牦牛源鮑氏志賀菌人工感染BALB/c小鼠的組織病理學(xué)觀察

冉丹丹，周　芳，黃志宏，湯　承，劉亞剛

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

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牦牛源鮑氏志賀菌人工感染BALB/c小鼠的組織病理學(xué)觀察

冉丹丹，周芳，黃志宏，湯承*，劉亞剛

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

摘要：為了解牦牛源鮑氏志賀菌對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物除腸道外的心、肝等的快速致病性損傷，本研究以牦牛源鮑氏志賀菌感染SPF小鼠，劑量為0.5 mL·只-1(2×109CFU·mL-1)，感染后6、18、30、42、54、66 h剖殺、取樣并對(duì)剖解進(jìn)行詳細(xì)觀察，在每個(gè)安排的時(shí)間點(diǎn)平行采集3只小鼠的腦、心、肝、脾、肺、腎、小腸、大腸和胰腺等組織，制備組織切片，通過(guò)HE染色和免疫組化染色，對(duì)感染小鼠的組織病理學(xué)變化和細(xì)菌定位進(jìn)行觀察，收集小鼠血液進(jìn)行乳酸脫氫酶、尿素、肌酐、α-淀粉酶、甘油三酯、總蛋白、白蛋白、磷酸激酶、CO2結(jié)合力、P、血糖、白細(xì)胞數(shù)等血液生化指標(biāo)檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠除小腸上皮細(xì)胞損傷外，心外膜下出現(xiàn)凝固性壞死病灶，肝組織有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肉芽腫形成，肺泡壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，胰腺上皮細(xì)胞腫脹，細(xì)胞質(zhì)溶解，細(xì)胞核固縮或碎裂等；心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺泡壁、腎小管細(xì)胞、胰島細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有待檢菌體抗原陽(yáng)性反應(yīng)；生化指標(biāo)除甘油三酯外均有一定變化。試驗(yàn)證實(shí)病變的嚴(yán)重程度與菌體抗原檢出量成正相關(guān)，分離株能在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行大面積侵嗜，心、肝、肺、胰腺、腎也是牦牛源鮑氏志賀菌分離株的主要靶器官。生化指標(biāo)和病理?yè)p傷的特征性變化對(duì)該病診斷與研究拓展具有重要價(jià)值。

關(guān)鍵詞：牦牛源鮑氏志賀菌；病理觀察；抗原分布

志賀菌屬(Shigella)是具有高度傳染性和嚴(yán)重危害性的革蘭陰性胞內(nèi)致病菌，與沙門菌、金黃色葡萄球菌一并認(rèn)為是導(dǎo)致全球范圍內(nèi)大量人畜死亡的食源性疾病病原菌[1-3]。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)，志賀菌的相關(guān)病理研究主要針對(duì)其對(duì)腸道的致病性[4-5]，也有感染肺致病的報(bào)道[6]，M.M.Islam等[7]證實(shí)志賀菌可引起人的包括敗血癥、低血鈉、低血鉀和低血糖等生化指標(biāo)異常。筆者在2011年首次分離獲得一株牦牛源鮑氏志賀菌[8]，在研究其毒力過(guò)程中發(fā)現(xiàn)該分離株對(duì)除腸道以外的機(jī)體臟器存在致病性，可導(dǎo)致試驗(yàn)動(dòng)物肝炎癥，心房外壁出現(xiàn)白色病灶等，重復(fù)試驗(yàn)均可出現(xiàn)相應(yīng)病變，具有一定特點(diǎn)。為深入研究該分離株在機(jī)體組織、器官的動(dòng)態(tài)分布及致病機(jī)制，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人工感染、常規(guī)組織病理學(xué)檢查、免疫酶組織化學(xué)染色和生化指標(biāo)檢測(cè)。本研究針對(duì)牦牛源鮑氏志賀菌分離株建立實(shí)驗(yàn)病理模型，針對(duì)分離株感染實(shí)驗(yàn)小鼠出現(xiàn)的臨床癥狀、部分生化指標(biāo)變化、病理變化和細(xì)菌抗原定位進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期了解該菌株的致病機(jī)制，為更好地防控人畜志賀菌病和深入拓展相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

牦牛源鮑氏志賀菌，由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；4周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠，26只，雌雄各半，購(gòu)自四川省成都達(dá)碩生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)器材

