豫醫(yī)卷毛大鼠無毛基因cDNA序列的比較生物學(xué)分析*

張明昊，章金濤

1)河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450046　2)鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心 鄭州 450052

△男，1982年7月生，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：動物遺傳學(xué)，E-mail:zhangminghao@139.com

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豫醫(yī)卷毛大鼠無毛基因cDNA序列的比較生物學(xué)分析*

張明昊1)△，章金濤2)

1)河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室 鄭州 4500462)鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心 鄭州 450052

△男，1982年7月生，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：動物遺傳學(xué)，E-mail:zhangminghao@139.com

關(guān)鍵詞卷毛大鼠；無毛基因；同源性比較

摘要目的：對豫醫(yī)卷毛大鼠的無毛(Hr)基因進(jìn)行比較生物學(xué)分析。方法：采用PCR方法對豫醫(yī)卷毛大鼠Hr基因的cDNA序列進(jìn)行克隆、測序，并與BN大鼠、小家鼠、野豬、家牛、普通獼猴、人、黑腹果蠅和桔小實(shí)蠅的Hr 基因cDNA序列及其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)遺傳學(xué)分析。結(jié)果：獲得了豫醫(yī)卷毛大鼠Hr基因全長5 232 bp的cDNA序列(GenBank登錄號：KR109217)。豫醫(yī)卷毛大鼠Hr cDNA與BN大鼠、小家鼠、野豬、家牛、普通獼猴、人、黑腹果蠅和桔小實(shí)蠅的同源性分別為99.8%、87.3%、67.3%、70.2%、80.8%、79.8%、29.8%和24.9%，氨基酸序列的同源性分別為100.0%、92.9%、75.4%、74.8%、76.0%、77.8%、7.4%和11.7%。結(jié)論：Hr基因在哺乳動物中具有一定的保守性，與昆蟲等非哺乳類動物之間具有較大的差異性。

AbstractAim: To study the difference of hairless (Hr) gene and its coding between Yuyi curly hair rats and other species. Methods: PCR technique was developed to clone the sequence of cDNA of Hr gene from Yuyi curly hair rats, and biologic characters of nucleotide and amino acid sequence encoding Hr gene in different species(rattus norvegicus, mus musculus, sus scrofa, bos taurus, macaca mulatta, homo sapiens, D.melanogaster and Bactrocera dorsalis) were analyzed.Results: The full-length of cDNA sequence of Hr gene from Yuyi curly hair rats was 5 232 bp(Accession Number: KR109217). The Hr gene nucleotide homology of Yuyi curly hair rats to rattus norvegicus, mus musculus, sus scrofa, bos taurus, macaca mulatta, homo sapiens, D.melanogaster and Bactrocera dorsalis was 99.8%, 87.3%, 67.3%, 70.2%, 80.8%, 79.8%, 29.8% and 24.9%, and that of amino acid sequences was 100.0%, 92.9%, 75.4%, 74.8%, 76.0%, 77.8%, 7.4% and 11.7%, respectively. Conclusion: A certain degree of conservation of Hr gene exists among different mammalian taxons, but there is some specificity from non-mammals.

無毛(hairless，Hr)基因是皮膚和被毛結(jié)構(gòu)形成過程中重要的調(diào)節(jié)基因之一[1]，其編碼的Hr蛋白在皮膚、腦、腸、肺、肌肉、垂體中表達(dá)，以皮膚和腦部的表達(dá)量較高，并在毛囊中呈現(xiàn)周期性的表達(dá)變化[2]。Hr蛋白的精確功能尚不完全清楚，但根據(jù)基因結(jié)構(gòu)分析，推測其可能屬于轉(zhuǎn)錄因子GATA家族，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用，控制著動物出生后的第一次毛發(fā)生長周期轉(zhuǎn)換，與毛囊生長退行期中角質(zhì)細(xì)胞的凋亡有關(guān)[3-4]。有報道[5]指出，Hr基因12外顯子上的第3 110位終止密碼子突變會導(dǎo)致小鼠的皮膚和被毛結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變，從而使小鼠出現(xiàn)類似人的丘疹性無毛癥的表型。豫醫(yī)卷毛大鼠(Yuyi curly hair rat，YCHR)是在SD大鼠繁殖種群中發(fā)現(xiàn)的一種被毛和胡須均發(fā)生彎曲的基因突變大鼠，經(jīng)遺傳測交實(shí)驗(yàn)證實(shí)該卷毛性狀受常染色體上單一顯性基因控制，呈現(xiàn)半顯性遺傳[6-7]。考慮到Hr基因在毛發(fā)生長發(fā)育過程中的生物學(xué)作用，作者克隆了YCHR Hr基因的cDNA序列，并與GenBank上發(fā)布的其他物種的Hr基因cDNA序列進(jìn)行了同源性比較，以期進(jìn)一步揭示該基因在生物體生長發(fā)育過程中的作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑8周齡YCHR 10只，雌雄各半，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，一級環(huán)境條件下飼養(yǎng)。Taq聚合酶、10×PCR Buffer (100 mmol/L Tris-HCl， pH 8.8，25 ℃；500 mmol/L KCl；體積分?jǐn)?shù)0.8% Nonidet)、MgCl2(25 mmol/L)、dNTP(10 mmol/L)、DNA Marker、6×DNA Loading Dye、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒等均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司。

