高血壓大鼠心肌組織中睪酮受體蛋白的表達(dá)*

李　淵，王　穎#，燕樹勛，楊國(guó)杰，張彥周，孫麗娜，于超男，楊曉村

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科 鄭州 450052　2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052　3)河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 450008　4)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科 鄭州 450052

?

高血壓大鼠心肌組織中睪酮受體蛋白的表達(dá)*

李淵1，2)，王穎1，2)#，燕樹勛3)，楊國(guó)杰1，2)，張彥周4)，孫麗娜1，2)，于超男1，2)，楊曉村1，2)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科 鄭州 4500522)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 4500523)河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 4500084)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科 鄭州 450052

關(guān)鍵詞睪酮受體；心肌重構(gòu)；絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶1；大鼠

摘要目的：探討高血壓心肌重構(gòu)中睪酮受體表達(dá)水平改變的意義。方法：以“兩腎一夾”法制備高血壓大鼠模型。實(shí)驗(yàn)分為3組：對(duì)照組(n=10，不給予任何處理)、假手術(shù)組(n=10)和模型組(n=10)。術(shù)后8周，HE染色觀察大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組化法檢測(cè)心肌組織中睪酮受體及絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶1(MKP-1)蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組和假手術(shù)組相比，模型組心肌纖維排列紊亂，部分心肌纖維斷裂，心肌表現(xiàn)為不同程度肥大或變性，睪酮受體及MKP-1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，且二者存在線性正相關(guān)關(guān)系(r=0.657，P=0.039)。結(jié)論：睪酮受體參與了高血壓心肌重構(gòu)的過程，其作用機(jī)制可能與絲裂素活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

AbstractAim: To explore the role of testosterone receptor in hypertension myocardial remodeling.Methods: Thirty rats were allocated into three groups:control group，sham operation group，and model group(the rats were to establish hypertension model),with ten rats in each group.Eight weeks after operation,the morphological change in myocardial tissue was observed under light microscope, and the expression levels of testosterone receptor and MKP-1 were tested by immunohistochemistry.Results: Compared with the sham operation group and control group, the myocardial fibers of model group disarrayed with some broken,varying degrees of myocardial hypertrophy of degeneration,and the expression levels of testosterone receptor and MKP-1 in myocardial tissue decreased significantly(P<0.05),and they were positively correlated(r=0.657，P=0.039).Conclusion: The testosterone receptor might take part in myocardial remodeling which links with the MAPKs signal transduction pathway.

高血壓心肌重構(gòu)是多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對(duì)其機(jī)制的研究意義重大[1]。睪酮是人體內(nèi)最重要的性激素，主要通過睪酮受體發(fā)揮作用，二者之間存在著負(fù)反饋調(diào)節(jié)[2]。近幾年國(guó)內(nèi)關(guān)于睪酮受體在心血管系統(tǒng)中的作用研究較多，但對(duì)于心肌重構(gòu)過程中心肌睪酮受體具體的作用機(jī)制尚無定論。絲裂素活化蛋白激酶系統(tǒng)(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是體內(nèi)多種細(xì)胞信號(hào)傳遞的共同通路，可通過多種途徑參與高血壓心肌重構(gòu)，而MAPKs磷酸酶1(MKP-1)是MAPKs滅活的重要途徑[3]。該研究擬以“兩腎一夾”腎性高血壓大鼠為模型，觀察睪酮受體及MKP-1蛋白在腎性高血壓大鼠心肌重構(gòu)過程中表達(dá)水平的變化，進(jìn)而探討睪酮受體在心肌重構(gòu)過程中的作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器28日齡Wistar雄性大鼠(0008508)30只，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。ALC-NIBP無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)定系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司)。RM-245石蠟包埋切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)，DNP-9082電熱恒溫箱(上海精宏公司)，電子天平、DP71型光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，微波爐(中國(guó)格蘭仕公司)，手術(shù)器械等。兔抗鼠睪酮受體抗體(sc-816)、鼠抗MKP-1抗體(sc-271684)、兔抗鼠IgG(sc-66931)均為圣克魯斯生物技術(shù)公司產(chǎn)品， DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，其他試劑為市售。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及標(biāo)本采集大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組。模型組大鼠用水合氯醛經(jīng)腹腔麻醉后，仰臥位固定在動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上;鈍性分離左腎動(dòng)脈，放置內(nèi)徑為0.2 mm的銀夾并打結(jié)固定，關(guān)閉腹腔;術(shù)后腹腔注射青霉素3 d預(yù)防感染。假手術(shù)組操作方法同上，但不放置銀夾。對(duì)照組不給予手術(shù)處理。分別于術(shù)前、術(shù)后1周、術(shù)后2周、術(shù)后3周、術(shù)后8周測(cè)大鼠尾動(dòng)脈血壓。術(shù)后4周平均收縮壓大于120 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)或者較術(shù)前平均收縮壓升高>20 mmHg，判定為腎性高血壓大鼠造模成功[4]。

