光照強(qiáng)度及鹽濃度對杜氏鹽藻生長及β-胡蘿卜素積累的影響*

劉　真，劉姍姍，張玉潔，朱相展，張彥婷，李慶華，馬珊珊，張　琨，關(guān)方霞

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001　2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

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光照強(qiáng)度及鹽濃度對杜氏鹽藻生長及β-胡蘿卜素積累的影響*

劉真1)，劉姍姍1)，張玉潔1)，朱相展1)，張彥婷1)，李慶華1)，馬珊珊1)，張琨1)，關(guān)方霞1,2)#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 4500012)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

關(guān)鍵詞杜氏鹽藻；β-胡蘿卜素

摘要目的：探討光照強(qiáng)度和鹽濃度對杜氏鹽藻生長和細(xì)胞內(nèi)β-胡蘿卜素積累的影響。方法：檢測正常培養(yǎng)條件下杜氏鹽藻生長情況和β-胡蘿卜素變化，不同濃度(0.5、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mol/L)NaCl培養(yǎng)后細(xì)胞內(nèi)β-胡蘿卜素的積累情況。采用高光(5 000～6 000 Lux)、高鹽(3.5 mol/L NaCl)及高光高鹽條件對培養(yǎng)至對數(shù)生長末期的杜氏鹽藻進(jìn)行β-胡蘿卜素積累的誘導(dǎo)。結(jié)果：正常條件下杜氏鹽藻培養(yǎng)2 周后進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞內(nèi)β-胡蘿卜素含量呈先下降后上升趨勢，第9 天達(dá)到最大值，隨后出現(xiàn)小幅度波動(dòng)；杜氏鹽藻細(xì)胞內(nèi)β-胡蘿卜素含量隨NaCl濃度升高而升高，二者呈正相關(guān)(r=0.969，P<0.001)。與正常條件相比，高光、高鹽單獨(dú)作用均能夠提高細(xì)胞內(nèi)β-胡蘿卜素含量，而高光高鹽聯(lián)合作用最有利于杜氏鹽藻細(xì)胞β-胡蘿卜素的積累。結(jié)論：高光高鹽聯(lián)合作用可作為杜氏鹽藻細(xì)胞內(nèi)β-胡蘿卜素的最佳誘導(dǎo)條件。

AbstractAim: To study the effects of light and salt concentration on the growth of Dunaliella salina and intracellular accumulation of β-carotene. Methods: The growth of Dunaliella salina and change of β-carotene content were measured under normal culture conditions. And the accumulation of β-carotene under different salt concentrations(0.5，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mol/L) was detected. Then high-light(5 000-6 000 Lux), high-salt(3.5 mol/L NaCl) and high-light plus high-salt conditions were used to induce β-carotene accumulation. Results: Under normal conditions, Dunaliella salina grew to the stable phase after 2 weeks of cultivation,the intracellular β-carotene content was decreased at first and then increased,on the 9th day the content reached a maximum followed by a slight fluctuation. The β-carotene content of cells increased with increasing salt concentration, indicating that the two indexes were positively correlated(r=0.969，P<0.001). Furthermore, the results of induction experiments showed that the β-carotene content increased in both high-light and high-salt conditions, compared with normal conditions. And the combination of high-salt and high-light was most favorable to β-carotene accumulation. Conclusion: The combined high-light and high-salt might be the optimal induction conditions for β-carotene accumulation in Dunaliella salina,which provides a theoretical basis for the industrial production of Dunaliella salina.

