)n多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性*

溫勝蘭，謝　詩，王志偉，何　諾,李興武,陳　輝

1)鄭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系 鄭州 450052　2)鄭州市中心醫(yī)院檢驗科 鄭州 450007　3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科 鄭州 450052　4)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室 鄭州 450001

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河南漢族男性原發(fā)性不育與SHBG基因啟動子(TAAAA)n多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性*

溫勝蘭1)，謝詩1)，王志偉1)，何諾2),李興武3)#,陳輝4)#

1)鄭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系 鄭州 4500522)鄭州市中心醫(yī)院檢驗科 鄭州 4500073)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科 鄭州 4500524)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室 鄭州 450001

關(guān)鍵詞性激素結(jié)合球蛋白；(TAAAA)n多態(tài)性；男性原發(fā)性不育；河南漢族

摘要目的：探討河南漢族男性原發(fā)性不育與性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)基因啟動子(TAAAA)n多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性。方法：分別收集288例河南漢族男性原發(fā)性不育患者和259例正常男性的精液或血液，酚-氯仿法提取DNA，PCR擴增目的片段，檢測Y染色體微缺失，對無缺失個體進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染及生物測序分析SHBG基因啟動子(TAAAA)n等位基因和基因型。結(jié)果：病例組Y染色體微缺失率為12.15%(35/288)，對照組未檢出。檢測到(TAAAA)五核苷酸5～10次重復(fù)、6個等位基因及20種基因型。病例組與對照組(TAAAA)n多態(tài)性構(gòu)成比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。其中，n=5、6、7、10時，2組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.008)；n=8為保護因素(P=0.002)，n=9為危險因素(P<0.001)；n≥9時增加了原發(fā)性不育的風(fēng)險(P<0.001)。結(jié)論：河南漢族男性原發(fā)性不育與SHBG基因啟動子(TAAAA)n多態(tài)性可能有一定關(guān)聯(lián)性。

AbstractAim: To investigate the association of the (TAAAA)n polymorphism in the sex hormone-binding globulin (SHBG) gene promoter with idiopathic male infertility in Henan Han population.Methods: Semen samples of 288 men with idiopathic infertility and blood samples of 259 normal controls were collected. Genomic DNA was extracted by phenol-chloroform method and target fragment was amplified by PCR. The Y-chromosome microdeletion was examined in all samples.The gene polymorphism was obtained by PAGE, silver staining method, and biological sequencing in the group without Y-chromosome microdeletion.Results: Y-chromosome microdeletion were detected in 12.15%(35/288) infertile men,while not found in controls. Six alleles containing (TAAAA) 5-10 repeats and 20 genotypes were presented in the subjects. The constituent ratio of (TAAAA)n polymorphism between the cases and controls was different(P<0.001).When n=5, 6, 7, 10，there was no significant difference(P>0.008).n=8 was a protective factor(P=0.002),and n=9 was a dangerous factor(P<0.001).n≥9 increased risk of infertility(P<0.001).Conclusion: There may be some correlation between the (TAAAA)n polymorphism in the SHBG gene promoter with idiopathic male infertility.

性激素結(jié)合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)是由肝臟分泌的一種同型二聚體糖蛋白，可與血液循環(huán)中的類固醇激素特異性結(jié)合、轉(zhuǎn)運，調(diào)節(jié)血漿中性激素游離濃度和生物活性[1]。SHBG基因位于17p12-p13，由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成，編碼402個氨基酸多肽，(TAAAA)n重復(fù)序列位于SHBG基因啟動子區(qū)，距離起始密碼約700 bp。該五核苷酸(TAAAA)重復(fù)次數(shù)為6～10次[2]，其多態(tài)性可以反映血液循環(huán)中SHBG水平，進而影響性激素水平，并可能與男性不育有關(guān)。該研究旨在通過檢測河南漢族男性SHBG基因啟動子(TAAAA)n多態(tài)性，探討其與男性原發(fā)性不育的關(guān)系。

1對象與方法

1.1研究對象病例組：收集2013年1月至6月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心及檢驗科門診因不育而就診的288例患者，年齡22～45(32.4±6.4)歲。患者均經(jīng)過至少2次按照WHO公布的標(biāo)準進行的精液常規(guī)分析, 并排除明確病理原因以及服用抗腫瘤藥物等情況，均確診為無精子或少精子病(精子密度<20×106mL-1)。對照組：選取健康且已通過正常途徑生育至少1個孩子的正常男性259例作為對照，年齡24～45(32.8±6.7)歲。2組均為河南漢族人，且均簽署知情同意書。