1.2DNA的提取及處理處死YCHR后立即取腦組織，用液氮速凍后貯存于液氮罐中，用DNA提取試劑盒提取總DNA，-80 ℃冰箱中保存待用。

1.3Hr基因cDNA的擴(kuò)增及測序根據(jù)GenBank上發(fā)表的大鼠Hr基因的cDNA序列(GenBank登錄號：NM001276440)，采用DNAStar軟件包的PrimerSelect程序設(shè)計(jì)了11對重疊引物(表1)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，Taq Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，5 U/μL Taq聚合酶0.5 μL，ddH2O 35.5 μL，總體系為50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，56～60 ℃退火35 s，72 ℃延伸50～90 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃修復(fù)延伸8～10 min，4 ℃保存。然后，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，并送上海生工生物工程技術(shù)公司雙向測序。

表1　擴(kuò)增Hr基因cDNA序列所用引物

1.4Hr基因cDNA序列的比較生物學(xué)分析將獲得的cDNA序列在GenBank上進(jìn)行BLAST初步比對分析，然后再根據(jù)序列重疊區(qū)域拼接YCHR Hr基因cDNA完整序列，并下載BN大鼠(GenBank登錄號：U71293)、小家鼠(GenBank登錄號：BC049182)、野豬(GenBank登錄號：EF405626)、家牛(GenBank登錄號：BC150129)、普通獼猴(GenBank登錄號：AF361864)、人(GenBank登錄號：AJ277165)、黑腹果蠅(GenBank登錄號：X67239)和桔小實(shí)蠅(GenBank登錄號：XM011207671)的Hr基因cDNA序列，采用DNAman和DNAStar軟件進(jìn)行同源性比對和系統(tǒng)遺傳學(xué)分析。

2結(jié)果

2.1YCHR Hr基因cDNA的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，均得到明顯特異性的目的條帶，產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果相一致(圖1)。測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對分析，確認(rèn)為Hr基因序列。序列拼接顯示YCHR Hr基因的完整cDNA序列長5 232 bp(GenBank登錄號：KR109217)。

M:Marker;1～11：分別為Hr-1至Hr-11擴(kuò)增產(chǎn)物。圖1　YCHR PCR電泳結(jié)果

2.2Hr基因的比較生物學(xué)分析結(jié)果見表2、3，系統(tǒng)遺傳分析結(jié)果見圖2。Hr基因的系統(tǒng)遺傳分析結(jié)果顯示，YCHR與BN大鼠處于一個分支，和小家鼠的親緣關(guān)系較近，野豬和家牛、人和普通獼猴分別處于獨(dú)立分支，這些哺乳動物分支之間有70%左右的同源性;黑腹果蠅和桔小實(shí)蠅處于另外的獨(dú)立分支。

表2　YCHR與其他物種Hr

1：YCHR； 2：BN大鼠(U71293)；3：小家鼠(BC049182)；4：野豬(EF405626)；5：家牛(BC150129)；6：普通獼猴(AF361864)；7：人(AJ277165)；8：黑腹果蠅(X67239)；9：桔小實(shí)蠅(XM011207671)。

表3　YCHR與其他物種

1：YCHR； 2：BN大鼠(AAC53018)；3：小家鼠(AAH49182)；4：野豬(ABN80094)；5：家牛(AAI50130)；6：普通獼猴(AAL56245)；7：人(CAB86602)；8：黑腹果蠅(CAA47664)；9：桔小實(shí)蠅(XP011205973)。

