兒茶素對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901和MGC-803遷移及侵襲的影響*

杜培培,劉宗文,張　艷#,張鈺浩,尚淑芳,賈丹輝

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 鄭州 450001　2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤放療科 鄭州 450014　3)鄭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系 鄭州 450052

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兒茶素對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901和MGC-803遷移及侵襲的影響*

杜培培1),劉宗文2),張艷1)#,張鈺浩3),尚淑芳1),賈丹輝1)

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 鄭州 4500012)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤放療科 鄭州 4500143)鄭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系 鄭州 450052

關(guān)鍵詞胃癌；酸敏感離子通道；阿米洛利；兒茶素

摘要目的：探討兒茶素是否作用于酸敏感離子通道(ASICs)，進(jìn)一步研究兒茶素是否通過ASICs對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲產(chǎn)生影響。 方法：采用MTT法檢測(cè)兒茶素(0、50、100、200、400 μmol/L)對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901和MGC-803增殖的影響。將細(xì)胞分為對(duì)照組，100 μmol/L阿米洛利組，50、100、200 μmol/L兒茶素組，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)ASIC1的表達(dá)情況，Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲情況。采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察對(duì)照組、100 μmol/L阿米洛利組、400 μmol/L兒茶素組細(xì)胞的電流情況。 結(jié)果：ASIC1在各組細(xì)胞中均有表達(dá)，并且與SGC-7901細(xì)胞相比， MGC-803細(xì)胞中ASIC1的表達(dá)較低(P<0.05)；與對(duì)照組相比，兒茶素可以抑制ASIC1的表達(dá)，并且兒茶素的抑制作用弱于阿米洛利的抑制作用(P均<0.05)。與SGC-7901細(xì)胞相比，MGC-803細(xì)胞的侵襲和遷移能力較弱(P均<0.05)；與對(duì)照組相比，兒茶素可減弱2種胃癌細(xì)胞的侵襲能力和遷移能力，并且兒茶素的抑制作用弱于阿米洛利的抑制作用(P均<0.05)。MGC-803細(xì)胞的ASICs電流小于SGC-7901細(xì)胞的ASICs電流(P<0.05)；與對(duì)照組相比，兒茶素可使ASICs電流減弱，并且兒茶素的抑制作用弱于阿米洛利的抑制作用(P均<0.05)。結(jié)論：兒茶素可以通過抑制ASICs的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

AbstractAim: To investigate the effects of catechin on ASICs, and explore the effects of catechin on invasion and metastasis of gastric carcinoma cells． Methods: The SGC-7901 and MGC-803 cells were treated with 0,50,100,200,and 400 μmol/L catechin and the proliferation of the cells were observed by MTT.The SGC-7901 and MGC-803 cells were allocated into control group, 100 μmol/L amiloride group, 50, 100, 200 μmol/L catechin groups;the expression of ASIC1 protein was detected by immunocytochemistry,and the changes of cell invasion and metastasis were detected by wound-healing migration assay and Transwell migration assay, respectively. Finally, the ASICs current was analyzed by the whole cell patch clamp.Results: Expression of ASIC1 protein in MGC-803 cells was lower that in SGC-7901 cells(P<0.05).Compared with the control group, catechin reduced ASIC1 expression,and the inhibitive effect of catechin on ASIC1 expression was weaker than that of Amiloride (P<0.05). The invasion and metastasis ability of MGC-803 cells were weaker than that of SGC-7901 cells(P<0.05).Compared with the control group,catechin could reduce invasion and metastasis ability of MGC-803 and SGC-7901 cells, and the inhibitive effect of catechin was weaker than that of Amiloride(P<0.05). The ASICs current of MGC-803 was lower than that of SGC-7901 cells(P<0.05).Compared with the control group,catechin could reduce ASICs current of MGC-803 and SGC-7901 cells,and the inhibitive effect of catechin was weaker than that of Amiloride(P<0.05).Conclusion: Catechin could inhibit invasion and metastasis ability of gastric carcinoma cells by reducing the expression of ASICs.