1.2DNA提取采用常規(guī)酚-氯仿法，從病例組的精液和對照組的血液中提取DNA，-20 ℃保存。

1.3Y染色體微缺失檢測Y染色體長臂遠端AZF區(qū)域微缺失可導(dǎo)致生精障礙，為排除其對男性原發(fā)性不育的影響，首先對病例組和對照組進行Y染色體AZF微缺失檢測。選擇3個Y染色體AZF區(qū)系列標(biāo)簽位點，分別為AZFa區(qū)的SY86、AZFb區(qū)的SY127和AZFc區(qū)的SY254，SRY和ZFY作為內(nèi)對照。引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：上、下游引物各0.5 μmol/L、Taq DNA聚合酶1 U、0.3 mmol/L dNTP、2.5 mmol/L MgCl2、10×PCR Buffer 2.0 μL、DNA模板0.2～0.5 μg，滅菌雙蒸水補足體積。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，59 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳：配制15 g/L的瓊脂糖凝膠，其中加入4 μL染色劑EB，待其凝固，拔掉梳子，置入0.5×TBE緩沖液中。取6 μL PCR擴增產(chǎn)物加樣，于120 V電泳約45 min[3]。紫外燈下觀察并記錄結(jié)果。

表1　Y染色體微缺失檢測引物序列及擴增產(chǎn)物大小

1.4(TAAAA)n多態(tài)性的檢測對檢測無微缺失的樣本進行PCR擴增。引物序列為，正義5’-TC CCAACTACTAAGGAGGCTGAGACA-3’，反義5’-CGCCTCTCAGTTATCTTCCCTTATCC-3’。PCR反應(yīng)體系(16 μL)：DNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L),PCR Mix 8 μL,滅菌雙蒸水補足體積。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性40 s， 59 ℃復(fù)性40 s， 72 ℃延伸40 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物8 μL和2×Loading Buffer等體積混合后，上樣于60 g/L變性聚丙烯酰胺凝膠，于35 W預(yù)電泳30 min，然后30 W電泳2 h，最后用銀染顯色。記錄每一種基因型出現(xiàn)的頻率并進行分析，將不同基因型送至金唯智生物公司進行DNA測序驗證。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用HWE 1.20對樣本進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。STR多態(tài)性檢測以(TAAAA)的重復(fù)次數(shù)n為依據(jù)，以n命名等位基因。采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析，病例組與對照組間(TAAAA)n多態(tài)性構(gòu)成比較、等位基因不同重復(fù)次數(shù)分層組間比較和分割位點分析均采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結(jié)果

2.1Y染色體微缺失檢測結(jié)果見圖1。病例組288例中檢測出Y染色體微缺失35例，缺失率為12.15%；其中，AZFa微缺失3例，AZFb微缺失8例，AZFc微缺失17例，AZFac微缺失1例，AZFbc微缺失6例。對照組未檢測出Y染色體微缺失。

M：Marker；1：AZFc微缺失；2：AZFa微缺失；3：AZFb微缺失；4：AZFac微缺失；5：AZFbc微缺失；6：正常男性；7：正常女性；8：水。圖1　Y染色體微缺失檢測結(jié)果

2.2(TAAAA)n基因型分布在排除了Y染色體微缺失的病例組和對照組中，共檢測到五核苷酸(TAAAA)片段5～10次重復(fù)(即6個等位基因：5、6、7、8、9、10 )和20種基因型(5/5、5/6、5/7、5/8、5/9、6/6、6/7、6/8、6/9、6/10、7/7、7/8、7/9、7/10、8/8、8/9、8/10、9/9、9/10、10/10)，結(jié)果見圖2。對照組人群Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果為，χ2=23.982，P=0.065，具有較好的群體代表性?；蛐?/9、8/8、7/7測序結(jié)果見圖3。