兔抗鮑氏志賀菌多克隆IgG抗體(bs-4583R，Beijing biosynthesis bitechnology Co.，Ltd，China)；過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色試劑盒SP-9001(SP-9001 HistostainTM-Plus Kits，)；DAB顯色試劑盒，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；石蠟組織切片機(jī)，美國(guó)Leica公司；ECLIPSE 6200顯微鏡，日本Nikon公司；4%多聚甲醛溶液、LB試劑、微量加樣器及配套槍頭、1 mL無(wú)菌注射器、消毒灌胃針等。

1.3人工感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4周齡BALB/c小鼠購(gòu)回后正常飼喂觀察2 d。將26只BALB/c小鼠隨機(jī)分為2組，其中試驗(yàn)組22只，對(duì)照組4只。先觀察3 d無(wú)異常后再進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，用分離株0.5 mL(2×109CFU·mL-1)[8]灌胃進(jìn)行人工感染試驗(yàn)，對(duì)照組灌胃生理鹽水。以出現(xiàn)嗜睡、精神萎靡、被毛聳立為感染成功發(fā)病指標(biāo)，感染后6、18、30、42、54、66 h剖殺、取樣并對(duì)剖解變化進(jìn)行詳細(xì)觀察，在每個(gè)安排的時(shí)間點(diǎn)平行采集3只小鼠的腦、心、肝、脾、肺、腎、小腸、大腸和胰腺等組織固定于4%多聚甲醛，常規(guī)制作石蠟切片(4 μm)。收集小鼠血液進(jìn)行乳酸脫氫酶(LDH)、尿素、肌酐、α-淀粉酶、甘油三酯(TG)、總蛋白、白蛋白、磷酸激酶、CO2結(jié)合力、P、血糖、白細(xì)胞數(shù)等血液生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.4病理組織切片HE染色和免疫酶組織化學(xué)染色

小鼠組織切片進(jìn)行HE染色和免疫酶組織化學(xué)染色。HE染色按常規(guī)方法進(jìn)行。免疫組化一抗采用兔抗鮑氏志賀菌多克隆IgG抗體(bs-4583R)，免疫組織化學(xué)染色按過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。染色操作步驟大致如下：石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2浸泡，避光20 min后蒸餾水沖洗3 min×3次；枸櫞酸緩沖鹽(pH6.0)高壓修復(fù)3 min，PBS沖洗5 min×2次；1∶20羊血清封閉37 ℃ 30 min；甩去多余血清，加一抗37 ℃ 1～2 h，PBS沖洗，5 min×2次；1∶200二抗37 ℃ 40 min，PBS沖洗，5 min×2次；SP(1∶200)37 ℃ 30 min，PBS沖洗，5 min×2次；3，3-二氨基聯(lián)苯胺顯色，鏡下控制顯色時(shí)間，自來(lái)水中止顯色；自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，封片；陰性對(duì)照以PBS代替一抗。

染色切片置于Nikon ECLIPSE 6200顯微數(shù)碼圖像采集系統(tǒng)上采集圖像，用ImagePro-Plus6.0圖像分析軟件測(cè)量其陽(yáng)性顆粒累積光密度值(IOD)，所得數(shù)據(jù)用Excel表格進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，分別計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)各組織臟器的平均累積光密度值，并繪制陽(yáng)性累積光密度值動(dòng)態(tài)柱形圖。

2結(jié)果

2.1志賀菌人工感染BALB/c小鼠模型的建立

接菌后2 h小鼠出現(xiàn)嗜睡、精神萎靡、被毛聳立等臨床癥狀，36 h有一只試驗(yàn)組小鼠死亡，48 h后小鼠精神恢復(fù)。觀察期內(nèi)對(duì)照組小鼠精神均正常，未出現(xiàn)死亡。經(jīng)剖檢，試驗(yàn)組小鼠于感染后18 h即可見(jiàn)小腸內(nèi)充盈黃色透亮內(nèi)容物，感染后6 h即可見(jiàn)小鼠心外膜下有細(xì)小白色病灶，且隨時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng)病灶擴(kuò)大和融合(圖1)。

2.2志賀菌人工感染BALB/c小鼠后主要血液生化指標(biāo)

