胃癌患者癌組織膜聯(lián)蛋白A2的表達(dá)與血清膜聯(lián)蛋白A2及癌胚抗原水平測(cè)定*

張志棟，李　勇，檀碧波，趙　群，焦志凱，趙雪峰，王　冬，劉　羽

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科 石家莊 050011

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胃癌患者癌組織膜聯(lián)蛋白A2的表達(dá)與血清膜聯(lián)蛋白A2及癌胚抗原水平測(cè)定*

張志棟，李勇#，檀碧波，趙群，焦志凱，趙雪峰，王冬，劉羽

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科 石家莊 050011

關(guān)鍵詞胃腫瘤;膜聯(lián)蛋白A2;癌胚抗原

摘要目的：檢測(cè)胃癌患者癌組織中膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2)的表達(dá)和血清ANXA2及癌胚抗原(CEA)水平，并分析其臨床意義。方法：選取胃癌患者65例(淋巴結(jié)陰性16例、淋巴結(jié)陽(yáng)性不伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移40例、淋巴結(jié)陽(yáng)性伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移9例)為觀察組，同時(shí)選取50名健康體檢者為對(duì)照組。采用免疫組化SP法檢測(cè)觀察組患者癌及癌旁組織中ANXA2的表達(dá)。取觀察組患者術(shù)前1 d、術(shù)后1個(gè)月及對(duì)照組血清，采用ELISA法檢測(cè)ANXA2水平，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清CEA水平。結(jié)果：觀察組患者癌組織中ANXA2的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織(P<0.001)；淋巴結(jié)陽(yáng)性不伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者、淋巴結(jié)陽(yáng)性伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者癌組織中ANXA2的陽(yáng)性表達(dá)率高于淋巴結(jié)陰性者(P<0.017)。觀察組術(shù)前血清ANXA2、CEA水平高于對(duì)照組，觀察組中淋巴結(jié)陽(yáng)性伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者血清CEA水平最高(P<0.05)；術(shù)后1個(gè)月觀察組血清ANXA2、CEA水平較術(shù)前降低，與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。觀察組癌組織中ANXA2的陽(yáng)性表達(dá)率與術(shù)前血清ANXA2水平呈正相關(guān)，術(shù)前血清ANXA2與CEA水平也呈正相關(guān)(rS=0.407和0.537，P均<0.001)。結(jié)論：聯(lián)合檢測(cè)血清ANXA2與CEA對(duì)胃癌的病情評(píng)估有重要意義。

AbstractAim: To test the expression of ANXA2 in gastric cancer tissue and ANXA2 and carcinoembryonic antigen(CEA) in serum from patients with gastric cancer.Methods: A total of 65 cases of gastric cancer were recruited as observation group(16 with negative lymph nodes, 40 with positive lymph nodes but without distant metastasis, 9 with positive lymph nodes and distant metastasis), and 50 normal healthy individuals, as control group.Immunohistochemical SP technique was performed to detect the expression of ANXA2 in gastric cancer and normal mucosa tissue.The serum of the observation group was prepared before and after operation, the level of ANXA2 was tested by ELISA, and the level of CEA was tested with electrochemiluminescence immunoassay.Results: The positive expression rate of ANXA2 was higher in gastric cancer tissue than that in normal mucosa tissue(P<0.001), and the expression of ANXA2 in the patients with positive lymph nodes and distant metastasis and the patients with positive lymph nodes but without distant metastasis was higher than that of patients with negative lymph nodes(P<0.017). The levels of preoperative ANXA2 and CEA in serum of observation group were higher than those of control group, and the highest serum CEA level was found in positive lymph nodes with distant metastasis patients(P<0.05). After operation, the levels of serum ANXA2 and CEA of observation group decreased significantly,which had no significant difference with control group(P>0.05). Positive correlation was found between the expression of ANXA2 in tumor tissue and serum level of ANXA2 in observation group(rS=0.407,P<0.001). Positive correlation was found between serum ANXA2 and CEA(rS=0.537,P<0.001).Conclusion: It′s of important significance by testing serum ANXA2 combined with CEA for evaluating the gastric cancer patients′ condition.

