人類乳頭狀瘤病毒與頭頸部腫瘤放療的關(guān)系

冷林蔓綜述，陳曉品審校

（重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶400016）

人類乳頭狀瘤病毒與頭頸部腫瘤放療的關(guān)系

冷林蔓1綜述，陳曉品2△審校

（重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶400016）

乳頭狀瘤病毒科；頭頸部腫瘤/放射療法；輻射耐受性；綜述

隨著近年來(lái)對(duì)頭頸部鱗癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC），尤其是口咽鱗癌（oropharyngeal squamous cell carcinoma，OPSCC）發(fā)病機(jī)制的不斷研究發(fā)現(xiàn)，人類乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）陽(yáng)性HNSCC患者在生存率及病死率方面明顯優(yōu)于HPV陰性者（多因吸煙等傳統(tǒng)因素所致）［1］。有研究表明，這與HPV陽(yáng)性患者吸煙率低，從而減少吸煙帶來(lái)的相關(guān)合并疾病及繼發(fā)的頭頸部惡性腫瘤而致死的可能有關(guān)［2］。HPV陽(yáng)性是提示HNSCC預(yù)后良好的指標(biāo)，這與HPV陽(yáng)性HNSCC細(xì)胞的放療敏感性增加有關(guān)，但該類研究尚存在局限性。而如何增加放療敏感性、提高放療療效是目前HNSCC放療的熱門(mén)話題［3］。本文主要介紹國(guó)外目前關(guān)于HPV陽(yáng)性HNSCC放療敏感性是否增加及其生物學(xué)機(jī)制的研究，以期為臨床治療提供更多的論據(jù)支持。

1　HPV感染狀態(tài)

已有大量臨床試驗(yàn)針對(duì)HPV陽(yáng)性、陰性HNSCC對(duì)放療反應(yīng)性問(wèn)題展開(kāi)研究。從目前收集的數(shù)據(jù)看，該問(wèn)題尚存在爭(zhēng)議，一些數(shù)據(jù)顯示，腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性增強(qiáng)，而有的則表明，放療敏感性會(huì)減弱，甚至無(wú)效。Kimple等［4］隨訪了HPV陽(yáng)性、陰性HNSCC患者同時(shí)給予2 Gy照射后的平均存活分?jǐn)?shù)，HPV陽(yáng)性患者存活分?jǐn)?shù)（22.0%）低于HPV陰性者（59.0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 1），表明HPV陽(yáng)性患者癌細(xì)胞對(duì)放療敏感性沒(méi)有增加。Spanos等［5］利用克隆存活實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)逐漸遞加放射劑量后HPV陽(yáng)性、陰性HNSCC細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，與HPV陰性細(xì)胞系比較，HPV陽(yáng)性細(xì)胞系隨放射劑量遞增放療抵抗性增強(qiáng)；該研究又采用梯度放射劑量對(duì)HPV陽(yáng)性、陰性小鼠扁桃體上皮細(xì)胞（MTEC）進(jìn)行觀察，HPV陽(yáng)性MTEC體外存活率高于HPV陰性細(xì)胞，從側(cè)面證明了上述在人體細(xì)胞系中的結(jié)論。而Nagel等［6］對(duì)4種HPV陽(yáng)性細(xì)胞和14種HPV陰性細(xì)胞的放療敏感性進(jìn)行了比較發(fā)現(xiàn)，HPV感染對(duì)各細(xì)胞的放療反應(yīng)性并無(wú)顯著影響。

關(guān)于上述這些差異，可從以下幾個(gè)方面進(jìn)行解釋：（1）各研究本身存在方法偏倚，且缺乏公認(rèn)的比較標(biāo)準(zhǔn)，致使得出的研究結(jié)果不一致；（2）腫瘤細(xì)胞中是否存在HPV感染未明確提及檢測(cè)方法，只有個(gè)別研究提供了在HNSCC患者中檢測(cè)到HPV DNA和E6/E7 mRNA存在的證據(jù)；（3）一些研究提到HPV陽(yáng)性、陰性HNSCC細(xì)胞的放療敏感性范圍較大，導(dǎo)致細(xì)胞的生存率存在交叉重疊。放療敏感性差的HPV陽(yáng)性細(xì)胞與放療敏感性最強(qiáng)的HPV陰性細(xì)胞之間的這種交叉重疊或許可在一定程度上解釋結(jié)果的矛盾性。