小鼠血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果除甘油三酯外，乳酸脫氫酶、尿素、肌酐、α-淀粉酶、甘油三酯、總蛋白、白蛋白、磷酸激酶、CO2結(jié)合力、P、血糖、白細(xì)胞數(shù)等指標(biāo)均有一定的變化。其中，血清總蛋白、CO2結(jié)合力、乳酸脫氫酶水平先降低后升高，尿素、肌酐、白蛋白、白細(xì)胞數(shù)水平總體上呈降低趨勢(shì)，血糖、磷酸激酶、α-淀粉酶水平先升高后降低，P水平總體升高。變化趨勢(shì)曲線見(jiàn)圖2。其中，由于各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)值和單位相差較大，為了在同一個(gè)圖中展示做了相應(yīng)處理，處理方法見(jiàn)生化指標(biāo)名稱后。

2.3病理組織學(xué)檢查

小鼠組織切片HE染色觀察，感染小鼠除脾、大腸未見(jiàn)明顯病理變化外，其余臟器均出現(xiàn)不同程度病理變化(圖3)。其中，小鼠心組織切片可見(jiàn)各時(shí)間點(diǎn)心肌組織充血，心腔內(nèi)有多少不一血凝塊，6、30、42、54 h可見(jiàn)心外膜下有壞死和炎癥細(xì)胞增生浸潤(rùn)病灶，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大；肝組織切片各時(shí)間點(diǎn)均見(jiàn)不同程度充血，54、66 h偶見(jiàn)凝固性壞死灶，少量散在巨噬細(xì)胞與淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)病灶，18、30、54 h可見(jiàn)肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)細(xì)小空泡；肺組織切片可見(jiàn)隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)，肺泡壁細(xì)胞增多，肺泡壁增寬，肺泡腔狹窄或消失。42、54 h可見(jiàn)血管周圍或支氣管旁有灶性或散在的巨噬細(xì)胞與淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；腎組織切片可見(jiàn)感染組小鼠腎間質(zhì)均充血，6、18 h可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞腫脹，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)小空泡；胰組織切片42、54 h可見(jiàn)胰腺上皮細(xì)胞腫脹，漿細(xì)胞質(zhì)溶解，遺留少量絲網(wǎng)狀紅染物，細(xì)胞核固縮或已碎裂、溶解；小腸組織切片于2、66 h可見(jiàn)小腸絨毛頂端凝固性壞死，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，遺留紅染無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)碎片；大腦組織切片可見(jiàn)感染小鼠均出現(xiàn)腦膜充血。

2.4免疫組織化學(xué)檢查

免疫組化染色見(jiàn)鮑氏志賀菌感染小鼠的心、肝、肺、腎、小腸、大腸、胰腺共7個(gè)器官組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色陽(yáng)性顆粒。鮑氏志賀菌抗原最早于感染后6 h的小鼠心、肝、肺、腎、小腸、大腸、胰島等臟器組織細(xì)胞質(zhì)中檢出。除小腸上皮細(xì)胞、大腸上皮細(xì)胞、胰島細(xì)胞隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量有所降低外，其余組織器官的細(xì)菌抗原檢出量隨感染時(shí)間的持續(xù)進(jìn)一步增多。各組織中的細(xì)菌抗原含量以肺和胰島最高，其余組織器官次之。各組織器官的免疫組化結(jié)果見(jiàn)圖4，圖5。

3討論

3.1分離株致病特性

腸道致病菌是導(dǎo)致發(fā)展中國(guó)家嬰兒和五歲以下兒童、年長(zhǎng)和免疫功能不全人群發(fā)病、死亡的主要原因[9]。人和靈長(zhǎng)類是志賀菌的適宜宿主，根據(jù)宿主的健康狀況和年齡，只需10個(gè)細(xì)菌細(xì)胞就可致病，其強(qiáng)致病性使其成為重要的食源性腸道致病菌[10]。本文中的分離株分離自高海拔川西北草地外表健康牦牛體內(nèi)。志賀菌血清型和種的確定對(duì)于疾病的預(yù)防和治療極為重要，而福氏志賀菌被認(rèn)為是亞洲地區(qū)的優(yōu)勢(shì)血清型[11]，高原生態(tài)環(huán)境特殊，病原微生物交流有限，通常認(rèn)為病原菌血清型較為單一。但本次牦牛源鮑氏志賀菌的分離和其致病性試驗(yàn)，提示在高原地區(qū)人畜志賀菌病的防治過(guò)程中，混合血清型的交互影響增強(qiáng)病原菌對(duì)宿主的致病性現(xiàn)象不容忽視。在高原人畜志賀菌病的防治中不能僅僅是按照單一的優(yōu)勢(shì)血清型進(jìn)行。