胃癌是常見的惡性腫瘤之一,復(fù)發(fā)率很高。研究[1]表明，胃癌的生物學(xué)行為與某些分子指標(biāo)有關(guān)。胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的程度是影響預(yù)后的主要因素[2],而腫瘤轉(zhuǎn)移的特性是腫瘤治療的難點(diǎn)[3]。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜和多步驟的連續(xù)發(fā)展過程[4]。研究[5]表明，組織酸化在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用，而酸敏感離子通道(ASICs)是細(xì)胞膜上一類可以被酸性溶液直接激活的通道蛋白，抑制ASICs表達(dá)可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移；阿米洛利作為ASICs的抑制劑可以減弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。兒茶素是一種黃烷醇類化合物，具有較明顯的抗癌作用[6]，可抑制腫瘤增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[7-10]；同時(shí)也可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[11-13]。該研究采用全細(xì)胞膜片鉗方法及體外侵襲生物學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察兒茶素對(duì)ASICs的作用，以及對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，從而為兒茶素治療胃癌提供新的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑胃癌細(xì)胞(SGC-7901、MGC-803)由河南省醫(yī)學(xué)研究所饋贈(zèng)。ASIC1抗體(北京博奧森生物有限公司)，阿米洛利、兒茶素(美國Sigma公司)。

1.2MTT法檢測(cè)胃癌細(xì)胞的生存率將2種胃癌細(xì)胞分別以 5×104mL-1接種在96孔板中；24 h后換為無血清DMEM高糖培養(yǎng)液，調(diào)整兒茶素濃度為0(對(duì)照)、50、100、200、400 μmol/L，各濃度設(shè)定培養(yǎng)時(shí)間為24 h；終止培養(yǎng)前4 h，每孔加20 μL MTT、150 μL二甲基亞砜，30 min后用酶標(biāo)儀(檢測(cè)波長為490 nm)檢測(cè)各孔吸光度值,以對(duì)照組的細(xì)胞生存率為1計(jì)算2種細(xì)胞的生存率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)ASIC1的表達(dá)將2種胃癌細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中，調(diào)整阿米洛利終濃度為100 μmol/L，兒茶素終濃度為50、100、200 μmol/L，另設(shè)對(duì)照組和陰性對(duì)照組，培養(yǎng)48 h后用40 g/L的多聚甲醛固定20 min；按SP試劑盒說明進(jìn)行操作；每張爬片觀察5個(gè)高倍視野,陽性細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)為棕黃色，胞核為藍(lán)色，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞遷移能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[14]，取2種胃癌細(xì)胞按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，劃痕，PBS清洗。加入含藥或者不含藥的無血清培養(yǎng)基(分組同1.3)，在 0、24 h 分別于倒置顯微鏡下拍照，與0 h比較計(jì)算24 h細(xì)胞遷移的距離，以SGC-7901對(duì)照組細(xì)胞的遷移率為1計(jì)算各組細(xì)胞的遷移率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞侵襲能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]，細(xì)胞分組同1.3，每孔加入16稀釋膠40 μL，放入37 ℃培養(yǎng)箱中30 min；調(diào)整細(xì)胞密度為1×106mL-1，每孔加200 μL細(xì)胞懸液；24孔板下室加含體積分?jǐn)?shù)30%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基600 μL；200倍鏡下每孔取5個(gè)視野拍照，記錄穿膜細(xì)胞數(shù)并求平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6全細(xì)胞膜片鉗觀察細(xì)胞的ASICs電流將細(xì)胞分為對(duì)照組、100 μmol/L阿米洛利組和400 μmol/L兒茶素組，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁且狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。電極內(nèi)液包含：100 mmol/L葡萄糖酸鉀、30 mmol/L KCl、10 mmol/L NaCl、20 mmol/L HEPES、0.5 mmol/L EGTA、4 mmol/L ATPNa2；細(xì)胞外液包含：125 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgSO4、1 mmol/L CaCl2、1 mmol/L NaH2PO4、10.5 mmol/L葡萄糖、32.5 mmol/L HEPES。實(shí)驗(yàn)時(shí)將細(xì)胞置于35 mm培養(yǎng)皿中，加入細(xì)胞外液1 mL，放置在倒置顯微鏡平臺(tái)上；使充滿電極內(nèi)液的玻璃微電極尖端吸附在細(xì)胞膜上，給予負(fù)壓，電壓鉗制在-60 mV,破膜5 min后開始檢測(cè)電流。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組細(xì)胞生存率、ASIC1陽性表達(dá)率、遷移侵襲能力、ASICs電流的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1MTT法檢測(cè)不同濃度的兒茶素對(duì)胃癌細(xì)胞生存率的影響結(jié)果見表1。

表1　各組細(xì)胞生存率的比較(n=3)　%

*：與對(duì)照組相比，P<0.05。

A:對(duì)照組;B:陰性對(duì)照組;C:100 μmol/L阿米洛利組;D:50 μmol/L兒茶素組;E:100 μmol/L兒茶素組;F:200 μmol/L兒茶素組。圖1　各組SGC-7901細(xì)胞中ASIC1的表達(dá)(SP，×400)

2.2各組細(xì)胞中ASIC1的表達(dá)情況結(jié)果見圖1、2和表2。

A:對(duì)照組;B:陰性對(duì)照組;C:100 μmol/L阿米洛利組;D:50 μmol/L兒茶素組;E:100 μmol/L兒茶素組;F:200 μmol/L兒茶素組。圖2　各組MGC-803細(xì)胞中ASIC1的表達(dá)(SP，×400)