2.3(TAAAA)n多態(tài)性分析病例組與對照組(TAAAA)n多態(tài)性構(gòu)成比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)；其中，n=5、6、7、10時，2組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，n=8為保護因素，n=9為危險因素(表3)；因此，以9次重復(fù)作為分割位點劃分等位基因，將研究對象分為短鏈組(n<9)和長鏈組(n≥9)。n≥9時可增加原發(fā)性不育的風(fēng)險(表4)。

LⅠ、LⅡ：Ladder，從下向上依次表示(TAAAA)重復(fù)次數(shù)為6、7、8、9；1、8：6/6；2：8/8；3、10：7/9；4：7/7；5、6、9：9/9；7：6/8；11：水；12：6/9。圖2　(TAAAA)n多態(tài)性檢測結(jié)果

圖3　基因型9/9(上)、8/8(中)、7/7(下)測序圖

表2　2組(TAAAA)n多態(tài)性構(gòu)成比較

χ2=27.762，P<0.001。

表3　2組各等位基因構(gòu)成比較

α′=0.05/6=0.008。

表4　分割位點法分析結(jié)果

χ2=20.577，P<0.001，OR=1.800，95%CI=1.396～2.320。

3討論

近年來，男性不育困擾著越來越多的適齡夫婦，并給社會帶來了許多負面影響。我國不孕不育癥的發(fā)生率大約為20%，其中男方因素約占30%，主要表現(xiàn)為生精障礙[4]。隨著科學(xué)技術(shù)的進步，基因檢測可能成為發(fā)現(xiàn)病因的主要手段，已證實谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶[5]和細胞色素P4501A1[6]等的基因多態(tài)性嚴重影響了精液質(zhì)量。

SHBG在卵巢、子宮內(nèi)膜、胎盤和睪丸中均有表達，其水平的異常變化和動脈粥樣硬化[7]、代謝綜合征[8]、女性不孕癥[9]等疾病的發(fā)生有關(guān)，近年發(fā)現(xiàn)它與男性不育癥可能也存在關(guān)聯(lián)。Eriksson等[10]以(TAAAA)重復(fù)次數(shù)為連續(xù)參數(shù)進行分析發(fā)現(xiàn)，SHBG聚集水平與(TAAAA)n的n值呈負相關(guān)。Lazaros等[11]發(fā)現(xiàn)正常男性與不育男性相比有較低的SHBG(TAAAA)重復(fù)次數(shù)和較高的精液濃度。Safarinejad等[2]證實，SHBG基因(TAAAA)n多態(tài)性和Asp327Asn多態(tài)性與循環(huán)血液中SHBG的濃度及男性原發(fā)性不育有關(guān)，不育的風(fēng)險隨(TAAAA)n中n值的增大而增加，且n≤8時明顯降低了男性不育的風(fēng)險，n>8時增加了其風(fēng)險。

該研究中作者發(fā)現(xiàn)(TAAAA)n重復(fù)次數(shù)為5～10，共6個等位基因，這與Safarinejad等[2]發(fā)現(xiàn)的重復(fù)6～10次、共5個等位基因略有差異，可能與人種差異和研究樣本量有關(guān)。n=5、6、7、10時，病例組和對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，n=8為保護因素，n=9為危險因素，n≥9時增加了原發(fā)性不育的風(fēng)險?；谠撗芯拷Y(jié)果，作者推測:①SHBG啟動子的轉(zhuǎn)錄活性與(TAAAA)重復(fù)次數(shù)有關(guān)，長鏈組(n≥9)人群循環(huán)血液中SHBG濃度可能降低，從而提高了原發(fā)性不育的風(fēng)險，對于超促排卵的女性[8]和具有正常生育能力男性[9]的研究結(jié)果也呈現(xiàn)類似規(guī)律。②SHBG基因可能與其他影響男性精液質(zhì)量的基因多態(tài)連鎖，也可能與SHBG結(jié)合靶組織的細胞膜受體活性及性激素的生物利用度有關(guān)，故(TAAAA)n與患病風(fēng)險不一定呈嚴格的線性關(guān)系，這一現(xiàn)象在國外學(xué)者類似研究中也有反映：在患糖代謝綜合征的男性人群中,發(fā)現(xiàn)(TAAAA)6等位基因與低血清SHBG水平相關(guān)[12]；在希臘絕經(jīng)后女性中也觀察到，攜帶(TAAAA)8等位基因的個體比攜帶(TAAAA)7等位基因的個體絕經(jīng)年齡明顯增大[13]。