作為典型的腸道致病菌，對(duì)腸道的致病性研究是重點(diǎn)，目前針對(duì)志賀菌感染腸道的免疫應(yīng)答、致病作用、致病機(jī)制以及相應(yīng)分子生物學(xué)研究較為成熟，常采用恒河猴、小鼠、大鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)等離體試驗(yàn)觀察[12-13]。本次試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上同時(shí)也關(guān)注分離株在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)多個(gè)臟器的動(dòng)態(tài)分布和致病損傷。在本次試驗(yàn)中，細(xì)菌抗原廣泛分布于除腦組織以外的各個(gè)臟器中。細(xì)菌抗原在6 h的心、肝、肺等組織中被檢出，通過(guò)免疫酶組織化學(xué)染色觀察，細(xì)菌抗原不僅存在于組織病灶位置的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，同時(shí)也廣泛存在于心肌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)、肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)、腎小管上皮細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞。這一結(jié)果證實(shí)了鮑氏志賀菌是一種胞內(nèi)致病菌，與師潤(rùn)等[5]利用免疫組化方法定位細(xì)菌于腸上皮細(xì)胞的報(bào)道相符。在病理切片上觀察到的心外膜下壞死和炎癥細(xì)胞增生浸潤(rùn)病灶、肝凝固性壞死灶、肺泡內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、胰腺上皮細(xì)胞核固縮等病變現(xiàn)象更說(shuō)明本分離株是一株廣泛侵嗜性致病菌，提示在志賀菌病癥的治療中也應(yīng)考慮其對(duì)多個(gè)臟器的影響。為后續(xù)相關(guān)志賀菌病研究奠定基礎(chǔ)。

3.2致病機(jī)制

志賀菌致病的關(guān)鍵是侵蝕和定殖腸上皮細(xì)胞。通過(guò)利用濾泡相關(guān)上皮中的M細(xì)胞通過(guò)腸道上皮壁壘屏障，隨后進(jìn)入腸道基底組織，從基底外膜表面侵入腸上皮細(xì)胞。在濾泡相關(guān)上皮細(xì)胞下的圓形淋巴組織區(qū)域被巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞所吞噬。細(xì)菌被吞噬后會(huì)啟動(dòng)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞凋亡模式致使細(xì)胞死亡。被感染的巨噬細(xì)胞在死亡之前會(huì)釋放促炎性細(xì)胞因子白介素IL-1β和IL-18通過(guò)IpaB侵襲素激活細(xì)胞蛋白凋亡酶-1。這些細(xì)胞因子聯(lián)合如IL-8之類的趨化因子，擴(kuò)充了中性粒細(xì)胞數(shù)，侵入感染位點(diǎn)，使上皮細(xì)胞的防御壁壘更為薄弱。其直接結(jié)果是摧毀了腸上皮細(xì)胞的防御屏障，使更多的細(xì)菌進(jìn)入到上皮下的空間，入侵腸上皮細(xì)胞，最終遍布所有腸上皮細(xì)胞[14-15]。結(jié)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清多個(gè)生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果，證實(shí)細(xì)菌在腸道的分布過(guò)程中侵入血管，隨血液移行至體內(nèi)多個(gè)臟器。其中，在肝、心這兩個(gè)血液流通量較大的器官集中發(fā)揮其免疫損傷作用。生化指標(biāo)的檢測(cè)表現(xiàn)一定的特征性，為疾病診斷提供參考。以肝組織病變?yōu)槔?，?xì)菌透過(guò)血管壁進(jìn)入肝細(xì)胞，干擾細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的作用以影響肝細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成作用。肝細(xì)胞在外因素干擾作用下發(fā)生的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死可分別在數(shù)小時(shí)和數(shù)天內(nèi)表現(xiàn)[16]，與本試驗(yàn)中肝細(xì)胞壞死灶首先出現(xiàn)時(shí)間54 h大致相符。肝細(xì)胞損傷或壞死后，向血液中釋入大量LDH，致使血中LDH值升高[17]，如本試驗(yàn)中隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，LDH總體增高趨勢(shì)持續(xù)。肝出現(xiàn)病理?yè)p傷，在日常診斷中僅能依靠相關(guān)血液生化指標(biāo)改變進(jìn)行判定。類似的生化指標(biāo)與病理?yè)p傷對(duì)應(yīng)呈現(xiàn)同樣出現(xiàn)在肺和CO2結(jié)合力、胰腺和血糖等。將生化指標(biāo)、病理?yè)p傷和致病機(jī)制聯(lián)系在一起，對(duì)相應(yīng)生化指標(biāo)的持續(xù)性監(jiān)控，一方面可對(duì)臟器損傷程度進(jìn)行預(yù)測(cè)，另一方面可對(duì)疾病診斷提供參考，同時(shí)引出人志賀菌病診斷試劑盒研究新選項(xiàng)。