2　HPV陽(yáng)性HNSCC放療敏感性增加的生物學(xué)機(jī)制

2.1DNA的自我修復(fù)能力電離輻射（ionizing radiation，IR）主要是通過(guò)損傷腫瘤細(xì)胞DNA，導(dǎo)致基因組雙鏈斷裂（double-strand breaks，DSB）、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。而IR導(dǎo)致細(xì)胞死亡又主要通過(guò)p53介導(dǎo)產(chǎn)生。盡管體內(nèi)p53受HPV E6癌蛋白的作用部分失活，但與HPV陰性腫瘤比較，HPV陽(yáng)性腫瘤仍可表達(dá)較低活性的野生型p53。Kimple等［4］認(rèn)為，放療后TP53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的增多在增強(qiáng)HPV陽(yáng)性O(shè)PSCC放療敏感性方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。該研究通過(guò)caspase活性測(cè)定及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜的改變對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單次4 Gy劑量照射后HPV陰性細(xì)胞caspase活性未增加，而HPV陽(yáng)性細(xì)胞caspase活性增加了85.0%，二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002 0）。HPV陽(yáng)性細(xì)胞凋亡顯著增加可通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)得以確定。此外Kimple等［4］還在放療后24 h使用全基因組基因芯片對(duì)HPV陽(yáng)性、陰性細(xì)胞基因表達(dá)進(jìn)行了比較，結(jié)果提示，HPV陽(yáng)性細(xì)胞p53通路的多種基因發(fā)生上調(diào)。因此可認(rèn)為，盡管HPV E6癌蛋白可下調(diào)p53，但殘余的野生型p53仍可在放療后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Rieckmann等［7］認(rèn)為，損傷DNA的修復(fù)能力是HPV陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)IR反應(yīng)性增強(qiáng)的原因。其用抗c-H2AX和抗53BP1抗體（細(xì)胞對(duì)DSB反應(yīng)的早期信號(hào)）進(jìn)行免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，HPV陽(yáng)性組放療后DSB較HPV陰性組多，而未修復(fù)的DSB可通過(guò)細(xì)胞有絲分裂障礙導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而認(rèn)為，HPV陽(yáng)性HNSCC細(xì)胞中殘余DSB與細(xì)胞放療敏感性呈正相關(guān)。但關(guān)于改變DNA修復(fù)能力的潛在機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。而Applebaum等［8］認(rèn)為，XRCC1（一種與DSB修復(fù)有關(guān)的主要蛋白）與HPV相關(guān)的HNSCC并無(wú)關(guān)。Moon等［9］在人體HPV陽(yáng)性頭頸部癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，E7癌蛋白減少了DNA損傷的修復(fù)，故認(rèn)為HPV E7癌蛋白在DNA修復(fù)方面具有直接或間接作用。Dok等［10］的研究則很有意思，其提到了HPV介導(dǎo)的OPSCC中的一項(xiàng)特征，即p16高表達(dá)可破壞RAD51向DNA損傷部位聚集，從而減少同源重組介導(dǎo)的DNA修復(fù)途徑；p16對(duì)放療敏感性的影響不是通過(guò)p16對(duì)CDK4/6的抑制，而是由p16的其他功能所誘導(dǎo)。事實(shí)上，p16可通過(guò)下調(diào)cyclinD1抑制RAD51向DNA損傷部位聚集。而RAD51又是同源重組介導(dǎo)的DNA修復(fù)途徑所必需的因子。因此，Dok等［10］指出，p16過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致非同源末端連接途徑（non homologous end joining pathway，NHEJ）增加，從而引起DNA DSB錯(cuò)修復(fù)。為支持該假設(shè)，其還與p16陰性細(xì)胞進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p16陽(yáng)性細(xì)胞在放療后微小有核細(xì)胞的頻率增加，這也是NHEJ錯(cuò)修復(fù)的一項(xiàng)特征。該發(fā)現(xiàn)如果得到證實(shí)，或許可部分說(shuō)明p16高表達(dá)對(duì)OPSCC預(yù)后的積極影響，且這種積極影響并不受HPV感染狀態(tài)的影響。盡管相關(guān)文獻(xiàn)較為有限，且觀點(diǎn)上存在沖突，但上述研究表明，即使是在非口咽部癌中HPV陽(yáng)性/p16陽(yáng)性癌的預(yù)后優(yōu)于HPV陰性/ p16陰性癌。

