HPV-16 L1甲基化和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)宮頸病變的臨床價(jià)值*

李肖甫，邱　翠，智艷芳，李　雅，榮守華，樊婷婷

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院細(xì)胞室 鄭州 450052

△男，1964年7月生，碩士，教授，研究方向:腫瘤細(xì)胞病理學(xué)診斷，E-mail:lixiaofu1964@163.com

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HPV-16 L1甲基化和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)宮頸病變的臨床價(jià)值*

李肖甫△，邱翠，智艷芳，李雅，榮守華，樊婷婷

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院細(xì)胞室 鄭州 450052

△男，1964年7月生，碩士，教授，研究方向:腫瘤細(xì)胞病理學(xué)診斷，E-mail:lixiaofu1964@163.com

關(guān)鍵詞人乳頭瘤病毒；宮頸病變；HPV-16 L1甲基化；HPV E6/E7 mRNA

摘要目的：探討HPV-16 L1甲基化程度、HPV E6/E7 mRNA表達(dá)水平在檢測(cè)宮頸病變中的臨床價(jià)值。 方法：選擇50例HPV-16感染患者的宮頸脫落細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，其中CIN1 11例、CIN2 11例、CIN3 21例、宮頸鱗癌(SCC)7例，另取11例病理檢測(cè)HPV-16陰性或慢性炎癥者為對(duì)照。采用甲基化敏感性高分辨溶解曲線法檢測(cè)HPV-16 L1甲基化水平，采用bDNA技術(shù)檢測(cè)HPV E6/E7 mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果：對(duì)照組、CIN1組、CIN2組、CIN3組和SCC組HPV-16 L1甲基化陽(yáng)性率分別為9.1%、72.7%、81.8%、90.5%、100.0%，HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率分別為45.5%、72.7%、90.9%、100.0%、100.0%；CIN2以上病變中HPV-16 L1甲基化陽(yáng)性率均高于對(duì)照組，而CIN3以上病變中HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率均高于對(duì)照組(P均<0.005)。HPV-16 L1甲基化程度和HPV E6/E7 mRNA水平均隨宮頸病變嚴(yán)重程度的增加而升高(rS=0.638和0.525，P均<0.001)；HPV-16 L1甲基化程度與HPV E6/E7 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(rS=0.420, P=0.001)。結(jié)論：HPV-16 L1甲基化與HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在分流HPV感染或細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性患者方面具有良好的臨床應(yīng)用前景。

AbstractAim: To evaluate the clinical value of HPV-16 L1 methylation and HPV E6/E7 mRNA testing for the detection of cervical lesions.Methods: Fifty cervical cytology samples(11 cases of CIN1, 11 cases of CIN2, 21 cases of CIN3 and 7 cases of SCC). Another 11 samples with histology-negative or chronic inflammation were used as control. The HPV-16 L1 methylation and HPV E6/E7 mRNA levels were detected using MS-HRM assay and bDNA technique, respectively.Results: The overall positive rates of HPV-16 L1 methylation and HPV E6/E7 mRNA for control, CIN1,CIN2,CIN3 and SCC groups were 9.1%,72.7%,81.8%,90.5%,100.0% and 45.5%,72.7%,90.9%,100.0%,100.0%, respectively. The HPV-16 L1 methylation positive rate in CIN2+groups was higher than that of control group, while the HPV E6/E7 mRNA positive rate in CIN3+groups was higher than that of control group(all P<0.005). The HPV-16 L1 methylation degree and HPV E6/E7 mRNA level increased with the severity of cervical lesions(rS=0.638,0.525, all P<0.001). Additionally, the HPV-16 L1 methylation and HPV E6/E7 mRNA level had positive correlation (rS=0.420,P=0.001).Conclusion: The HPV-16 L1 methylation and HPV E6/E7 mRNA testing may have good applied prospect for the triage of women with HPV-infection or cytology-positive in clinical practice.