4結(jié)論

牦牛源鮑氏志賀菌分離株能在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生快速致病性損傷，導(dǎo)致除腸道、肺等已知臟器以外臟器(如心、胰腺、腎)的病變。通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)，細(xì)菌抗原不僅存在于組織病灶位置的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，同時(shí)也廣泛存在于心肌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)、肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)、腎小管上皮細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞。對(duì)應(yīng)臟器生化指標(biāo)的改變提示可作為志賀菌病程診斷的重要依據(jù)。

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(編輯白永平)

Histopathological Observation in BALB/c Mice Experimentally Infected withShigellaboydiifrom Yak

RAN Dan-dan，ZHOU Fang，HUANG Zhi-hong，TANG Cheng*，LIU Ya-gang

(CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China)

Key words:Shigellaboydiifrom Yak；pathological observation；antigen distribution

Abstract:The objective of this study was to research the fast pathogenic damage ofShigellaboydiifrom yak in BALB/c mice organs except intestine.The 4-week-old mouse were given 0.5 mL ofShigellaboydiiisolate(2×109CFU·mL-1)by gavage.Tissue samples of cerebrum，heart，liver，spleen，lung，kidney，intestine and pancreas were taken from the infected mouse after being infected for 6，18，30，42，54 and 66 h，and ever since for every 12 hours to make tissue biopsies，which were then stained with haematoxylin and eosin (H.E) and immunohistochemistry to observe the changes of histopathology and the bacterial antigen localization in experimentally infected ducklings.Mouse serum were collected for biochemical indicators detection including lactate dehydrogenase，urea，creatinine，α amylase，triglyceride，total protein，albumin，phosphokinase，CO2binding force，P，blood glucose and white blood cell count.The HE staining results showed a series of pathologic changes，not only the pathological damage in intestine epithelial cell as reports in other references，but also coagulation necrosis under the epicardium，cellular infiltration and granuloma in hepatic cells，inflammatory cells infiltrating in alveolar wall，pancreas epithelial cell swelling and cytoplasm dissolving and karyopyknosis or fragmentation.Immunochemistry staining results showed that positive bacterial antigen signals were found in cytoplasm of cardiac muscle cell，hepatocyte，alveolar wall，renal tubular epithelium cell，islet cell and intestinal epithelial cell.Pathological damages，heart and hepatic necrosis ofShigellaboydiifrom yak experimentally infecting mice was first reported in this study.Eleven kinds of blood biochemical indexes of experimental mice changed apparently in each infected time point except triglyceride.This study verified that the severity of the pathology was positively correlated with theShigellaboydiiantigen distribution.It was concluded that the isolate was the pantropic bacteria injuring most tissues and cells in mouse，and as well as intestinal，heart，liver，lung，pancreas and kidney were the principal target organs.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.021

收稿日期：2015-05-05

基金項(xiàng)目：中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金青年教師基金項(xiàng)目(2015NZYQN55)；牛羊主要疫病綜合防控技術(shù)集成、創(chuàng)新與應(yīng)用(2012BAD13B06-4)

作者簡(jiǎn)介：冉丹丹(1988-)，女，土家族，貴州沿河人，助教，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病防治研究，Tel:028-85709991，E-mail:244934359@qq.com *通信作者：湯承，E-mail:tangcheng101@163.com

中圖分類號(hào)：S852.61；S852.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)02-0367-07