2.2細(xì)胞再增殖-信號(hào)通路的激活表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）通路是HNSCC最常發(fā)生上調(diào)的信號(hào)通路，與治療抵抗性和不良預(yù)后相關(guān)。有研究證實(shí)，OPSCC患者HPV感染與EGFR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，即在OPSCC中EGFR較少表達(dá)［11］。Gupta等［12］對(duì)3種細(xì)胞系（2種為HPV陽(yáng)性，1種為HPV陰性）進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HPV陰性細(xì)胞系放療抵抗性最強(qiáng)，其中EGFR高表達(dá)。此外EGFR通過(guò)蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）活化信號(hào)傳導(dǎo)激活，可能會(huì)激活mTOR癌基因。另外該研究還發(fā)現(xiàn)2種HPV陽(yáng)性、EGFR陰性HNSCC細(xì)胞中PTEN狀態(tài)不同，Akt表達(dá)水平存在差異。與HPV陰性HNSCC比較，PTEN表達(dá)在HPV陽(yáng)性扁桃體癌中更為常見(jiàn)。通過(guò)利用新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)252個(gè)HNSCC樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，HPV陽(yáng)性腫瘤中發(fā)生遺傳改變的最常見(jiàn)基因?yàn)镻IK3CA和PTEN（通過(guò)HPV DNA測(cè)序證實(shí)）［13］。當(dāng)然遺傳改變也存在于HPV陰性患者中，在吸煙患者中甚至更為常見(jiàn)。Seiwert等［14］對(duì)120對(duì)腫瘤/健康樣本（42.5%HPV陽(yáng)性）中的617種癌癥相關(guān)基因進(jìn)行了平行測(cè)序，在HPV陰性HNSCC樣本中發(fā)現(xiàn)大量TP53、CDKN2A、MLL2、CUL3、NSD1、PIK3CA和NOTCH基因突變。其他特殊突變（DDX3X、FGFR2/3）和畸變（KRAS、MLL2/3和NOTCH1）在HPV陽(yáng)性腫瘤中較為常見(jiàn)。Sewell等［15］收集了29份HPV陽(yáng)性和13份HPV陰性O(shè)PSCC樣本并用反相蛋白芯片分析發(fā)現(xiàn)，HPV陽(yáng)性腫瘤中所有PIK3CA激活突變，但其活化Akt及Akt靶點(diǎn)磷酸化平均水平均較低。此外HPVE6/E7癌蛋白過(guò)表達(dá)也同時(shí)抑制了HPV陰性細(xì)胞中Akt磷酸化。HPV陽(yáng)性腫瘤中再增殖信號(hào)通路的減少或許可解釋放療敏感性的增強(qiáng)。

2.3細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制目前一致認(rèn)為，細(xì)胞有絲分裂對(duì)IR尤為敏感，而處于S期晚期細(xì)胞的抗性最強(qiáng)。在IR誘導(dǎo)的DNA損傷發(fā)生后Chk1/2激酶家族被激活，通過(guò)ATM和ATR阻滯細(xì)胞周期，并修復(fù)DNA［16］。在感染HPV細(xì)胞中E6和E7分別使p53和pRb下調(diào)。正常情況下為評(píng)估DNA損傷，p53和pRb通過(guò)點(diǎn)激酶使細(xì)胞周期阻滯在G1/G2期，并在細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期（M期）前修復(fù)DNA損傷。細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制誘導(dǎo)p16INK4a表達(dá)增多，并通過(guò)CDK4/6-cyclinD1-pRb通路使細(xì)胞周期阻滯。但在HPV導(dǎo)致的腫瘤中E7可同時(shí)滅活pRb，妨礙p16INK4a介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯［17］。如沒(méi)有這些調(diào)控機(jī)制放射線誘導(dǎo)的DNA損傷將不斷累積，從而因有絲分裂障礙而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Arenz等［18］對(duì)4種HPV陽(yáng)性和4種HPV陰性細(xì)胞系的細(xì)胞周期再分配比較發(fā)現(xiàn)，放療后HPV陽(yáng)性細(xì)胞通過(guò)S期在G2/M期聚集、阻滯。Kimple等［4］也發(fā)現(xiàn)，HPV陽(yáng)性細(xì)胞存在廣泛G期阻滯。磷酸ATM和磷酸ATR在HPV陽(yáng)性細(xì)胞中并未發(fā)生修飾，但細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶Chk1在照射后的作用得到證實(shí)［19］。在通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染HPV16 E6/E7癌基因的骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞中，照射后的細(xì)胞Chk1和Chk2磷酸化水平均高于未照射細(xì)胞，但只有Chk1可消除對(duì)細(xì)胞系產(chǎn)生放射增敏作用［20］。選擇性抑制劑——PF-00477736可消除與放射增敏同時(shí)發(fā)生由放射誘導(dǎo)的G2期阻滯［21］。盡管Chk1抑制的作用取決于p53狀態(tài)，一項(xiàng)近期研究表明，使用選擇性Chk1抑制劑——Chir-124抑制Chk1所產(chǎn)生的增敏作用與p53（-/-）和缺乏p53的野生型腫瘤細(xì)胞較為相似［22］。Chk1和（或）Chk2抑制在HPV陽(yáng)性HNSCC中對(duì)野生型p53水平下降的作用仍需進(jìn)一步研究。

