沉默ClC-3氯通道基因對PC-12細胞凋亡的影響*

吳　瓊,張淑玲,李　曦,林　玲,常全忠1,#

1)漯河醫(yī)學高等?？茖W?；A部生理學教研室 漯河 462002　2)遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)生理學教研室 珠海 519041

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沉默ClC-3氯通道基因對PC-12細胞凋亡的影響*

吳瓊1),張淑玲2),李曦2),林玲1),常全忠1,2)#

1)漯河醫(yī)學高等專科學?；A部生理學教研室 漯河 4620022)遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)生理學教研室 珠海 519041

關鍵詞siRNA；ClC-3；大鼠；細胞凋亡

摘要目的：觀察氯離子通道蛋白3(ClC-3)基因沉默對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞PC-12凋亡的影響。方法：取處于對數生長期的PC-12細胞，隨機分為4組：對照組(用正常培養(yǎng)基培養(yǎng))、H2O2組(用300 nmol/L H2O2誘導12 h)、H2O2+空質粒組(細胞轉染pGPU6/GFP 24 h后用H2O2誘導12 h)、H2O2+siRNA組(細胞轉染pGPU6/GFP-ClC-3-siRNA 24 h后用H2O2誘導12 h)。通過CCK-8檢測細胞存活率，流式細胞術檢測細胞凋亡率，Western blot法檢測Caspase-3以及ClC-3蛋白的表達，實時熒光定量PCR檢測ClC-3 mRNA的表達。結果：與對照組比較，H2O2組、H2O2+空質粒組和H2O2+siRNA組均表現為細胞存活率下降，細胞凋亡增加，ClC-3 mRNA和Caspase-3、ClC-3蛋白表達增加(P<0.05)； H2O2組和H2O2+空質粒組比較，各指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；但與H2O2組、H2O2+空質粒組比較，H2O2+siRNA組細胞存活率較高，細胞凋亡率較低，ClC-3 mRNA和Caspase-3、ClC-3蛋白表達較弱(P<0.05)。結論：ClC-3氯離子通道參與了H2O2誘導的PC-12細胞凋亡。

AbstractAim: To observe the effect of chloride channel protein 3(ClC-3) gene silence on the apoptosis of rat adrenal pheochromocytoma PC-12 cells. Methods: The siRNA sequences targeting ClC-3 were synthesized. PC-12 cells were allocated into 4 groups:control group, H2O2group(cultured with 300 nmol/L H2O2for 12 h), liposome group(pGPU6/GFP transfection and H2O2culture) and siRNA group(pGPU6/GFP-ClC-3-siRNA transfection and H2O2culture).Cell survival was tested by CCK-8 method, cell apoptosis was detected by flow cytometry,Caspase-3 and ClC-3 protein were detected by Western blot, and ClC-3 mRNA was detected by Real-time fluorescent quantitative PCR. Results: Compared with control group, cell survival rate decreased, while apoptotic rate, the ClC-3 mRNA level, and the Caspase-3 and ClC-3 protein expression increased in the other 3 groups(P<0.05). The differences in the indexes mentioned above were not significant between H2O2group and liposome group(P>0.05). Compared with those of the H2O2group and liposome group, cell survival rate was higher, while apoptotic rate, the ClC-3 mRNA level, and the Caspase-3 and ClC-3 protein expression were lower in siRNA group(P<0.05).Conclusion: ClC-3 chloride channel might be involved in PC-12 apoptosis induced by hydrogen peroxide.

缺血性腦卒中具有較高的發(fā)病率、致殘率和病死率。腦缺血時，若在發(fā)病3 h以內及時恢復供血則可以挽救缺血區(qū)神經元，但臨床上多數患者都錯過了這一最佳治療時間窗。神經元凋亡是缺血性腦損傷后神經元死亡的一種主要形式[1-3]。由于神經元凋亡的確切機制尚不十分清楚，目前臨床尚無有效的抗凋亡藥物和方法,因此，探索神經元凋亡的機制，尋找抗凋亡的靶點藥物是目前研究的焦點。研究[4]顯示，氯離子通道可能參與了缺血性神經元的凋亡。作者根據氧化應激理論，用H2O2誘導大鼠腎上腺嗜鉻細胞PC-12凋亡，利用RNAi技術沉默細胞氯離子通道蛋白3(ClC-3)基因，觀察細胞中Caspase-3蛋白表達的變化，進一步探討氯離子通道在缺血性神經元凋亡中的作用。

1材料與方法

1.1主要實驗材料PC-12細胞購于中國科學院上海生命科學研究所。DMEM/F12培養(yǎng)基購于Gibco公司，Trizol試劑、Lipofectamine2000購于Invitrogen公司，ClC-3抗體、Caspase-3(17 000)抗體、Hochest33342和AnnexinV-FITC購于美國Sigma公司；羊抗兔IgG購于武漢博士德生物工程有限公司。質粒pGPU6/GFP購于蘇州吉瑪基因股份有限公司。大腸桿菌DH5α由遵義醫(yī)學院中心實驗室提供。