圖2　Hr基因同源序列的進(jìn)化分析

3討論

借助于自發(fā)的或誘導(dǎo)的毛發(fā)缺陷動物(如無毛動物、卷毛動物等)，人們可以研究毛發(fā)的形成及基因型與表現(xiàn)型的關(guān)系，并幫助人們揭示脫發(fā)、卷發(fā)等毛發(fā)異?，F(xiàn)象出現(xiàn)的原因[8]。小鼠的Hr基因序列是Cachon-Gonzalez等[3]聯(lián)合運(yùn)用PCR測序及外顯子捕獲技術(shù)確定的，而大鼠的Hr基因序列是在大鼠腦組織中克隆甲狀腺激素反應(yīng)相關(guān)基因時確定的[9]，它與小鼠的同源性較高，其編碼產(chǎn)物均含有由6個半胱氨酸組成的潛在的DNA結(jié)合鋅指結(jié)構(gòu)域，對毛囊間上皮細(xì)胞的增殖、分化和凋亡及維持毛乳頭與上皮結(jié)構(gòu)的完整性具有重要的生物學(xué)作用[10]。Hr基因功能降低將直接導(dǎo)致毛母質(zhì)細(xì)胞提前成熟并出現(xiàn)大量凋亡，毛囊隨之解體；而Hr基因表達(dá)產(chǎn)物的缺失將導(dǎo)致毛囊外根鞘內(nèi)發(fā)生凋亡的角化細(xì)胞數(shù)量增加，毛囊不能從出生后的第一次退行期中復(fù)蘇，導(dǎo)致毛發(fā)無法重新生長和分化，與此同時，Hr蛋白的缺失還會使真皮乳頭與其表面的毛囊上皮無法接觸，從而使毛球細(xì)胞大量死亡，毛囊上皮轉(zhuǎn)化為囊狀物，臨床表現(xiàn)為栗丘疹性的皮膚損傷[11-12]。Hr基因的突變一直是分子遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)，目前已發(fā)現(xiàn)了多種突變類型，如hairless(hrhr)突變、rhino hrrh突變、hrrh-J突變、hrrh Ch突變等，這些突變大多發(fā)生于小鼠，使突變小鼠脫去首次生長的被毛，出現(xiàn)類似于無毛小鼠的表型，而且隨著年齡增長，皮膚會變得松弛冗長，逐漸加厚，形成犀牛狀皺褶[13-15]。人Hr基因的多種形式的突變能導(dǎo)致伴丘疹性損害，出現(xiàn)先天性無毛癥(atrichia with popular lesions，APL)和先天性普禿(alopecia universalis congenita，AUC)這兩種遺傳性皮膚病[16-17]。

鑒于Hr基因在毛發(fā)生長發(fā)育過程中的重要作用，為了深入了解Hr基因組成差異，作者克隆了YCHR Hr基因cDNA序列共計(jì)5 232 bp，該基因編碼的Hr蛋白由1 207個氨基酸殘基組成。在此基礎(chǔ)上，作者對包括YCHR在內(nèi)的8個物種的9條Hr基因的cDNA序列及其編碼的Hr蛋白氨基酸序列進(jìn)行了同源性分析，發(fā)現(xiàn)YCHR Hr基因cDNA序列同GenBank上發(fā)布的BN大鼠、小家鼠、野豬、家牛、普通獼猴、人、黑腹果蠅和桔小實(shí)蠅的同源性分別為99.8%、87.3%、67.3%、70.2%、80.8%、79.8%、29.8%和24.9%，氨基酸序列同源性分別為100.0%、92.9%、75.4%、74.8%、76.0%、77.8%、7.4%和11.7%，表明Hr基因在哺乳動物中同源性較高，具有一定的保守性，其編碼蛋白可能具有相同的結(jié)構(gòu)域，如鋅指結(jié)構(gòu)等；而與昆蟲等非哺乳類動物的同源性較低，存在功能上的差異性。

近年來有報道[18]指出，某些高度保守的單分子進(jìn)化系統(tǒng)是研究相應(yīng)物種基因組水平的重要證據(jù)和線索，能夠簡便有效地揭示出某些基因及其編碼蛋白的生物學(xué)功能。進(jìn)一步分析Hr基因及其編碼蛋白的同源性，可以發(fā)現(xiàn)Hr基因在人類與各種模式生物，如大小鼠等存在著一定的序列與功能上的異同點(diǎn)，利用這一特點(diǎn)，可以把來源于不同模式生物的Hr基因作為人類Hr基因的天然突變體來進(jìn)一步研究該基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。

綜上所述，作者克隆并獲得了YCHR Hr基因cDNA的完整序列，該序列已提交給GenBank，并通過對不同物種Hr基因cDNA序列及其編碼的Hr蛋白氨基酸序列的同源性比較，初步了解了Hr基因在物種進(jìn)化上的同源性和保守性，為今后進(jìn)行Hr基因的多態(tài)性檢測及開展Hr基因與毛發(fā)生長發(fā)育和YCHR某些性狀的相關(guān)性研究提供了基礎(chǔ)性資料。

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(2015-04-21收稿責(zé)任編輯趙秋民)

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 31071923

Comparative biology analysis of hairless gene cDNA sequence in Yuyi curly hair rats

ZHANGMinghao1),ZHANGJintao2)

1)MedicalScienceFunctionLaboratory,SchoolofBasicMedicine,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou4500462)LaboratoryAnimalCenter,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordscurly hair rat; hairless gene; homology comparison

中圖分類號Q953

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.007 [15]ZARACH JM,BEAUN GM,COULOMBE PA,et al.The co-repressor hairless has a role in epithelial cell differentiation in the skin[J].Development,2004,131(17):4189