宮頸癌是威脅女性健康的第三大惡性腫瘤[1]。高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)持續(xù)感染是宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宮頸癌發(fā)生的主要病因[2-3]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有40種HPV亞型能入侵生殖器官，其中最主要的是HPV-16型，據(jù)統(tǒng)計(jì)，約50%的宮頸癌病例中能夠發(fā)現(xiàn)此型HPV[4]。目前，臨床上用于宮頸癌篩查的主要手段是宮頸液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查(thinprep cytologic test，TCT)聯(lián)合HR-HPV DNA檢測(cè)，但這兩種方法反映的僅是宮頸當(dāng)前的病理狀態(tài)，并不能預(yù)測(cè)宮頸病變的進(jìn)展及回退。因此，尋找篩查高危宮頸病變的新的生物標(biāo)志已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。近期研究[5]顯示HPV-16 L1有望成為分流HPV感染患者的良好的生物標(biāo)志物。此外，高危型HPV癌基因E6和E7的表達(dá)對(duì)于惡性腫瘤的轉(zhuǎn)化和維持起著重要作用，監(jiān)測(cè)HPV E6/E7 mRNA的表達(dá)具有非常重要的意義[6]。該研究通過收集細(xì)胞學(xué)檢查后剩余液基標(biāo)本，分別采用甲基化敏感性高分辨溶解曲線法(methylation-sensitive high resolution melting，MS-HRM)檢測(cè)HPV-16陽(yáng)性患者HPV-16 L1甲基化水平，QUANTIVIRUS@HPV E6/E7 mRNA 3.0 Assay(b-DNA)法檢測(cè)HPV E6/E7 mRNA的水平，評(píng)估這兩個(gè)指標(biāo)在檢測(cè)宮頸病變中的臨床價(jià)值。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選取2012年1月至2013年5月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院行常規(guī)TCT檢查、經(jīng)PCR分型檢測(cè)確認(rèn)為單純HPV-16陽(yáng)性且經(jīng)隨訪陰道鏡檢查獲得組織活檢結(jié)果的患者50例，其中CIN1組11例，CIN2組11例，CIN3組21例，宮頸鱗癌(SCC)組7例；另取11例宮頸檢查HPV-16陰性或慢性炎癥者為對(duì)照。納入研究的61例患者年齡25～76歲，中位年齡39歲。該研究獲得了鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生命科學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2HPV-16 L1甲基化檢測(cè)

1.2.1甲基化標(biāo)準(zhǔn)品的配制HPV-16 L1基因 100%甲基化標(biāo)準(zhǔn)和0%甲基化標(biāo)準(zhǔn)均根據(jù)目標(biāo)序列合成，并克隆到E.coli(南京金思特科技有限公司)，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品DNA濃度均由熒光定量PCR精確定量后，用0%甲基化標(biāo)準(zhǔn)品將100%甲基化標(biāo)準(zhǔn)品分別按比例稀釋，配制成1%、10%、25%、50%和75% 5個(gè)甲基化程度的標(biāo)準(zhǔn)品，與0%、100%共計(jì)7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，用于隨后的MS-HRM檢測(cè)。

1.2.2DNA提取和重亞硫酸鹽修飾將TCT剩余標(biāo)本4 000 r/min離心5 min，取適量沉淀物加入20 μL蛋白酶K，56 ℃水浴箱中過夜處理。提取的DNA經(jīng)NanoDrop-2000超微量分光光度計(jì)(美國(guó)熱電公司)定量檢測(cè)后，取900 ng用于重亞硫酸鹽修飾，EpiTect Bisulfite試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。所有修飾后的DNA及剩余TCT標(biāo)本分別存放于-80 ℃和4 ℃冰箱。