1.2靶向ClC-3基因的siRNA質粒的構建根據siRNA設計原則，針對GenBank中ClC-3基因(NC_009043.1)不同位點設計靶向ClC-3基因的DNA互補寡核苷酸序列，用Primer5.0分析序列特異性。siRNA正義鏈序列為5’-CAAUGGAUGGCCUGUCAU ATT-3’，反 義 鏈 序列為5’-UAUGACAGGAAAUC CAUUGTA-3’。將合成的寡核苷酸單鏈稀釋后退火成雙鏈, 連接到pGPU6/GFP質粒，得重組載體pGPU6/GFP-ClC-3-siRNA，將該質粒轉入感受態(tài)DH5α, 篩選,PCR 驗證后提取質粒，并進行雙酶切和測序鑒定。上述序列的合成和重組質粒的構建由南京金斯瑞科技有限公司完成。

1.3細胞培養(yǎng)與分組參照文獻[5]，從液氮中取出凍存的PC-12細胞，常規(guī)進行復蘇與培養(yǎng)。細胞在80%～90%融合時按14比例傳代接種到96孔板，細胞密度為5×105mL-1，分為4組：對照組(用正常培養(yǎng)基培養(yǎng))、H2O2組(用H2O2誘導細胞凋亡)、H2O2+空質粒組(細胞轉染pGPU6/GFP+H2O2誘導)、H2O2+siRNA組(細胞轉染pGPU6/GFP-ClC-3-siRNA+H2O2誘導)，每組6孔。H2O2+空質粒組和H2O2+siRNA組參照Lipofectamine2000轉染試劑操作說明進行質粒轉染。轉染24 h后參照文獻[6-7]選用300 nmol/L H2O2誘導12 h。

1.4細胞存活率的測定[6]取各組細胞，向每孔內加10 μL CCK-8溶液培養(yǎng)1 h，用酶標儀檢測450 nm處的光密度(OD)。細胞存活率=(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%。

1.5細胞凋亡的檢測

1.5.1Hochest33342染色法參照文獻[2]，取各組細胞，多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗，加Hochest33342(終濃度為5 mg/L)，避光15 min，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞核的染色情況。

1.5.2流式細胞儀法參照文獻[7]，取各組細胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化，用PBS清洗，500 r/min離心，離心后收集細胞，用Binding buffer懸浮細胞，加入Annexin V-FITC混勻后再加入5 μL Propidium Iodide, 室溫避光反應15 min，用流式細胞儀檢測(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm)。

1.6ClC-3 mRNA的檢測采用實時熒光定量PCR法。引物由南京金斯瑞科技有限公司設計合成。內參基因GAPDH引物序列: 上游 5’-GGTTGT CTCCTGCGACTTCA-3’, 下游 5’-TGGTCCAGG GTTTCTTACTCC-3’。 ClC-3引物序列: 上游5’-G CACACATCCGACTAAATGG-3’, 下游5’-AAA CAGCTAAGGGAGGGTCA-3’。取各組細胞，參照文獻[8-9]提取總RNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后進行反轉錄。以反轉錄產物為模板，進行PCR。反應參數：93 ℃預變性2 min；93 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。用公式2-ΔΔCt計算目的 mRNA的表達水平。

1.7ClC-3、Caspase-3(17 000)蛋白的檢測參照文獻[10-11]，取各組細胞，PBS沖洗2次，加細胞裂解液，收集細胞，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液，ABC法測定并調整蛋白濃度，90 ℃煮沸8 min，取20 μL樣品加樣，SDS-PAGE電泳，轉膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加兔抗鼠ClC-3抗體(11 000)、兔抗鼠Caspase-3多克隆抗體(11 000)、GAPDH抗體(11 000)，4 ℃過夜，轉移緩沖液漂洗2次，加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(14 000)，37 ℃靜置孵育1 h，轉移緩沖液漂洗2次，ECL顯影，分析條帶灰度值。實驗重復3次。用目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.8統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0進行數據分析；組間存活率、凋亡率、ClC-3 mRNA及ClC-3、proCaspase-3和Caspase-3蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；檢驗水準α=0.05。

2結果

2.14組細胞存活情況的比較對照組存活率100%。余3組PC-12細胞存活率見表1。H2O2組、H2O2+空質粒組、H2O2+siRNA組細胞存活率均低于100%。與H2O2組比較，H2O2+空質粒組細胞存活率無明顯改變，但H2O2+siRNA組細胞存活率上升。