1.3觀測(cè)指標(biāo)

1.3.1左心室質(zhì)量指數(shù)8周后，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在深度麻醉下，開胸取出心臟，用冰生理鹽水沖洗，濾紙拭干，稱量全心濕質(zhì)量及左心室濕質(zhì)量(除室間隔及左心室外的其余組織)，計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)。

1.3.2心肌形態(tài)學(xué)觀察左心室稱重后，用中性甲醛固定，心肌組織石蠟包埋，常規(guī)制片，HE染色，光鏡下觀察。

1.3.3心肌組織中睪酮受體及MKP-1蛋白的檢測(cè)烤片、微波爐抗原修復(fù)、血清封閉，一抗孵育(睪酮受體抗體和鼠抗MKP-1抗體均按1100稀釋)、4 ℃過夜，二抗孵育(兔抗鼠IgG抗體)，DAB顯色，中性樹膠封片，顯微鏡下采集圖片并應(yīng)用光密度軟件(Image-Pro Plus6.0)進(jìn)行分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析比較3組不同時(shí)期血壓水平；3組心肌組織中睪酮受體及MKP-1蛋白表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)分析睪酮受體和MKP-1蛋白表達(dá)的相關(guān)性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.13組大鼠血壓的比較模型組均造模成功。8周內(nèi)，對(duì)照組和假手術(shù)組血壓值無明顯變化，模型組血壓逐漸升高，見表1。

表1　3組大鼠不同時(shí)期的血壓　mmHg

F組間=1 211.779，F(xiàn)時(shí)間=1 613.225,F交互=1 537.050，P均<0.001。

2.23組心肌形態(tài)學(xué)變化見圖1。對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞完整,肌纖維排列整齊；假手術(shù)組同對(duì)照組相比無明顯差異；模型組大鼠心肌纖維部分?jǐn)嗔?排列紊亂,心肌細(xì)胞腫脹或有核固縮、消失，心肌間結(jié)締組織增多。

A：假手術(shù)組；B：對(duì)照組；C：模型組。圖1　3組大鼠心肌形態(tài)學(xué)變化(HE,×400)

2.33組左心室質(zhì)量指數(shù)的比較見表2。與假手術(shù)組和對(duì)照組相比，模型組左心室質(zhì)量指數(shù)明顯升高。

A：假手術(shù)組；B：對(duì)照組；C：模型組。圖2　3組睪酮受體(1)及MKP-1蛋白(2)的表達(dá)(免疫組化，×400)

2.43組心肌組織中睪酮受體和MKP-1蛋白表達(dá)水平的比較見圖2及表2。對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組心肌組織中均有睪酮受體和MKP-1蛋白表達(dá)。與對(duì)照組相比，假手術(shù)組兩種蛋白的表達(dá)水平無明顯變化；模型組兩種蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組和假手術(shù)組明顯降低。

表2　術(shù)后8周3組左心室質(zhì)量指數(shù)、

*：與對(duì)照組和假手術(shù)組相比，P<0.05。

2.5模型組大鼠心肌組織中睪酮受體蛋白與MKP-1蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析模型組中睪酮受體蛋白與MKP-1蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.657,P=0.039)。

3討論

研究[5]證實(shí)，生理劑量的睪酮可以抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞的增殖，提示睪酮對(duì)心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用，且其機(jī)制與MAPKs有關(guān)。睪酮的作用主要是通過睪酮受體實(shí)現(xiàn)的，睪酮受體主要分布于細(xì)胞核，既可以與進(jìn)入胞內(nèi)的睪酮特異性結(jié)合發(fā)揮效應(yīng)，又可以通過EGRF、IGRF、G蛋白偶聯(lián)途徑改變胞內(nèi)磷酸酶和激酶的活性，產(chǎn)生不依賴睪酮的作用，還可以通過與c-Jun、c-Fos、Spl和NF-kB的相互作用發(fā)揮調(diào)控功能[6]。研究[7]證實(shí)睪酮受體參與了包括動(dòng)脈粥樣硬化、前列腺增生、肥胖、糖尿病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。關(guān)于睪酮受體在心血管系統(tǒng)中的作用尚未達(dá)成共識(shí)，有研究[8-9]稱通過抑制睪酮受體可以在一定程度上抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展，但亦有研究[10]認(rèn)為睪酮受體可以通過RAS系統(tǒng)對(duì)血壓產(chǎn)生影響。

MAPKs是多種胞外信號(hào)引起細(xì)胞增殖、增生、肥大的胞內(nèi)信號(hào)傳遞的匯聚點(diǎn)和共同通路,其參與高血壓心肌重構(gòu)的過程主要是通過P38通路、ERK通路和JNK通路[11]3種途徑來實(shí)現(xiàn)的。MKP-1是MAPKs滅活的重要途徑。高血壓心肌重構(gòu)不僅與MAPKs的過度激活有關(guān)，還涉及MAPKs的滅活障礙[12-14]。

