Slug蛋白、E-鈣黏蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其與肺癌預(yù)后的關(guān)系*

岳銀艷，吳秋歌，田文嫻，周　璐，郭亞濤，黃亞輝，王　靜

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450052

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Slug蛋白、E-鈣黏蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其與肺癌預(yù)后的關(guān)系*

岳銀艷，吳秋歌，田文嫻，周璐，郭亞濤，黃亞輝，王靜#

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450052

關(guān)鍵詞Slug蛋白；E-鈣黏蛋白；非小細(xì)胞肺癌；無(wú)進(jìn)展生存期

摘要目的：測(cè)定非小細(xì)胞肺癌組織中Slug蛋白、E-鈣黏蛋白的表達(dá)水平，探討二者與肺癌預(yù)后的關(guān)系。方法：采用免疫組化法檢測(cè)68例非小細(xì)胞肺癌及30例癌旁組織中Slug蛋白、E-鈣黏蛋白的表達(dá)情況。分析2種蛋白表達(dá)與臨床病理特征及無(wú)進(jìn)展生存期的關(guān)系。結(jié)果：非小細(xì)胞肺癌組織中Slug蛋白、E-鈣黏蛋白的表達(dá)與癌旁組織中的表達(dá)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。Slug蛋白、E-鈣黏蛋白的表達(dá)均與非小細(xì)胞肺癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。非小細(xì)胞肺癌組織中Slug蛋白與E-鈣黏蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rS=-0.228，P=0.010)。Slug蛋白陽(yáng)性表達(dá)的患者無(wú)進(jìn)展生存期為11個(gè)月，陰性表達(dá)的患者為17個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)；E-鈣黏蛋白陽(yáng)性表達(dá)的患者無(wú)進(jìn)展生存期為13個(gè)月，陰性表達(dá)的患者為11個(gè)月，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。結(jié)論：Slug蛋白、E-鈣黏蛋白在非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展過(guò)程中起重要作用，兩者可能存在相互作用，且與患者無(wú)進(jìn)展生存期密切相關(guān)，可作為判斷非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的標(biāo)志物。

AbstractAim: To investigate the expressions of Slug and E-cadherin and the relationship with the prognosis in non-small-cell lung cancer(NSCLC). Methods: The expressions of Slug and E-cadherin in 68 specimens of NSCLC and 30 specimens of adjacent normal tissue were detected by immunohistochemistry. The relationship among the two kinds of protein expression and clinical pathological parameters and progression free survival(PFS) were analyzed. Results: There were significant difference in the expressions of the two proteins between the lung cancer tissue and adjacent normal tissue(P<0.001). The expressions of Slug and E-cadherin proteins were closely related with TNM stages and lymph node metastasis(P<0.05). The expression of Slug was negatively correlated with that of E-cadherin(rS=-0.228，P=0.010). The PFS of patients with positive expression of Slug protein was 11 months, while patients with negative expression was 17 months. and the difference was significant(P=0.036). The PFS of patients with positive expression of E-cadherin protein was 13 months, while patients with negative expression was 11 months,and the difference was significant(P=0.003). Conclusion: Slug and E-cadherin play important roles in the development of NSCLC, which are closely related with the PFS of NSCLC patients. They might be used as biomarkers in judging the prognosis of NSCLC.

目前，肺癌是世界上引起死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌的85%[1]。肺癌的轉(zhuǎn)移特性與其預(yù)后密切相關(guān)。肺癌的轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的、由多種基因調(diào)控的多階段、多步驟過(guò)程。其中，上皮細(xì)胞-間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)型(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)在惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而細(xì)胞間的黏附性降低是極其重要的一個(gè)步驟。上皮E-鈣黏蛋白(E-cadherin，EC)可抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，其表達(dá)下降或缺失可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[2]。鋅指轉(zhuǎn)錄因子Slug蛋白是Snail鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員，可以通過(guò)與EC啟動(dòng)子區(qū)域的E-boxes結(jié)合而抑制EC的表達(dá)[3]。作者采用免疫組化SP方法檢測(cè)了68例NSCLC標(biāo)本及30例癌旁組織標(biāo)本中Slug蛋白和EC表達(dá)情況，探討這2種蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料收集2011年1月至2013年4月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的NSCLC標(biāo)本68例，患者術(shù)前均未行放療及化療。所有肺癌組織標(biāo)本均以體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定，石蠟包埋，經(jīng)蘇木精-伊紅染色病理學(xué)確診。68例患者中，男51例，女17例；年齡39～77(59.76±8.60)歲；病理類型包括鱗癌30例，腺癌38例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者28例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者40例；TNM分期Ⅰ-Ⅱ期51例，Ⅲ期17例。另取其他NSCLC患者的癌旁組織30例作為對(duì)照。所有患者術(shù)后分別正規(guī)化療4周期，化療方案分別為吉西他濱+奧沙利鉑、多西他賽+奈達(dá)鉑、培美曲賽+奈達(dá)鉑、吉西他濱+奈達(dá)鉑、多西他賽+順鉑；均未行生物治療及靶向治療。