表1　3組細胞存活率的比較

△：F=381.950，P<0.001；*:與H2O2組和H2O2+空質粒組比較，P<0.001。

2.24組細胞凋亡檢測結果Hochest33342熒光染色顯示：正常PC-12細胞核圓呈淡藍色熒光，凋亡細胞的胞核呈強亮白色熒光(圖1箭頭所示)。對照組有較少凋亡細胞，其他3組凋亡細胞明顯增多；H2O2+siRNA組凋亡細胞較H2O2+空質粒組明顯減少。流式細胞術檢測結果(表2)顯示，H2O2(300 nmol/L)能誘導大量PC-12細胞凋亡；H2O2+siRNA組凋亡率較H2O2+空質粒組和H2O2組降低。

2.34組細胞ClC-3 mRNA表達的比較見表3。對照組ClC-3 mRNA表達水平較低，H2O2組、H2O2+空質粒組ClC-3 mRNA表達水平較對照組升高，而H2O2+siRNA組較H2O2組和H2O2+空質粒組降低。

2.44組細胞Caspase-3和ClC-3蛋白表達的比較

見圖2、表4。與對照組比較，H2O2組、H2O2+空質粒組、H2O2+siRNA組Caspase-3和ClC-3表達均增加；與H2O2組和H2O2+空質粒組比較，H2O2+siRNA組Caspase-3和ClC-3蛋白表達明顯下降。

A：對照組；B：H2O2組；C：H2O2+空質粒組；D：H2O2+siRNA組。圖1　4組細胞Hochest33342熒光染色結果(×200)

表2　4組細胞凋亡率流式細胞術檢測結果的比較

△：F=1 228.000,P<0.001；*：與對照組相比，P<0.05；#：與H2O2組和H2O2+空質粒組相比，P<0.05。

表3　4組細胞ClC-3 mRNA表達水平的比較

△：F=13.144,P<0.001；*:與對照組比較,P<0.05;#:與H2O2組和H2O2+空質粒組比較,P<0.05。

1:對照組；2：H2O2組；3：H2O2+空質粒組；4：H2O2+siRNA組。圖2　Western blot檢測結果

組別nClC-3pro-Caspase-3Caspase-3對照組60.41±0.131.31±0.210.22±0.17H2O2組61.73±0.27*0.85±0.20*0.61±0.12*H2O2+空質粒組61.92±0.34*0.80±0.17*0.68±0.04*H2O2+siRNA組60.98±0.16*#1.03±0.13*#0.41±0.06*#F50.4739.82121.344P<0.001<0.001<0.001

*:與對照組比較，P<0.05;#:與H2O2組和H2O2+空質粒組比較，P<0.05。

3討論

神經元凋亡在腦缺血半暗區(qū)內占主導地位。缺血性腦損傷引起神經細胞凋亡的具體機制目前尚未完全闡明。前期的離體和在體實驗研究[4,12]顯示，氯離子通道可能參與了缺血性神經元的凋亡。作者在前期工作的基礎上，利用siRNA使PC-12細胞ClC-3基因靜默，進一步探討氯離子通道與神經元凋亡之間的關系。

PC12細胞是大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞株，具有神經內分泌細胞的一般特征，因其具可傳代特點，廣泛應用于神經生理和神經藥理學研究[13-14]。該研究采用PC-12細胞作為神經元的替代細胞，利用H2O2作為凋亡誘導劑建立神經元凋亡模型，對模型細胞凋亡率及凋亡蛋白Caspase-3(17 000)的表達情況進行了觀察，結果顯示H2O2可誘導PC-12細胞凋亡，與文獻[15]結果一致，說明此次研究建立的凋亡模型可靠。

研究中通過siRNA 靜默技術干擾模型細胞ClC-3蛋白的表達，而沉默ClC-3基因后細胞中ClC-3蛋白和Caspase-3(17 000)表達亦顯著減少，結果提示ClC-3氯離子通道基因的高表達可促進PC-12細胞的凋亡，Caspase-3依賴性信號通路可能參與了PC-12細胞的凋亡過程。ClC-3氯離子通道可能參與了缺血性神經元的凋亡。作者將進一步在神經元上靜默ClC-3，深入探討ClC-3與神經元凋亡的關系。該研究為探討缺血性神經元凋亡機制和抗凋亡的靶點藥物選擇提供了一定的理論參考。

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Effect of ClC-3 chloride channel gene silence on apoptosis of PC-12 cells

WUQiong1),ZHANGShuling2),LIXi2),LINLing1),CHANGQuanzhong1,2)

1)DepartmentofPhysiology,BasicMedicineFacultyofLuoheMedicalCollege,Luohe4620022)DepartmentofPhysiology,ZunyiMedicineUniversity(ZhuhaiCampus),Zhuhai519041

Key wordssmall interfering RNA;ClC-3 chloride channel;rat;cell apoptosis

中圖分類號R338.2

通信作者#，男，1965年12月生，博士，教授，研究方向：中樞神經系統(tǒng)的損傷與修復，E-mail:cqzchang@sina.com