表2　各組細(xì)胞ASIC1陽性表達(dá)率的比較(n=3)　%

*：與對(duì)照組相比，P<0.05；#：與100 μmol/L阿米洛利組相比，P<0.05；▲：與SGC-7901對(duì)照組相比，P<0.05。

2.3各組細(xì)胞遷移能力的比較結(jié)果見表3。

表3　各組細(xì)胞遷移率的比較(n=3)　%

*：與對(duì)照組相比，P<0.05；#：與100 μmol/L阿米洛利組相比，P<0.05；▲：與SGC-7901對(duì)照組相比，P<0.05。

2.4各組細(xì)胞侵襲能力的比較結(jié)果見表4。

表4　各組細(xì)胞侵襲能力的比較(n=3)

*：與對(duì)照組相比，P<0.05；#：與100 μmol/L阿米洛利組相比，P<0.05；▲：與SGC-7901對(duì)照組相比，P<0.05。

2.5各組細(xì)胞ASICs電流強(qiáng)度的比較結(jié)果見表5。

表5　各組細(xì)胞ASICs電流強(qiáng)度的比較(n=3)　pA

*：與對(duì)照組相比，P<0.05；#：與100 μmol/L阿米洛利組相比，P<0.05；▲：與SGC-7901對(duì)照組相比，P<0.05。

3討論

胃癌的復(fù)發(fā)率和病死率較高，其中胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其復(fù)發(fā)的主要原因。侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)行為,是影響抗腫瘤治療及預(yù)后的重要因素之一[16]。ASICs是細(xì)胞膜上由細(xì)胞外H+直接激活的通道蛋白，目前，已有6個(gè)ASICs亞基被克隆，分別是 ASIC1a、1b、2a、2b、3和4[17]。研究[18]表明其在腦缺血等伴有組織酸化的病理狀態(tài)中發(fā)揮作用，當(dāng)腦缺血發(fā)生時(shí)，細(xì)胞周圍的pH從7.4降至6.0甚至更低，這樣就刺激ASIC1a開放，介導(dǎo)鈣內(nèi)流，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡從而促使神經(jīng)元損傷。研究[19]表明，組織酸化和乏氧是腫瘤微環(huán)境的重要生物學(xué)特征。腫瘤的微環(huán)境乏氧和酸化與腦缺血組織酸化具有相似的病理基礎(chǔ)。ASICs在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中有表達(dá)，它的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[20]。也有研究[21]發(fā)現(xiàn)在腺樣囊性癌細(xì)胞和組織中均有ASICs的表達(dá)，但是在正常組織中并未見ASICs的明顯表達(dá)。

該研究中免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，在2種胃癌細(xì)胞SGC-7901和MGC-803中均有ASIC1的表達(dá)，說明ASICs可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系；SGC-7901細(xì)胞是中分化高轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞，而MGC-803細(xì)胞是低轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞，2種細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力有差別，推測(cè)胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移可能與ASICs的表達(dá)有一定關(guān)系。兒茶素是一種天然的植物提取藥物，有潛力成為抗癌藥物[22]，它可以抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U215的增殖[23], 在一定程度上也可抑制人肝癌細(xì)胞的增殖和遷移并誘導(dǎo)其凋亡[24]。該研究結(jié)果表明，兒茶素可以抑制胃癌細(xì)胞ASIC1的表達(dá)，減弱ASICs電流，并且還可抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。這為臨床上采用兒茶素治療胃癌提供了一定的理論依據(jù)，但是具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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Effects of catechin on invasion and metastasis in gastric carcinoma cells SGC-7901 and MGC-803

DUPeipei1),LIUZongwen2),ZHANGYan1),ZHANGYuhao3),SHANGShufang1),JIADanhui1)

1)DepartmentofPharmacology，CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)DepartmentofRadiationOncology,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500143)DepartmentofClinicalMedicine,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

*河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目基礎(chǔ)研究計(jì)劃基金資助項(xiàng)目15A310031；鄭州市科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金資助項(xiàng)目131PCXTD628

Key wordsgastric carcinoma;ASICs;amiloride;catechin

中圖分類號(hào)R735.2

通信作者#，女，1968年4月生，博士，教授，研究方向：腫瘤藥理學(xué)，E-mail:zhangyan055@zzu.edu.cn

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.013 [8]RATHORE K,CHOUDHARY S,OA,et al.Green tea catechin intervention of reactive oxygen species-mediated ERK pathway activation and chronically induced breast cell carcinogenesis[J].Carcinogenesis,2012,33(1):174