1.2Slug和EC蛋白的免疫組化SP法檢測(cè)石蠟標(biāo)本5 μm厚連續(xù)切片，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。Slug、EC兔抗人單克隆抗體均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(均按1300稀釋)，二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，每批實(shí)驗(yàn)均以北京博奧森公司提供的陽(yáng)性對(duì)照片做陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗做陰性對(duì)照。最后以DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察染色情況。Slug蛋白陽(yáng)性染色為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒；EC蛋白陽(yáng)性染色為細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，部分間質(zhì)、炎細(xì)胞及血管上皮細(xì)胞上也可見(jiàn)蛋白染色。參照賀榮芳等[4]描述的分級(jí)方法，每例切片選取5個(gè)高倍視野進(jìn)行結(jié)果判定。根據(jù)細(xì)胞被染色強(qiáng)度及染色細(xì)胞所占百分比之積來(lái)判斷結(jié)果。染色強(qiáng)度可分為4級(jí)：0分為未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，1分為弱陽(yáng)性，2分為中等陽(yáng)性，3分為為強(qiáng)陽(yáng)性。陽(yáng)性染色細(xì)胞所占百分比可分為5級(jí)：0分為無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，1分為<10%，2分為10%～，3分為50%～，4分為>80%。其中染色強(qiáng)度與染色細(xì)胞所占百分比之積≥3分為陽(yáng)性，<3為陰性，對(duì)相關(guān)資料進(jìn)行定量積分并計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率[5]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 15.0進(jìn)行分析，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)比較NSCLC組織及癌旁組織中Slug和EC蛋白表達(dá)的差異，并分析其與NSCLC患者各臨床病理特征之間的關(guān)系，應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析NSCLC組織中Slug和EC蛋白表達(dá)的相關(guān)性，應(yīng)用Kaplan-Meier法對(duì)NSCLC患者進(jìn)行單因素生存分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

A：腺癌組織；B：鱗癌組織；C：癌旁組織。1：Slug蛋白；2：EC蛋白。 圖1　肺腺癌、鱗癌和癌旁組織中Slug、EC蛋白的表達(dá)(SP，×400)

2.1NSCLC組織及癌旁組織中Slug和EC蛋白的表達(dá)Slug蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，呈棕黃色(圖1上排)。EC蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，呈棕黃色(圖1下排)；在NSCLC癌組織及癌旁組織， Slug蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為67.6%(46/68)和13.3%(4/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.573，P<0.001)；EC蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為50.0%(34/68)和90%(27/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.172，P<0.001)。

2.2NSCLC組織中Slug和EC蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系見(jiàn)表1。

表1　Slug和EC蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

2.3NSCLC組織中Slug和EC蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，NSCLC組織中Slug與EC蛋白的表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)(rS=-0.228，P=0.010)。

2.4Slug和EC蛋白表達(dá)與無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)的關(guān)系見(jiàn)圖2。Slug蛋白陽(yáng)性與陰性表達(dá)的中值PFS分別為11和17個(gè)月，2組的PFS曲線比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.418，P=0.036)；EC蛋白陽(yáng)性與陰性表達(dá)的中值PFS分別為13和11個(gè)月，2組的PFS曲線比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.064，P=0.003)。