杜氏鹽藻是一種極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的單細(xì)胞真核綠藻[1-2]，它主要分布在海洋、鹽湖等鹽水水體中[3]，是目前世界上最耐鹽的真核光合生物[4]。在一定條件下，β-胡蘿卜素含量可高達(dá)杜氏鹽藻細(xì)胞干重的10%左右[5]，因而杜氏鹽藻是目前公認(rèn)的商業(yè)化生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素的理想資源。β-胡蘿卜素是一種親脂性的高價(jià)值化合物[6]，作為著色劑、抗氧化劑和抗衰老劑，被廣泛應(yīng)用在食品、化妝品和制藥工業(yè)[7-9]。β-胡蘿卜素具有清除氧自由基的能力[10]，是維護(hù)人體健康不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，在抗癌、預(yù)防心血管疾病、白內(nèi)障及抗氧化方面具有顯著的作用，可防止老化和衰老引起的多種退化性疾病[11-12]。目前，包括美國、以色列、澳大利亞、印度等在內(nèi)的許多國家都相繼開展了大規(guī)模鹽藻β-胡蘿卜素生產(chǎn)特性研究，并已進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)[13-15]。我國具有漫長的海岸線和許多內(nèi)陸鹽湖，具有培養(yǎng)杜氏鹽藻，生產(chǎn)β-胡蘿卜素的得天獨(dú)厚的自然條件。該研究以杜氏鹽藻UTEX-1644為對象，通過觀察杜氏鹽藻在正常條件和不同鹽濃度培養(yǎng)過程中β-胡蘿卜素含量的變化，并比較高光、高鹽及高光高鹽3種脅迫條件下β-胡蘿卜素的積累情況，探討杜氏鹽藻β-胡蘿卜素的積累規(guī)律，從而確定β-胡蘿卜素積累的最佳條件，為建立高產(chǎn)β-胡蘿卜素的杜氏鹽藻提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1藻種與主要試劑杜氏鹽藻藻株為UTEX-1644，購自美國Texas大學(xué)。NaCl、KNO3、MgSO4、KH2PO4、FeCl3、CaCl2、丙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2杜氏鹽藻培養(yǎng)杜氏鹽藻培養(yǎng)使用UTEX-1644液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成包括：NaCl 1.5 mol/L，KNO350 mmol/L，MgSO42 μmol/L，KH2PO45 mmol/L，F(xiàn)eCl36 μmol/L，CaCl25 mmol/L，微量元素母液。通過調(diào)節(jié)NaCl含量改變培養(yǎng)基鹽濃度。配制完成后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌(121 ℃、30 min)，完成后待其冷卻，用0.1 mol/L的NaHCO3調(diào)pH至7.5左右。培養(yǎng)條件：取對數(shù)生長期杜氏鹽藻接種于含有100 mL UTEX-1644培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，溫度25.7 ℃，光暗比12 h12 h，光照強(qiáng)度3 000～4 000 Lux，每天振蕩2次。

1.3不同NaCl濃度對杜氏鹽藻細(xì)胞β-胡蘿卜素含量的影響將杜氏鹽藻于含不同濃度(0.5、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mol/L)NaCl的UTEX-1644培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，于對數(shù)生長期末收集并檢測杜氏鹽藻細(xì)胞中β-胡蘿卜素的含量。

1.4脅迫條件下誘導(dǎo)β-胡蘿卜素積累杜氏鹽藻藻液一部分分裝于250 mL培養(yǎng)瓶中，每瓶100 mL，分別在正常條件(光強(qiáng)3 000～4 000 Lux，NaCl 1.5 mol/L)、高光培養(yǎng)條件(光強(qiáng)5 000～6 000 Lux，NaCl 1.5 mol/L)下誘導(dǎo)β-胡蘿卜素的積累；另一部分離心，重懸后分裝于含有100 mL UTEX-1644液體培養(yǎng)基的250 mL培養(yǎng)瓶中，分別在正常條件(光強(qiáng)3 000～4 000 Lux，NaCl 1.5 mol/L)、高鹽培養(yǎng)條件(光強(qiáng)3 000～4 000 Lux，NaCl 3.5 mol/L)及高光高鹽條件(光強(qiáng)5 000～6 000 Lux，NaCl 3.5 mol/L)下誘導(dǎo)β-胡蘿卜素的積累，每組重復(fù)3次。