1.2.3HPV-16 L1基因甲基化狀態(tài)檢測(cè)采用MS-HRM法。所測(cè)HPV-16 L1基因區(qū)域?yàn)閚t5576～5636(NCBI 登記號(hào)：NC_001526.2)，相應(yīng)特異甲基化PCR上游引物序列為5’-GCGCATTATTGTTGAT GTAGGTGATTTTTATTTATATTTTAG-3’，下游引物序列為5’-GCCGCACTAAACAACCAAAAAAACATC TAAAAAAAAATA-3’。PCR擴(kuò)增體系：5.0 μL 2×EpiTect HRM PCR Master Mix，上、下游引物(10 mg/L)各0.6 μL，1.0 μL修飾后DNA，2.8 μL無(wú)菌水。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s, 退火從60 ℃到52 ℃ 30 s(每個(gè)循環(huán)下降 0.2 ℃),72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 1 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)18 g/L凝膠電泳驗(yàn)證。擴(kuò)增后，在LightCycler480上進(jìn)行高分辨溶解曲線分析，條件為：95 ℃ 1 min, 40 ℃ 1 min, 65 ℃ 1 s, 以0.02 ℃/s的速度從72 ℃上升至95 ℃，收集溶解曲線數(shù)據(jù)，每1 ℃采集熒光25次，40 ℃ 冷卻1 min。所有標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)檢測(cè)。最后，運(yùn)行g(shù)ene scanning程序，根據(jù)樣本與標(biāo)準(zhǔn)品溶解曲線熒光值高低判斷樣本甲基化程度。以10%甲基化為臨界點(diǎn)判定甲基化陽(yáng)性率。

1.3HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自科迪亞生物技術(shù)有限公司。采用bDNA法定量檢測(cè)標(biāo)本中HPV E6/E7 mRNA水平，具體按文獻(xiàn)[7]操作：將TCT剩余標(biāo)本3 000 r/min離心5 min后棄去上清，用2 mL去離子水洗滌后再次離心，棄上清，加入裂解液，放65 ℃恒溫箱過夜；經(jīng)配制檢測(cè)緩沖液、布板、信號(hào)放大，上冷光儀檢測(cè)，得標(biāo)本、空白及陽(yáng)性質(zhì)控的發(fā)光值，用相關(guān)光單位(RLU)表示，將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入專用軟件處理。當(dāng)標(biāo)本RLU和陽(yáng)性質(zhì)控的cutoff值≥1.00時(shí)，判定標(biāo)本為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。宮頸病變級(jí)別與HPV-16 L1甲基化程度和HPV E6/E7 mRNA水平間，以及HPV-16 L1甲基化程度與HPV E6/E7 mRNA水平間的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析，采用χ2檢驗(yàn)比較不同級(jí)別宮頸病變組織中HPV-16 L1甲基化陽(yáng)性率和HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1不同級(jí)別宮頸病變組織中HPV-16 L1甲基化程度和HPV E6/E7 mRNA水平的比較所有標(biāo)準(zhǔn)品HPV-16 L1甲基化程度均被成功檢測(cè)(圖1)。HPV-16 L1甲基化程度隨宮頸病變嚴(yán)重程度的增加而升高(rS=0.638,P<0.001)。HPV E6/E7 mRNA的水平隨宮頸病變嚴(yán)重程度的增加而升高(rS=0.525,P<0.001)。

圖1　MS-HRM方法檢測(cè)HPV-16 L1不同甲基化程度標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的差異標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2宮頸病變組織中HPV-16 L1甲基化程度與HPV E6/E7 mRNA水平間的關(guān)系HPV-16 L1甲基化程度與HPV E6/E7 mRNA水平呈正相關(guān)(rS=0.420,P=0.001)。

2.3不同宮頸病變HPV-16 L1甲基化陽(yáng)性率和HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率比較見表1。

表1　不同宮頸病變HPV-16 L1甲基化

*：與對(duì)照組相比，P<0.005。

2.4不同檢測(cè)方法診斷CIN2以上病變的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值見表2。

表2　不同檢測(cè)方法診斷CIN2以上病變的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值　%

3討論

有研究[8-9]指出，HPV DNA 的甲基化狀態(tài)可以提示HPV感染者CIN2及以上瘤變。HR-HPV感染是宮頸癌發(fā)生的重要始動(dòng)因素。在全球范圍內(nèi)，HPV-16型目前已經(jīng)證實(shí)是宮頸癌中最常見的型別；HPV-16致癌性最強(qiáng)，且從最初感染到進(jìn)展為宮頸癌的發(fā)病時(shí)間也相對(duì)其他類型的HR-HPV要短很多。HPV-16 L1殼蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，可誘導(dǎo)先天性或獲得性免疫應(yīng)答，有利于機(jī)體清除感染細(xì)胞。HPV-16 L1基因甲基化則在一定程度上可能影響L1殼蛋白的表達(dá)，使得其免疫效應(yīng)弱化，最終導(dǎo)致宮頸疾病的發(fā)生和進(jìn)展。因此，HPV-16 L1甲基化有望成為分流HPV感染患者的良好生物標(biāo)志物。