3　腫瘤微環(huán)境的影響

3.1組織乏氧乏氧是包括HNSCC在內(nèi)的局部晚期實(shí)體瘤的一項(xiàng)常見(jiàn)特征。事實(shí)上，大多數(shù)實(shí)體腫瘤中新形成的微血管存在一系列嚴(yán)重結(jié)構(gòu)和功能異常，可破壞有效組織氧合，促進(jìn)腫瘤對(duì)放療產(chǎn)生抵抗性。在DAHANCA5試驗(yàn)的一項(xiàng)回顧性分析中Lassen等［23］回答了HPV陽(yáng)性腫瘤放療敏感性的增強(qiáng)是否是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞氧合能力較好所導(dǎo)致這一問(wèn)題。該研究采用測(cè)定p16蛋白表達(dá)作為確定HPV感染狀態(tài)的指標(biāo)（p16陽(yáng)性則視為HPV陽(yáng)性）。結(jié)果顯示，尼莫拉唑（一種缺氧細(xì)胞放射增敏劑）治療組175例患者在局部控制方面顯著優(yōu)于安慰劑組156例患者（風(fēng)險(xiǎn)比為0.70，95%可信區(qū)間：0.52～0.93）。但這種改善僅在p16陰性腫瘤中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。由于采用替代指標(biāo)確定HPV感染狀態(tài)，且p16陽(yáng)性O(shè)PSCC亞組的病例數(shù)和發(fā)生事件有限，所以需對(duì)結(jié)果進(jìn)行謹(jǐn)慎的判斷。這也可能是這些患者在放療后預(yù)后良好的原因之一。為支持該假設(shè)，其進(jìn)一步對(duì)252例患者血漿骨橋蛋白（一種缺氧標(biāo)志物）水平和p16狀態(tài)進(jìn)行了相關(guān)性研究，結(jié)果顯示，p16陰性腫瘤患者出現(xiàn)高水平血漿骨橋蛋白的可能性［41.1%（78/190）］顯著高于p16陽(yáng)性腫瘤患者［16.1%（10/62）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0001），因此，其缺氧程度也較高。但許多其他研究結(jié)果顯示，HPV陽(yáng)性、陰性腫瘤在缺氧程度方面比較，差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Mortensen等［24］進(jìn)行的一項(xiàng)前瞻性研究用缺氧特異性示蹤劑——F-硝基咪唑呋喃糖苷對(duì)40例接受放療的HNSCC患者進(jìn)行正電子發(fā)射斷層掃描/CT檢查發(fā)現(xiàn)，HPV感染狀態(tài)與缺氧無(wú)關(guān)，因?yàn)槿毖踉贖PV陽(yáng)性［75.0%（12/16）］、陰性［54.2%（13/ 24）］腫瘤中的分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Toustrup等［25］根據(jù)腫瘤缺氧基因表達(dá)特征將323例HNSCC患者分為嚴(yán)重缺氧組和輕度缺氧組，其中包括84例p16陽(yáng)性患者，結(jié)果顯示，p16陽(yáng)性、陰性患者中缺氧的出現(xiàn)頻率相同。Kong等［26］研究了99例HNSCC患者中HPV與腫瘤氧合的相關(guān)性，其中包括33例HPV陽(yáng)性O(shè)PSCC患者，結(jié)果顯示，無(wú)論采用氧分壓測(cè)定，還是對(duì)缺氧誘導(dǎo)蛋白碳酸酐酶-Ⅸ進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，HPV感染狀態(tài)與腫瘤缺氧程度均無(wú)關(guān)。盡管目前并無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的且經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的缺氧生物標(biāo)志物，但上述研究具有較高的一致性，腫瘤氧合可能并不是HPV陽(yáng)性O(shè)PSCC對(duì)放療反應(yīng)性強(qiáng)的原因。

