抗菌肽JH-3的抑菌活性及其穩(wěn)定性分析

魏曉曉，杭柏林，馬　翠，夏一赫，張冰清，王　青，徐彥召，胡建和

(河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003)

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抗菌肽JH-3的抑菌活性及其穩(wěn)定性分析

魏曉曉，杭柏林*，馬翠，夏一赫，張冰清，王青，徐彥召，胡建和*

(河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003)

摘要：對牛血紅蛋白源抗菌肽P3進行氨基酸改造，并了解改造后抗菌肽JH-3的抑菌活性和穩(wěn)定性。通過微量稀釋法檢測了抗菌肽JH-3的最小抑菌濃度(MIC)，通過掃描電鏡觀察了細菌和真菌形態(tài)的變化，測定了抗菌肽JH-3的溶血性、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和鹽穩(wěn)定性。結(jié)果表明：抗菌肽JH-3對革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌2型)的MIC為6.25～25 μg·mL-1，對革蘭陰性菌(大腸桿菌、豬霍亂沙門菌、副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌)的MIC為3.125～50 μg·mL-1，對真菌(白色念珠菌)的MIC為12.5 μg·mL-1，均具有良好的抗菌活性。經(jīng)抗菌肽JH-3處理后，大腸桿菌細胞表面出現(xiàn)皺縮、孔洞；金黃色葡萄球菌出現(xiàn)菌體皺縮，細胞的完整性受到破壞；白色念珠菌細胞表面出現(xiàn)凹陷、突出、裂痕。在 6～100倍MIC時312.5 μg·mL-1抗菌肽JH-3的溶血率僅12.84%；75～100 ℃的高溫、80～100 mmol·L-1的高濃度NaCl和pH 4.0及pH 10.0的高酸堿性對抗菌肽JH-3的抑菌活性沒有明顯的影響。研究結(jié)果為抗菌肽JH-3的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，且抗菌肽JH-3有替代抗生素成為新抗菌藥物的潛力。

關(guān)鍵詞：抗菌肽JH-3；抑菌活性；溶血性；穩(wěn)定性

自弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素后，抗生素對人類的貢獻居功甚偉。但是，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，一些負面問題日益突出。抗生素的大量使用和濫用導(dǎo)致了耐藥性菌株的不斷出現(xiàn)，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)[1]和耐萬古霉素腸球菌(VER)[2]等，使得臨床疾病的治療愈發(fā)困難。同時藥物殘留對人類的健康威脅也愈發(fā)嚴重[3]。有效且安全的新抗生素研發(fā)成功往往滯后于耐藥性菌株的出現(xiàn)。許多國家已禁止在動物飼料中應(yīng)用抗生素[4-5]。因此，選擇抗生素替代物成為必然選擇。抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是機體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分[6]，參與機體的第一道防線，具有抗菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等活性[7-8]。與抗生素相比，抗菌肽的抗菌機制獨特、不易誘發(fā)耐藥性、安全度較高[9-10]，因此，抗菌肽是抗生素的理想替代品[11]。

目前，通過不同方法獲得的抗菌肽已達2 500多種[12]。但是，許多抗菌肽存在抑菌活性不強、溶血性、細胞毒性等缺點。因此，提高抗菌肽抑菌活性、降低其對機體毒性是現(xiàn)在研究的熱點。P3是一株牛紅細胞血紅蛋白源抗菌肽，具有一定的抗菌活性[13-14]。但是，人工合成P3的抗菌活性低。對已有抗菌肽的氨基酸序列進行改造是提高抗菌肽抗菌活性的一條有效途徑。因此，本研究對P3的氨基酸進行了分析，設(shè)計了一條P3類似多肽JH-3，通過MIC測定、SEM(掃描電鏡觀察)對JH-3的抑菌活性及其穩(wěn)定性和溶血性等進行了綜合分析，以期為JH-3的進一步開發(fā)提供科學(xué)的依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1抗菌肽抗菌肽JH-3由上海吉爾生化有限公司采用固相法合成，電噴射質(zhì)譜鑒定，反相高效液相色譜純化，純度>97%。1.1.2試驗菌株和試劑大腸桿菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC29213)、白色念珠菌(ATCC90029)等菌株均購自ATCC，沙門菌(CVCC503)、鏈球菌2型(CVCC606)、副豬嗜血桿菌(CVCC3728)、胸膜肺炎放線桿菌(CVCC268)等菌株均購自CVCC。TSB(Tryptic Soy Broth，Solarbio公司)，胎牛血清(Gibco公司)，氨芐青霉素(Solarbio公司)，制霉菌素(Solarbio公司)，胰蛋白胨(Oxoid公司)，酵母提取物(Oxoid公司)。其他試劑為國產(chǎn)分析純。1.1.3實驗器材打孔器(?為3 mm，北京普波斯生物有限公司)，高壓滅菌鍋(日本Hirayama公司)，生物安全柜(美國Thermo Scientific公司)，37 ℃培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，高速離心機(美國Thermo Scientific公司)，多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司)，掃描電子顯微鏡(美國FEI公司)。