1.5鹽藻細(xì)胞密度的測定取1 mL藻液，加入0.2 mL甲醛固定，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，重復(fù)3次。同時(shí)，測定同一樣品在750 nm處的吸光度，重復(fù)3次。以光密度(OD750 nm)值為橫坐標(biāo)、藻細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞密度-光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6β-胡蘿卜素含量的測定取1.5 mL藻液離心去上清，加入體積分?jǐn)?shù)80%的丙酮，使藻體充分溶解在丙酮液體中，黑暗環(huán)境下靜置5 min，離心，使沉淀呈灰白色，測定上清450 nm處吸光度(A450 nm)值。根據(jù)Jensen公式[16]換算出每個(gè)細(xì)胞中β-胡蘿卜素的含量。

2結(jié)果

2.1杜氏鹽藻細(xì)胞密度與光密度關(guān)系見圖1，杜氏鹽藻的細(xì)胞密度與OD750 nm具有較好的線性關(guān)系。

圖1　杜氏鹽藻細(xì)胞密度與光密度(OD750 nm)值關(guān)系

2.2杜氏鹽藻在正常條件下的生長情況及β-胡蘿卜素含量變化正常條件下培養(yǎng)，鹽藻細(xì)胞在接種后的5 d左右進(jìn)入對數(shù)生長期，可維持1周左右;在第14天左右達(dá)到對數(shù)生長末期，之后進(jìn)入穩(wěn)定期(圖2)。培養(yǎng)初期每細(xì)胞內(nèi)β-胡蘿卜素含量驟減，隨后逐漸增加，在第9 天達(dá)到最大值，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長呈小幅度波動(dòng)(圖3)。

圖2　正常條件下杜氏鹽藻的生長曲線

圖3　正常條件下杜氏鹽藻細(xì)胞中β-胡蘿卜素的含量變化

2.3杜氏鹽藻在不同NaCl濃度下β-胡蘿卜素的積累變化隨著鹽濃度的升高，單個(gè)細(xì)胞中β-胡蘿卜素含量不斷增加，二者呈正相關(guān)(r=0.969,P<0.001)。

2.4杜氏鹽藻在誘導(dǎo)環(huán)境下β-胡蘿卜素的積累情況將培養(yǎng)至對數(shù)生長末期的杜氏鹽藻細(xì)胞分別轉(zhuǎn)入高光、高鹽、高光高鹽三種條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，細(xì)胞內(nèi)β-胡蘿卜素含量見圖4。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入高光誘導(dǎo)條件下，細(xì)胞內(nèi)β-胡蘿卜素含量迅速增加，3 h時(shí)達(dá)到最大值，隨后逐漸下降至正常水平。正常培養(yǎng)下細(xì)胞內(nèi)β-胡蘿卜素含量增幅較小。轉(zhuǎn)入高鹽和高光高鹽誘導(dǎo)條件后，由于離心和更換新鮮培養(yǎng)基，為適應(yīng)細(xì)胞損傷和新環(huán)境，在更換培養(yǎng)基3 h內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)β-胡蘿卜素含量下降，隨后大幅增加，9 h后趨勢變緩，高光高鹽誘導(dǎo)效果明顯，β-胡蘿卜素含量明顯高于對照組。高光、高鹽單獨(dú)作用均能促進(jìn)細(xì)胞中β-胡蘿卜素的積累，且二者聯(lián)合作用效果更為顯著。

圖4　不同誘導(dǎo)環(huán)境下杜氏鹽藻細(xì)胞中β-胡蘿卜素的含量

3討論

β-胡蘿卜素作為微生素A原，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)認(rèn)定的A類營養(yǎng)食品強(qiáng)化劑。作為藥物，β-胡蘿卜素已被美國藥典、歐洲藥典和英國藥典正式收載。β-胡蘿卜素可降低人癌癥發(fā)生率[17]。國內(nèi)外大量研究[18]證實(shí)，β-胡蘿卜素能夠抑制腫瘤形成，具有抗輻射和抵抗某些化學(xué)物質(zhì)致癌的作用。因其具有較好的淬滅單線態(tài)氧清除自由基抑制脂質(zhì)過氧化作用，可用于預(yù)防和治療心血管疾病、白內(nèi)障等多種衰老引起的退化性疾病[19]。