綜上所述，河南漢族男性SHBG基因啟動子(TAAAA)n多態(tài)性與男性原發(fā)性不育可能有一定關(guān)聯(lián)性。應(yīng)該指出的是，該研究樣本規(guī)模不足，檢測對象是特定人群，故存在一定的局限性，仍需要進一步深入研究。

參考文獻

[1]ROSNER W,HRYB DJ,KAHN SM,et al.Interactions of sex hormone-binding globulin with target cells[J].Mol Cell Endocrinol,2010,316(1):79

[2]SAFARINEJAD MR,SHAFIEI N,SAFARINEJAD S.Association of the(TAAAA)n repeat and Asp327Asn polymorphisms in the sex hormone-binding globulin(SHBG)gene with idiopathic male infertility and relation to serum SHBG concentrations[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2011,123(1/2):37

[3]崔元戎.Y染色體微缺失及SHBG基因多態(tài)性與河南漢族人群男性不育的相關(guān)性研究[D].鄭州:鄭州大學(xué),2012.

[4]龔道元,李子萍,莊錫偉,等.男性不育患者精漿對氧磷酶-1活性測定的臨床價值[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2012,32(9):1355

[5]ROSHDY OH,HUSSEIN TM,ZAKARIA NH,et al.Glutathione S-transferase Mu-1 gene polymorphism in Egyptian patients with idiopathic male infertility[J].Andrologia,2015,47(5):587

[6]FANG J,WANG S,WANG H,et al.The cytochrome P4501A1 gene polymorphisms and idiopathic male infertility risk: a meta-analysis[J].Gene,2014,535(2):93

[7]SALTIKI K,STAMATELOPOULOS K,VOIDONIKOLA P,et al.Association of the SHBG gene promoter polymorphism with early markers of atherosclerosis in apparently healthy women[J].Atherosclerosis,2011,219(1):205

[8]WHITE MJ,EREN F,AGIRBASLI D,et al.SHBG gene polymorphism (rs1799941) associates with metabolic syndrome in children and adolescents[J].PLoS One,2015,10(2):e0116915

[9]HATZI E,BOUBA I,GALIDI A,et al.Association of serum and follicular fluid SHBG levels and SHBG (TAAAA)n polymorphism with follicle size in women undergoing ovarian stimulation[J].Gynecol Endocrinol,2011,27(1):27

[10]ERIKSSON AL,LORENTZON M,MELLSTR?M D,et al.SHBG gene promoter polymorphisms in men are associated with serum sex hormone-binding globulin, androgen and androgen metabolite levels, and hip bone mineral density[J].Clin Endocrinol Metab,2006,91(12):5029

[11]LAZAROS L,XITA N,KAPONIS A,et al.Evidence for association of sex hormone-binding globulin and androgen receptor genes with semen quality[J].Andrologia,2008,40(3):186

[12]XITA N,MILIONIS HJ,GALIDI A,et al.The(TAAAA)n polymorphism of the SHBG gene in men with the metabolic syndrome[J].Exp Clin Endocrinol Diabetes,2011,119(2):126

[13]MARKATSELI AE,HATZI E,PAMPORAKI C,et al.Association of the (TAAAA)n repeat polymorphism of SHBG gene with the age at menopause in Greek postmenopausal women[J].Maturitas,2014,78(2):113

*鄭州大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新實驗資助項目2013xjxm097

Association of (TAAAA)n polymorphism in SHBG gene promoter with idiopathic male infertility in Henan Han population

WENShenglan1),XIEShi1),WANGZhiwei1),HENuo2),LIXingwu3),CHENHui4)

1)DepartmentofClinicalMedicine,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)ClinicalLaboratory,ZhengzhouCentralHospital,Zhengzhou4500073)ClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500524)DepartmentofCellBiologyandMedicalGenetics,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordssex hormone-binding globulin;(TAAAA)n polymorphism;idiopathic male infertility;Henan Han population

中圖分類號R394.3

通信作者：#陳輝，女，1968年5月生，博士，副教授，研究方向：遺傳性疾病發(fā)病機制，E-mail：chenhui@zzu.edu.cn；李興武，男，1963年9月生，碩士，主任技師，研究方向：臨床檢驗，E-mail:lllixingwu@163.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.021