1.2試驗方法

1.2.1理化特性的預(yù)測通過抗菌肽數(shù)據(jù)庫APD(http：//aps.unmc.edu/AP/main.php)對JH-3和P3的氨基酸序列進行理化特性預(yù)測。進入網(wǎng)站后選擇“Calculation & Prediction”，在方框中輸入抗菌肽序列，點擊“submit”，會得到相對分子質(zhì)量、總電荷數(shù)和疏水率等數(shù)據(jù)。

1.2.2抑菌活性的測定根據(jù)微量稀釋法[15]測定抗菌肽抑菌活性。挑取細菌分別接種于TSB培養(yǎng)基(pH 7.2)或含5%胎牛血清的LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，pH 7.2)中，37 ℃培養(yǎng)12 h。再進行新鮮培養(yǎng)3 h，于4 ℃、4 000 r·min-1的條件下離心10 min，棄去上清，用PBS懸浮細菌，離心，棄上清，再用磷酸緩沖液(PBS，pH 7.4)懸浮細菌，調(diào)整細菌濃度為1.0×106CFU·mL-1，取50 μL加入96孔板中，然后分別加入用滅菌水稀釋的200、100、50、25、12.5、6.25和3.125 μg·mL-1的抗菌肽50 μL，37 ℃作用24 h，肉眼觀察菌液澄清度，菌液渾濁表明有菌生長，渾濁和澄清分界處的抗菌肽濃度即為MIC。每個稀釋度3個重復(fù)。

1.2.3電鏡觀察分別調(diào)整對數(shù)生長期大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的濃度為1.0×106CFU·mL-1，以加入MIC濃度的抗菌肽為試驗組，以不加抗菌肽的菌液為對照組；37 ℃作用30 min；然后按照掃描電鏡樣品制備方法進行處理菌液，送新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院電鏡實驗室觀察菌體形態(tài)變化。

1.2.4溶血性的測定按照文獻[16]進行溶血性的測定。通過耳緣靜脈以無菌操作采集新西蘭兔血液，用肝素進行抗凝。抗凝血經(jīng)1 000×g離心5 min，棄去上清液，沉淀經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，再用PBS稀釋，并調(diào)整紅細胞濃度為1%(體積百分數(shù))。稀釋抗菌肽，使其濃度分別為312.5、31.25和3.125 μg·mL-1，然后等體積加入紅細胞懸液，以PBS為陰性對照，1%(體積百分數(shù))Tritonx-100為陽性對照，37 ℃作用1 h，1 000×g離心5 min，取上清液，依次加入96孔板中，用酶標(biāo)儀測定OD值(波長540 nm)，根據(jù)OD值來計算溶血率。溶血率(%)=(試驗組OD值-陰性對照OD值)/(陽性對照OD值-陰性對照OD值)×100%。

1.2.5穩(wěn)定性分析以大腸桿菌為試驗菌株，通過瓊脂糖平板擴散法[7]檢測抗菌肽的活性。將1 mg·mL-1的抗菌肽JH-3分別放在0、25、50、75和100 ℃中處理30 min，以檢測抗菌肽的熱穩(wěn)定性。用濃度為250、200、150、100和50 mmol·L-1的NaCl溶液稀釋抗菌肽，使抗菌肽濃度為1 mg·mL-1，作用30 min，以檢測抗菌肽的鹽穩(wěn)定性。用1 mol·L-1的HCl和NaOH調(diào)整LB培養(yǎng)基的pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，以檢測抗菌肽的酸堿穩(wěn)定性。

2結(jié)果

2.1設(shè)計抗菌肽JH-3理化特性

將正電荷引入抗菌肽序列，可以影響抗菌肽與細菌細胞膜的結(jié)合效率，可提高殺菌活性?？咕腏H-3是將牛血紅蛋白源抗菌肽P3的第一位纈氨酸(V)和第二位天冬氨酸(N)都替換為精氨酸(R)后設(shè)計并合成的類似物多肽，其分子式為RRFKLLSHSLLVTLASHL。從表1中可以看出，抗菌肽JH-3的靜電荷比原抗菌肽P3增加了2個凈電荷數(shù)。

2.2抑菌活性檢測

2.2.1抗菌肽JH-3的抑菌活性從表2可以看出，JH-3的抑菌活性比原抗菌肽P3的高。JH-3對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌和真菌的抑菌活性略有不同，對測定的革蘭陰性菌的MIC為3.125～50 μg·mL-1，對革蘭陽性菌的MIC為6.25～25 μg·mL-1，對真菌的MIC為12.5 μg·mL-1，表明抗菌肽JH-3具有廣譜的抗菌活性。