作者以腎性高血壓大鼠為研究對(duì)象，觀察了其心肌組織中睪酮受體和MKP-1蛋白的表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組和假手術(shù)組相比，模型組心肌組織中睪酮受體和MKP-1蛋白表達(dá)水平降低，提示二者可能參與了高血壓心肌重構(gòu)的過程；心肌組織中二者的表達(dá)存在線性正相關(guān)，提示睪酮受體蛋白參與高血壓心肌重構(gòu)的過程可能與MKP-1途徑有關(guān)。

綜上所述，睪酮受體和MKP-1蛋白表達(dá)水平在高血壓心肌重構(gòu)過程中均發(fā)生了改變，二者呈正相關(guān)，睪酮受體對(duì)高血壓心肌重構(gòu)的作用機(jī)制與MAPKs通路有關(guān)，二者共同作用于高血壓心肌重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展過程。

參考文獻(xiàn)

[1]BIELECKA-DABROWA A,ARONOW WS,RYSZ J,et al.The rise and fall of hypertension:lessons learned from eastern Europe[J].Curr Cardiovasc Risk Rep,2011,5(2):174

[2]劉長(zhǎng)青,吳賽珠,王子?xùn)|,等.睪酮對(duì)人單核細(xì)胞雄激素受體蛋白表達(dá)的影響[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,24(4):389

[3]ADACHI K,GOTO M,ONOUE T,et al.Mitogen-activated protein kinase phosphatase 1 negatively regulates MAPK signaling in mouse hypothalamus[J].Neurosci Lett,2014,569:49

[4]王東,蔣湘蓮,聶亞雄.高血壓大鼠模型的研究進(jìn)展[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2006,14(3):271

[5]孫麗娜,王穎,燕樹勛,等.睪酮對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的乳鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,49(4):461

[6]EDWARDS J,KRISHNA NS,MUKHERJEE R,et al.The role of c-Jun and c-Fos expression in androgen-independent prostate cancer[J].J Pathol,2004,204(2):153

[7]JIN L,FAROOK AA.Mechanism of androgen receptor action[J].Maturitas,2009,63(2):142

[8]曹劍,李小鷹,朱冰坡,等.雄激素及其受體與老年男性冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的相關(guān)性研究[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志, 2008，27(12)：901

[9]楚新梅,李小鷹,梁春紅,等.雄激素和雄激素受體與老年男性外周動(dòng)脈硬化閉塞病的相關(guān)研究[J].中華老年心腦血管病雜志,2007,6(6):364

[10]BALTATU O,CAYLA C,ILIESCU R,et al.Abolition of hypertension-induced end-organ damage by androgen receptor blockade in transgenic rats harboring the mouse ren-2 gene[J].J Am Soc Nephrol,2002,13(11):2681

[11]CARGNELLO M,ROUX PP.Activation and function of the MAPKs and their substrates, the MAPK-activated protein kinases[J].Microbiol Mol Biol Rev,2011,75(1):50

[12]BEGUM N,SONG Y,RIENZIE J,et al.Vascular smooth muscle cell growth and insulin regulation of mitogen-activated protein kinase in hypertension[J].Am J Physiol,1998,275(1 Pt 1):C42

[13]魯偉,劉培慶,陳健文,等.MAPK及MKP-1在腎性高血壓大鼠心肌肥大過程中的變化[J].中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2000,21(2):87

[14]張美春,王晉明,張慶華,等.厄貝沙坦和咪達(dá)普利對(duì)高血壓大鼠心肌細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的影響[J].中華心血管病雜志,2002(6):25

*國(guó)家留學(xué)基金委河南省地方合作項(xiàng)目201308410293；河南省科技廳基礎(chǔ)與研究項(xiàng)目132300410464；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目基礎(chǔ)研究計(jì)劃13A320436；河南省衛(wèi)生科技創(chuàng)新型人才工程中青年科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目4099；河南省衛(wèi)生廳及鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院共建青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2009年)；河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目2011020038

Expression of testosterone receptor in myocardial tissue from hypertensive rats

LIYuan1，2)，WANGYing1，2)，YANShuxun3)，YANGGuojie1，2)，ZHANGYanzhou4)，SUNLina1，2)，YUChaonan1，2)，YANGXiaocun1，2)

1)DepartmentofGeriatrics，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500522)Key-DisciplinesLaboratoryofClinical-MedicineofHenan，Zhengzhou4500523)DepartmentofEndocrinology，theFirstAffiliatedHospital，HenanCollegeofTraditionalChineseMedicine，Zhengzhou4500084)DepartmentofCardiology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordstestosterone receptor；myocardial remodeling；mitogen-activated protein kinase phosphatase 1;rat

中圖分類號(hào)R543.2

通信作者#，女，1974年6月生，博士，教授，副主任醫(yī)師，研究方向：心肌重構(gòu)的機(jī)制及防治，E-mail：2414714561@qq.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.005