胃癌是我國(guó)最常見的消化道惡性腫瘤，由于缺乏特異性癥狀，早期診斷者不足10%[1]。多數(shù)患者就診時(shí)病變已屬進(jìn)展期，多伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，綜合治療效果不理想，預(yù)后較差。目前已將腫瘤標(biāo)志物用于胃癌的診斷和病情監(jiān)測(cè)，如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、CA125、CA199等，但特異性、準(zhǔn)確性都不能令人滿意。為了更好地評(píng)估胃癌患者的嚴(yán)重程度、病情發(fā)展及預(yù)測(cè)腫瘤的復(fù)發(fā)，尋找新的腫瘤標(biāo)志物意義重大。膜聯(lián)蛋白A(annexins A，ANXA)家族是一類廣泛存在于真核細(xì)胞的鈣磷脂結(jié)合蛋白，作用廣泛。ANXA2是其中的重要成員，參與人類細(xì)胞的生理活動(dòng)，且與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。有研究[2-4]表明ANXA2與乳腺癌、肝癌、膽管癌等關(guān)系密切，且與腫瘤的大小、病情的嚴(yán)重程度、腫瘤的分化程度及轉(zhuǎn)移有關(guān)。作者所在的課題組前期研究[5]也發(fā)現(xiàn)ANXA2與胃癌關(guān)系密切，但是ANXA2在胃癌患者血清中的水平及其意義尚不清楚。該研究通過(guò)檢測(cè)胃癌患者血清及癌組織中ANXA2的表達(dá)情況以及血清中CEA水平，進(jìn)一步探討其臨床意義，為胃癌發(fā)病機(jī)制及新型腫瘤標(biāo)志物的探索提供依據(jù)。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選取2013年2月至2014年6月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行手術(shù)治療的胃癌患者65例為觀察組，其中淋巴結(jié)陰性16例、淋巴結(jié)陽(yáng)性不伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移40例、淋巴結(jié)陽(yáng)性伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移9例，均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)；男35例，女30例，年齡28～66歲。同時(shí)選取性別、年齡匹配的健康體檢者50人(男28人，女22人)為對(duì)照組，年齡27～66歲。所有入組者均知情同意。

1.2主要試劑及儀器ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R﹠D公司。ANXA2兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(羅氏E601)，酶免之星全自動(dòng)免疫分析儀(瑞士Hamilton公司產(chǎn)品)。

1.3不同組織中ANXA2蛋白表達(dá)的檢測(cè)癌組織石蠟標(biāo)本在連續(xù)4 μm切片后用于檢測(cè)ANXA2的表達(dá)，并以來(lái)自手術(shù)或胃鏡活檢、證實(shí)為無(wú)癌及不典型增生組織的癌旁黏膜組織為對(duì)照。石蠟切片脫蠟水化后依免疫組化SP法染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。一抗按1400稀釋。用已知陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗為陰性對(duì)照。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度綜合評(píng)分，在高倍鏡下選10個(gè)視野，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比<25%計(jì)1分，25%～計(jì)2分，51%～計(jì)3分，>75%計(jì)4分；未著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩種計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)所得分值的乘積為0或1為陰性，≥2為陽(yáng)性。

1.4血清ANXA2及CEA水平的檢測(cè)觀察組在術(shù)前1 d、術(shù)后1個(gè)月各采血1次，對(duì)照組采血1次。采用ELISA法檢測(cè)ANXA2。室溫靜置30 min后，3 500 r/min離心15 min，分離血清。嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說(shuō)明書操作。100 μL血清樣本或者標(biāo)準(zhǔn)品被分別添加到96孔板中，加入A試劑100 μL，37 ℃孵育60 min，再加入B試劑100 μL，37 ℃孵育30 min，然后加入底物溶液90 μL，37 ℃孵育25 min，最后每孔添加終止液50 μL，并讀取450 nm 處的吸光度。板內(nèi)、板間變異系數(shù)均<10%，全自動(dòng)酶標(biāo)儀讀數(shù)。采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清CEA水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)。胃癌患者癌和癌旁組織ANXA2陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，不同病理階段的胃癌組織間ANXA2陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用χ2檢驗(yàn)；觀察組手術(shù)前后和對(duì)照組血清ANXA2、CEA水平的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，不同病理階段的胃癌患者血清ANXA2和CEA水平比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析；用Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析觀察組血清ANXA2水平和癌組織中ANXA2表達(dá)的關(guān)系以及血清ANXA2 水平和CEA水平的關(guān)系。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1胃癌與癌旁組織ANXA2的表達(dá)情況見圖1、表1。不同胃癌組織中ANXA2的表達(dá)見表2。由表1、2可知，觀察組癌組織中ANXA2陽(yáng)性表達(dá)率為81.5%(53/65)，高于癌旁胃黏膜組織的陽(yáng)性率[4.6%(3/65)]；淋巴結(jié)陽(yáng)性不伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組、淋巴結(jié)陽(yáng)性伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組癌組織中ANXA2的陽(yáng)性表達(dá)率高于淋巴結(jié)陰性組。

圖1　癌旁胃黏膜(A)和胃癌(B)組織中ANXA2的表達(dá)(SP，×400)

表1　胃癌與癌旁胃黏膜組織中ANXA2的表達(dá)　例

表2　不同胃癌組織中ANXA2的表達(dá)　例(%)

χ2=5.979，P=0.015；*：與淋巴結(jié)陰性組相比，P<0.017。

2.2各組血清ANXA2、CEA水平的比較見表3～5。由表3～5可知，觀察組術(shù)前血清ANXA2及CEA水平高于對(duì)照組，觀察組術(shù)后1個(gè)月血清ANXA2及CEA水平與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。觀察組中，淋巴結(jié)陽(yáng)性伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者術(shù)前血清CEA水平最高。