3.2抗腫瘤免疫反應(yīng)越來(lái)越多的證據(jù)表明，放療可利用宿主免疫系統(tǒng)間接消滅腫瘤細(xì)胞，該過(guò)程稱為免疫原性細(xì)胞死亡，由死亡的腫瘤細(xì)胞發(fā)出信號(hào)，觸發(fā)免疫反應(yīng)［27］。因此，HPV陽(yáng)性O(shè)PSCC的放療敏感性較高至少在部分程度上可能是由放療后免疫反應(yīng)增強(qiáng)所致。HPV導(dǎo)致的OPSCC可誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫，作用于腫瘤細(xì)胞的病毒抗原。事實(shí)上，這些腫瘤中的免疫反應(yīng)相關(guān)基因高表達(dá)（尤其是與CD8+T淋巴細(xì)胞效應(yīng)功能相關(guān)的基因），且腫瘤中浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著多于HPV陰性腫瘤［28］。這些腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞對(duì)HPV癌蛋白具有反應(yīng)性，這些細(xì)胞在治療前樣本評(píng)估中如果數(shù)量較多則對(duì)良好的臨床結(jié)局具有預(yù)測(cè)價(jià)值［29］。其可在腫瘤清除中發(fā)揮積極作用。然而，盡管存在抗腫瘤免疫反應(yīng)，大部分HPV導(dǎo)致的OPSCC仍能持續(xù)存在并發(fā)生進(jìn)展，提示可能存在一定的耐受或免疫逃逸機(jī)制。放療及其產(chǎn)生的生理學(xué)影響可能使由免疫耐受向殺滅腫瘤方向轉(zhuǎn)變，并促進(jìn)已有的免疫反應(yīng)。Spanos等［5］利用小鼠模型進(jìn)行的體內(nèi)研究結(jié)果顯示，與HPV陰性腫瘤比較，具有免疫能力的HPV陽(yáng)性腫瘤小鼠對(duì)放療敏感性較強(qiáng)，20 Gy劑量照射可實(shí)現(xiàn)完全清除，而HPV陰性腫瘤則對(duì)放療反應(yīng)性差。但動(dòng)物模型體內(nèi)研究并不足以解釋人體免疫系統(tǒng)對(duì)這些腫瘤的影響。為進(jìn)一步探究潛在的機(jī)制，Andersen等［30］通過(guò)放療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞損傷和炎癥，導(dǎo)致腫瘤抗原及危險(xiǎn)相關(guān)分子模式分子，如高遷移率族蛋白1（high mobility group protein 1，HMGB1）釋放。HMGB1可通過(guò)Toll樣受體4誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞的募集和成熟。因?yàn)椴《镜鞍诪橥鈦?lái)物質(zhì)，擁有較高的免疫原性，一旦進(jìn)入機(jī)體，活化的樹(shù)突細(xì)胞就攝取包括HPV蛋白在內(nèi)的腫瘤抗原，從而刺激初始T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，誘導(dǎo)非常有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

綜上所述，HPV陽(yáng)性O(shè)PSCC的放療敏感性更高?？赡芫c受損DNA的自我修復(fù)能力和射線誘發(fā)的細(xì)胞免疫反應(yīng)、腫瘤乏氧等有關(guān)。根據(jù)所提及的相關(guān)機(jī)制，可為未來(lái)臨床治療研究提供新方向。

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A

1009-5519（2016）12-1844-04

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（2016-01-30）