表1設(shè)計肽JH-3的理化性質(zhì)

Table 1Properties of design peptide JH-3

表2抗菌肽JH-3 MIC的測定

Table 2 Determination MIC of antimicrobial peptide JH-3

ND.No detection

2.2.2電鏡觀察從圖1的掃描電鏡可以看出，經(jīng)過MIC濃度的抗菌肽處理30 min后，大腸桿菌菌體已經(jīng)發(fā)生了明顯的變化，菌體細胞表面凹凸不平，某些細菌斷裂，表面出現(xiàn)孔洞性開口，導(dǎo)致細菌內(nèi)含物泄漏(圖1D)；金黃色葡萄球菌形態(tài)發(fā)生變化，菌體皺縮，細胞的完整性受到破壞(圖1E)；白色念珠菌細胞膜表面出現(xiàn)凹陷、突出、裂痕(圖1F)。這表明，抗菌肽JH-3嚴重破壞了革蘭陰性菌、革蘭陽性菌和真菌細胞的完整性。

2.3溶血活性測定

如圖2所示，在312.5 μg·mL-1時，抗菌肽JH-3的溶血率為12.84%，遠遠低于50%，而這一濃度超過抗菌肽MIC的6～100倍。這表明，抗菌肽JH-3對紅細胞的滲透脆性影響很小，有較高的安全性。

2.4穩(wěn)定性分析

一些外界因素會影響抗菌肽的抑菌活性，如溫度、離子強度、酸堿性等。由圖3A可知，1 mg·mL-1的抗菌肽JH-3經(jīng)不同溫度處理30 min，抑菌活性隨著溫度增加而有所減弱，但是在100°C處理30 min后，JH-3抗菌肽仍具有抑菌活性。這表明，抗菌肽JH-3具有一定的熱穩(wěn)定性。由圖3B 可知，JH-3抗菌肽在小于或大于0.9%(154 mmol·L-1)NaCl鹽溶液中，其抑菌活性僅輕微減弱，這表明，離子濃度對抗菌肽JH-3的抑菌活性沒有顯著影響。由圖3C可知，在pH為7時，抗菌肽JH-3的抑菌活性最高，而在pH 4～7和pH 7～10時，抗菌肽JH-3仍有抑菌活性。這表明抗菌肽JH-3可以在較寬的pH范圍內(nèi)發(fā)揮抑菌活性。

3討論

近年來，由于傳統(tǒng)抗生素不合理使用所造成的細菌耐藥、藥物殘留問題日漸突出，且對人類的健康造成了極大的威脅[17-18]。在尋找傳統(tǒng)抗生素替代品的過程中，抗菌肽以其分布廣、不易產(chǎn)生耐藥性、不易產(chǎn)生藥物殘留的優(yōu)點而受到廣泛關(guān)注[6，19]，但是在實際應(yīng)用過程中，某些天然抗菌肽存在抗菌活性不高、會對宿主細胞產(chǎn)生一定的毒性和溶血性等缺陷[6，16，19]，這在一定程度上阻礙了抗菌肽的臨床應(yīng)用。因此，尋找高效抗菌活性的抗菌肽成為必然趨勢。

目前，一般認為抗菌肽的電荷量和疏水性會影響其抗菌活性[20]。因此，在抗菌肽的研究過程中，通常采用改變其多肽鏈電荷量或疏水性的方式對天然抗菌肽進行分子改造，以獲得具有良好抑菌活性、

且細胞毒性較小的抗菌肽類似物。A.P.Subasinghage等[21]以賴氨酸(K)替代抗菌肽XT-7序列中的甘氨酸(G)降低其溶血性，而且還增加了對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的殺菌能力。H.S.Ahn等[22]將昆蟲防御素片段Tenecinl中的三個氨基酸突變?yōu)閺妷A性的色氨酸(W)和賴氨酸(K)，使無活性的片段具備了抗真菌和抗細菌活性，且溶血性并無增加。JH-3是通過對牛紅細胞血紅蛋白源抗菌肽P3的氨基酸序列進行分子改造設(shè)計的類似物，以精氨酸(R)分別替代P3序列N段的纈氨酸(V)、天冬氨酸(N)，有效提高了正電荷量。抑菌試驗結(jié)果表明，改造后的JH-3對細菌和真菌的殺菌作用有明顯的提高，且溶血率較低，對鹽、熱和酸堿的穩(wěn)定性較好。下一步，將通過色氨酸或賴氨酸等替換P3或JH-3中的部分氨基酸，進行抗菌活性及溶血率和穩(wěn)定性等方面的檢測，以期找到更好的有價值的抗菌肽。