近年來，人們對(duì)DNA甲基化認(rèn)識(shí)不斷提高，并研究開發(fā)了一系列檢測(cè)DNA甲基化的方法。HPV基因組長(zhǎng)7 000～8 000 bp，由于其基因組中沒有典型的CpG島，所以目前多采用特異位點(diǎn)甲基化的檢測(cè)手段，就方法學(xué)而言各有其特點(diǎn)[10]。與其他方法相比，MS-HRM方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：①能夠定量檢測(cè)DNA甲基化程度。②高通量且能夠減少工作量。③節(jié)約成本。④快速且敏感性高。作者選擇MS-HRM作為檢測(cè)方法，結(jié)果顯示，HPV-16 L1甲基化程度隨宮頸病變嚴(yán)重程度的增加呈上升的趨勢(shì)，且CIN2以上病變組HPV-16 L1甲基化陽(yáng)性率高于對(duì)照組，和以往研究[11]結(jié)果一致。

HPV的早期基因E6/E7編碼的早期蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)是導(dǎo)致宮頸癌的關(guān)鍵因素[12]，其機(jī)制可能為E6/E7蛋白抑制了抑癌基因p53和pRB[13-14]，引起細(xì)胞過度增殖，最終導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生[15]。因此，作為E6/E7蛋白翻譯模板的mRNA的檢測(cè)有利于區(qū)別短暫性HPV感染和高級(jí)別宮頸病變相關(guān)的HPV感染，較之DNA 檢測(cè)特異性更高，也更具有臨床指導(dǎo)意義[16]。

該研究采用的bDNA技術(shù)是一種三明治結(jié)構(gòu)的核酸雜交方法。該方法采用bDNA分子放大捕獲的目標(biāo)RNA信號(hào)。該技術(shù)特點(diǎn)是檢測(cè)樣本不需呈指數(shù)增長(zhǎng)的擴(kuò)增過程，通過支鏈DNA和化學(xué)發(fā)光兩種信號(hào)放大技術(shù)達(dá)到檢測(cè)微量樣本的能力，克服了傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)PCR技術(shù)中操作復(fù)雜、易污染的弊端。該研究結(jié)果顯示，HPV E6/E7 mRNA的水平隨宮頸病變級(jí)別的升高而升高，且CIN3以上病變組HPV E6/E7 mRNA的陽(yáng)性率高于對(duì)照組，與上述理論及作者以往的研究[17]一致，也與有關(guān)研究[18-19]結(jié)果相似。

此外，該研究結(jié)果還顯示：HPV-16 L1甲基化程度與HPV-16 E6/E7 mRNA水平呈正相關(guān)；在對(duì)CIN2以上病變檢測(cè)時(shí)，兩種方法及兩種方法聯(lián)合檢測(cè)的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值間無(wú)明顯差異，說明兩種方法及兩種方法聯(lián)合對(duì)宮頸病變?cè)\斷具有相同作用。

綜上所述，HPV-16 L1甲基化與HPV E6/E7 mRNA與宮頸癌病變關(guān)系密切，在分流HPV感染患者方面應(yīng)具有良好的臨床應(yīng)用前景。HPV-16 L1甲基化檢測(cè)或HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)可與HPV DNA檢測(cè)互為補(bǔ)充，為婦科醫(yī)師臨床診治HPV感染患者及評(píng)估臨床療效提供依據(jù)。

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(2015-04-22收稿責(zé)任編輯徐春燕)

*河南省科技廳基礎(chǔ)科技攻關(guān)課題資助項(xiàng)目122300410036

Clinical value of HPV-16 L1 methylation and HPV E6/E7 mRNA testing in detection of cervical lesions

LIXiaofu，QIUCui，ZHIYanfang，LIYa，RONGShouhua，F(xiàn)ANTingting

DepartmentofCytopathology,theThirdAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordshuman papillomavirus;cervical lesion;HPV-16 L1 methylation;HPV E6/E7 mRNA

中圖分類號(hào)R737.3

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.012