杜氏鹽藻中β-胡蘿卜素是光合作用的捕光輔助色素，并能保護(hù)光合作用的反應(yīng)器不受光抑制[20]。當(dāng)杜氏鹽藻處于某種不利生長的條件(即脅迫條件)下，就會(huì)出現(xiàn)乙酰輔酶A的積累并導(dǎo)致β-胡蘿卜素的合成和積累。在適當(dāng)條件下，杜氏鹽藻細(xì)胞中β-胡蘿卜素含量可達(dá)細(xì)胞干重的10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))[5]。因此，杜氏鹽藻是天然β-胡蘿卜素的理想來源。

該研究結(jié)果表明，在正常培養(yǎng)條件下，細(xì)胞中能夠積累少量β-胡蘿卜素，且鹽藻生長和β-胡蘿卜素累積存在一定關(guān)系，當(dāng)細(xì)胞快速生長時(shí)，β-胡蘿卜素的累積較少，而當(dāng)細(xì)胞生長緩慢或生長受到抑制時(shí)，β-胡蘿卜素開始大量累積。此外，提高培養(yǎng)基中鹽濃度，能夠顯著影響細(xì)胞中β-胡蘿卜素的積累，二者呈正相關(guān)。說明高鹽脅迫有利于藻細(xì)胞積累β-胡蘿卜素，然而高鹽條件下藻細(xì)胞生長受到明顯抑制。實(shí)踐中，為提高杜氏鹽藻β-胡蘿卜素產(chǎn)量，需要同時(shí)滿足兩方面條件，一是獲得較高的生物量，二是提高單位細(xì)胞內(nèi)β-胡蘿卜素含量。因此，作者選擇在杜氏鹽藻正常培養(yǎng)至對數(shù)生長末期，得到較高藻細(xì)胞密度后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入脅迫條件下，誘導(dǎo)細(xì)胞中β-胡蘿卜素的積累。該研究結(jié)果表明，對數(shù)生長末期的藻細(xì)胞轉(zhuǎn)入不同條件下誘導(dǎo)后， 高光、高鹽均能夠明顯提高細(xì)胞中β-胡蘿卜素含量，且二者共同作用時(shí)效果更為顯著。已有研究[20-21]表明，β-胡蘿卜素在光氧化過程中具有清除氧自由基的能力，它能保護(hù)光系統(tǒng)免受光氧化的破壞，同時(shí)其含量與光合效率指數(shù)負(fù)相關(guān)，因此提高光強(qiáng)能夠有效促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)β-胡蘿卜素的積累。此外，有研究[21]表明，高鹽脅迫過程中細(xì)胞內(nèi)能夠檢測到一種大小約15 000的蛋白的表達(dá)，該蛋白參與β-胡蘿卜素合成，但具體作用和機(jī)制尚不清楚。同時(shí)，該研究結(jié)果顯示，相比于高鹽誘導(dǎo)，高光作用能夠在較短時(shí)間內(nèi)對β-胡蘿卜素的積累發(fā)揮明顯的促進(jìn)效果。

綜上所述，通過觀察不同培養(yǎng)條件及不同誘導(dǎo)條件對杜氏鹽藻細(xì)胞內(nèi)β-胡蘿卜素積累的影響，初步確定以高光高鹽聯(lián)合作用作為其最佳誘導(dǎo)條件，從而為建立高產(chǎn)β-胡蘿卜素的杜氏鹽藻培養(yǎng)體系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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*大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目201410459052

Effects of light intensity and salt concentration on growth of Dunaliella salina and accumulation of β-carotene

LIUZhen1),LIUShanshan1),ZHANGYujie1),ZHUXiangzhan1),ZHANGYanting1),LIQinghua1),MAShanshan1),ZHANGKun1),GUANFangxia1,2)

1)CollegeofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsDunaliella salina;β-carotene

中圖分類號(hào)Q945.1

通信作者#，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：生物醫(yī)學(xué)，E-mail:guanfangxia@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.008