目前，關(guān)于抗菌肽的作用機制尚無統(tǒng)一的理論體系。但是，大多數(shù)人認為作用于細菌細胞膜是抗菌肽發(fā)揮抗菌活性的關(guān)鍵[19]。本試驗通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，抗菌肽JH-3處理后的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌出現(xiàn)不同程度的受損，如細胞表面出現(xiàn)皺縮、孔洞樣結(jié)構(gòu)、凹陷、突出、裂痕等，表明抗菌肽JH-3作用于細菌后，破壞了細胞膜的完整性。

抗菌肽抗菌活性的穩(wěn)定性會受到許多因素的影響，如溫度、酸堿性、離子濃度等[23]。溫度過高會逐漸降低抗菌肽的抗菌活性。吳瓊英等[24]研究乳源抗菌肽抑菌活性時，發(fā)現(xiàn)抗菌肽對金黃色葡萄球菌的抑制活性隨著溫度的升高逐漸減弱。pH可以影響抗菌肽的抗菌能力。S.G.Dashper等[25]發(fā)現(xiàn)抗菌肽kappacin的抗菌活性在酸性環(huán)境下才具有活性，認為pH影響抗菌肽與細胞膜的結(jié)合。離子導(dǎo)致的電荷變化會使抗菌活性降低。大多數(shù)β-防御素在150 mmol·L-1氯化鈉濃度下會喪失生物活性[26]。本試驗對抗菌肽JH-3耐熱性、酸堿穩(wěn)定性和離子穩(wěn)定性進行了初步評價，結(jié)果表明，抗菌肽JH-3具有較好的耐熱性、酸堿穩(wěn)定性和離子穩(wěn)定性。這為抗菌肽JH-3今后的實際應(yīng)用提供了良好的理論基礎(chǔ)。

4結(jié)論

抗菌肽JH-3具有較好的抗革蘭陽性菌、抗革蘭陰性菌和抗真菌的活性，使細菌或真菌的細胞表面出現(xiàn)孔洞結(jié)構(gòu)、凹陷、皺縮、裂痕，有較低的溶血率，有較好的耐熱性、酸堿穩(wěn)定性和離子穩(wěn)定性?？咕腏H-3具有代替抗生素在臨床上應(yīng)用的潛力，為開發(fā)新型抗菌藥物提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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(編輯白永平)

Analysis of Antimicrobial Activity and Stability of Antibacterial Peptide JH-3

WEI Xiao-xiao，HANG Bo-lin*，MA Cui，XIA Yi-he，ZHANG Bing-qing，WANG Qing，XU Yan-zhao，HU Jian-he*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanInstituteofScienceandTechnology，Xinxiang453003，China)

Key words:antibacterial peptide JH-3；antibacterial activity；haemolytic activity；stability

Abstract:The aim of the present study was to modify antimicrobial peptide P3 from bovine hemoglobin on amino acid，and to know the antibacterial activity and stability of the antibacterial peptide JH-3 modified based on P3.The minimum inhibitory concentrations (MIC) of JH-3 against several bacteria were detected with the method of serial dilution.The morphology changes of bacterial and fungus were observed by scanning electron microscope (SEM).The hemolytic activity，thermal stability，acid base stability and salt stability of the antibacterial peptide JH-3 were determined.The results showed that the MIC of JH-3 against gram positive bacteria (Staphylococcusaureus，Streptococcussuis2 type) was between 6.25-25 μg·mL-1.The MIC against Gram negative bacteria (Escherichiacoli，Salmonellacholeraesuis，Haemophilusparasuis，Actinobacilluspleuropneumoniae) was between 3.125-50 μg·mL-1.The MIC against fugus (Moniliaalbicans) was 12.5 μg·mL-1.Shrinkage and holes appeared on the surface of treatedE.colicells.Shrinkage and incomplement presented on the cell surface ofS.Aureus.AndM.albicanshowed sunken，protruding and crack.Hemolytic rate of JH-3 was only 12.84% at 312.5 μg·mL-1(6-100 times MIC).At the condition of 75-100 ℃，80-100 mmol·L-1NaCl，pH 4 and pH 10，the antimicrobial activity of JH-3 was not changed significantly.These findings provided theoretical basis for the clinical application of antimicrobial peptide JH-3，and antibacterial peptide JH-3 has the potential as the new antibacterial drugs instead of antibiotics.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.020

收稿日期：2015-07-08

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31372469)；河南省科技計劃項目(142300410142)；河南省高校科技創(chuàng)新團隊支持計劃(15IRTSTHN)；河南科技學(xué)院2015年大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目(2015CX035)；教育部2015年國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目(201510467005)

作者簡介：魏曉曉(1990-)，女，河南商丘人，碩士生，主要從事動物病原與新獸藥的研究，E-mail：weixiaoxiao926@163.com *通信作者：胡建和，E-mail:hujianhe@hist.edu.cn；杭柏林，E-mail:yzhbl001@126.com

中圖分類號：S852.4

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0361-06