圖2　Slug蛋白(上)和EC蛋白(下)表達(dá)與NSCLC患者PFS的關(guān)系

3討論

EMT是胚胎正常發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵步驟，對(duì)于原腸胚的發(fā)生發(fā)育、心臟的形成、神經(jīng)脊的形成等發(fā)揮了重要作用[6]。研究[7]表明EMT可增加細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起了極其重要的作用。通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，腫瘤細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特征，從而變得更有活動(dòng)性和侵襲性[8]。EMT的主要特點(diǎn)之一是上皮細(xì)胞表達(dá)的位于其細(xì)胞膜的黏附分子——EC表達(dá)的下調(diào)。EC是鈣黏附蛋白分子家族中跨膜蛋白亞型的一種，是經(jīng)典的轉(zhuǎn)移抑制因子，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附具有重要作用[9]。EC低表達(dá)或缺失可使腫瘤細(xì)胞喪失接觸抑制，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限制增殖，失去分化，極易發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[10]。該研究結(jié)果顯示，在30例癌旁組織中，EC主要位于細(xì)胞膜上，表達(dá)率為90%，而在腫瘤組織中EC的表達(dá)率降低，為50%，且其表達(dá)率隨著NSCLC的分期增加而減少，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)率低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。其中，EC陽(yáng)性表達(dá)患者的PFS較陰性表達(dá)患者長(zhǎng)，提示EC的陰性表達(dá)可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。

EC的表達(dá)下調(diào)主要通過(guò)EC轉(zhuǎn)錄抑制子與其啟動(dòng)子的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)[11]。E-鈣黏附轉(zhuǎn)錄抑制子包括Zeb家族、Snail1、Slug蛋白、Twist等[12]。其中Slug蛋白能識(shí)別通用的E2-盒元件以抑制靶基因EC的轉(zhuǎn)錄。有研究[13]發(fā)現(xiàn)，在人乳腺癌細(xì)胞系中敲除Slug基因后可以完全阻斷Twist1對(duì)EC的轉(zhuǎn)錄抑制作用，證實(shí)Slug蛋白對(duì)EC轉(zhuǎn)錄的抑制作用。該研究結(jié)果顯示，腫瘤組織中Slug蛋白的表達(dá)高于癌旁組織，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移組，Ⅲ期組高于Ⅰ-Ⅱ組，提示Slug蛋白的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

目前，對(duì)Slug和EC蛋白在NSCLC的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移之間關(guān)系的研究較少，尤其相關(guān)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究更加少見(jiàn)。Fernando等[14]發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子Slug蛋白可抑制EC的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生。Slug蛋白的表達(dá)增加和EC的細(xì)胞膜表達(dá)量減少可能降低腫瘤細(xì)胞間的黏附力，使腫瘤細(xì)胞失去上皮細(xì)胞極性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使腫瘤細(xì)胞更容易浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移；并且通過(guò)Slug和EC蛋白兩者之間的相互作用，更有助于腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[15-16]。該研究中，Slug蛋白的表達(dá)在肺癌組織中高于癌旁組織，與EC蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明Slug蛋白高表達(dá)與肺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移相關(guān)，與Fernando等[14]研究結(jié)果相符。

研究肺癌的預(yù)后，可以較為客觀地評(píng)價(jià)其臨床治療效果，并權(quán)衡其治療方法是否恰當(dāng)。因此，探索肺癌的相關(guān)預(yù)后指標(biāo)對(duì)于完善多學(xué)科綜合治療方案，提高治療效果具有重要意義。作者發(fā)現(xiàn)，影響NSCLC患者生存時(shí)間的因素包括Slug蛋白表達(dá)、EC蛋白表達(dá)、分期和轉(zhuǎn)移情況，而與患者性別、年齡、病理分型無(wú)關(guān)。由此可推測(cè)，Slug、EC蛋白的聯(lián)合檢測(cè)將有利于臨床上預(yù)測(cè)患者的預(yù)后，并有可能成為判斷肺癌預(yù)后的新指標(biāo)。

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(2015-06-02收稿責(zé)任編輯趙秋民)

*河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目142300410032

Expressions of Slug and E-cadherin in non-small cell lung cancer tissue and its relationship with prognosis

YUEYinyan，WUQiuge，TIANWenxian，ZHOULu，GUOYatao，HUANGYahui，WANGJing

DepartmentofRespiratoryDiseases，theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordsSlug; E-cadherin; non-small-cell lung cancer; progression free survival

中圖分類號(hào)R734.2

通信作者#，女，1958年11月生，博士，教授，研究方向：肺癌的發(fā)病機(jī)制和早期預(yù)警，E-mail：wangjing@zzu.edu.cn

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.009