表3　觀察組手術(shù)前后和

表4　不同病理階段的

F組間=3.141，P=0.050；F時(shí)間=272.558，P<0.001；F交互=2.790，P=0.069。

表5　不同病理階段的

F組間=16.441，P<0.001；F時(shí)間=1 556.522，P<0.001；F交互=12.568，P<0.001。

2.3觀察組術(shù)前血清ANXA2水平與癌組織中ANXA2陽(yáng)性表達(dá)率及術(shù)前血清CEA水平的關(guān)系觀察組術(shù)前血清ANXA2水平與癌組織中ANXA2的陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)(rS=0.407，P<0.001)；觀察組術(shù)前血清ANXA2水平與術(shù)前CEA水平呈正相關(guān)(rS=0.537，P<0.001)。

3討論

胃癌在我國(guó)常見的消化道惡性腫瘤中發(fā)病率、死亡率均居首位，嚴(yán)重危害國(guó)人健康[6]。由于目前胃癌腫瘤標(biāo)志物用作胃癌診斷和病情監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確率不能令人滿意，故尋找新的腫瘤標(biāo)志物對(duì)胃癌病情評(píng)估及綜合治療意義重大[7]。ANXA2與包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤關(guān)系密切，但該指標(biāo)能否作為胃癌標(biāo)志物報(bào)道很少。ANXA2全長(zhǎng)14 000 bp，編碼339個(gè)氨基酸，定位于人染色體15q21-q22，由13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子組成。ANXA2廣泛表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等的胞核和胞質(zhì)中，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生命過(guò)程[8]，并與腫瘤關(guān)系密切。Yonglitthipagon等[4]的研究表明，ANXA2在膽管癌中的高表達(dá)是預(yù)后差的指標(biāo)；Yang等[9]研究發(fā)現(xiàn)ANXA2表達(dá)增高是結(jié)直腸癌預(yù)后差的獨(dú)立影響因素。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)抑制ANXA2表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，且可以提高肝癌細(xì)胞對(duì)氟尿嘧啶的敏感性。該研究發(fā)現(xiàn)ANXA2在胃癌組織中的表達(dá)高于癌旁胃黏膜組織，與其他報(bào)道[11]一致。同時(shí)作者還發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)陽(yáng)性伴及不伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者癌組織中ANXA2的陽(yáng)性表達(dá)率高于淋巴結(jié)陰性的患者，提示ANXA2對(duì)胃癌的惡化與轉(zhuǎn)移可能有促進(jìn)作用。

為探討ANXA2作為胃癌標(biāo)志物的可行性，作者同時(shí)應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)了胃癌患者血清ANXA2的水平。結(jié)果顯示胃癌患者術(shù)前血清ANXA2高于正常人，而手術(shù)切除腫瘤后ANXA2水平降至正常水平，說(shuō)明血清ANXA2對(duì)反映體內(nèi)腫瘤狀態(tài)有意義。對(duì)胃癌患者的血清ANXA2深入分析還發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)陽(yáng)性伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組、淋巴結(jié)陽(yáng)性不伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組及淋巴結(jié)陰性組血清ANXA2雖呈下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.069)，應(yīng)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。相關(guān)分析表明觀察組血清ANXA2水平與癌組織中ANXA2的陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)，提示血清ANXA2檢測(cè)可作為胃癌術(shù)前分期的參考指標(biāo)。術(shù)后血清ANXA2明顯降低，也證實(shí)ANXA2在血清的水平與體內(nèi)腫瘤的狀態(tài)有關(guān)，術(shù)后監(jiān)測(cè)血清ANXA2可反映體內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況。

CEA是目前最常用的胃癌標(biāo)志物[12]，對(duì)胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)有意義。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清CEA水平與ANXA2水平呈正相關(guān)，提示血清ANXA2和CEA檢測(cè)可能對(duì)預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有協(xié)同作用。

總之，該研究發(fā)現(xiàn)，ANXA2在胃癌患者的血清和癌組織中均存在升高的現(xiàn)象且存在相關(guān)性；監(jiān)測(cè)血清ANXA2和CEA水平對(duì)預(yù)測(cè)胃癌病情有重要意義。但該研究規(guī)模較小，未進(jìn)行深入的機(jī)制分析，這些問(wèn)題還需要進(jìn)一步研究完善。

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(2015-03-27收稿責(zé)任編輯徐春燕)

*河北省普通高校強(qiáng)勢(shì)特色學(xué)科資助項(xiàng)目冀教高[2005]52;河北省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)課題ZD20140442

Detection of expression of ANXA2 in gastric cancer tissue and serum ANXA2 and CEA levels

ZHANGZhidong，LIYong，TANBibo，ZHAOQun，JIAOZhikai，ZHAOXuefeng，WANGDong，LIUYu

TheThirdDepartmentofSurgery，theFourthAffiliatedHospital，HebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050011

Key wordsgastric neoplasm;annexins A2;carcinoembryonic antigen

中圖分類號(hào)R735.2

通信作者#，男，1958年10月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：消化道惡性腫瘤基礎(chǔ)與臨床，E-mail:liyonghbth@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.019