雞Perilipin1基因啟動(dòng)子的克隆及分析

周緯男，史銘欣，喬書培，史洪巖，王宇祥

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省普通高等學(xué)校動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030)

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雞Perilipin1基因啟動(dòng)子的克隆及分析

周緯男，史銘欣，喬書培，史洪巖，王宇祥*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省普通高等學(xué)校動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030)

摘要：旨在研究雞脂滴包被蛋白基因(Perilipin1，Plin)啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)及特征。本研究采用PCR方法擴(kuò)增了雞Perilipin1基因5′側(cè)翼區(qū)約2 kb的DNA片段，并對(duì)其進(jìn)行了克隆、測(cè)序及生物信息學(xué)分析；同時(shí)，構(gòu)建了其全長及系列截短突變的報(bào)告基因表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞系(DF-1)，用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)測(cè)定了熒光素酶活性，確定了該基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，雞Perilipin1基因的啟動(dòng)子區(qū)不存在典型的TATA box結(jié)構(gòu)和CpG島，但可能存在TFIID、Sp1、AP2、PPAR、RXR、SREBP1、C/EBP、GATA、ER、KLF5等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；報(bào)告基因分析結(jié)果表明，本研究克隆的雞Perilipin1基因啟動(dòng)子能夠極顯著地啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)(P<0.01)，并且隨著啟動(dòng)子片段由5′端逐漸截短，報(bào)告基因活性表現(xiàn)出逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，其中-360/-11片段具有最強(qiáng)的報(bào)告基因活性。綜上表明，雞Perilipin1基因-360/-11區(qū)域的啟動(dòng)子片段具有最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，包含該基因的核心啟動(dòng)子序列。

關(guān)鍵詞：雞；脂滴包被蛋白；啟動(dòng)子；克隆；分析

脂滴是脂肪細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)最主要的儲(chǔ)存場(chǎng)所，在過去的很長一段時(shí)間內(nèi)，脂滴一直被認(rèn)為是一個(gè)“惰性”的細(xì)胞器，僅被用來儲(chǔ)存能量，并在細(xì)胞需要能量時(shí)予以供給。然而越來越多的研究表明，脂滴不僅僅是一個(gè)簡(jiǎn)單的能量儲(chǔ)存器，它還是一個(gè)復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)變化的多功能細(xì)胞器[1]。目前，脂滴的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被研究的比較清楚，脂滴是由膽固醇酯和甘油三酯組成的非極性核心、膽固醇和磷脂組成的極性單分子層和其表面的許多功能性蛋白構(gòu)成的。脂滴表面的這些蛋白對(duì)于脂滴的代謝及調(diào)節(jié)具有十分重要的意義。脂滴包被蛋白(Perilipin1，Plin)是脂滴表面含量最多的一種蛋白，對(duì)于脂滴的代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用[2]。哺乳動(dòng)物的研究表明，Perilipin1在脂肪細(xì)胞脂解過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，Perilipin1包被在脂肪細(xì)胞中脂滴的表面，通過阻止脂肪細(xì)胞中甘油三酯水解酶接近脂滴來抑制脂肪細(xì)胞的脂解作用[3]；另一方面，在兒茶酚胺的刺激下，Perilipin1可被蛋白激酶A(Protein kinase A，PKA)高度磷酸化而有利于脂解酶接近脂滴表面并促進(jìn)脂解作用[4]。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面，Perilipin1基因的轉(zhuǎn)錄主要受過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(PPARγ)、雌激素受體相關(guān)受體α(ERRα)和肝X受體(LXR)的調(diào)控[5-7]。另外，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、維甲酸相關(guān)孤核受體α(RORα)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、17-β雌二醇、促?；鞍?ASP)、血清淀粉樣蛋白A(SAA)、雌激素受體α(ERα)等可通過影響Perilipin1基因的表達(dá)來影響脂類代謝[8-15]。

家禽的脂肪代謝規(guī)律與哺乳動(dòng)物有諸多不同，為揭示Perilipin1基因在家禽脂質(zhì)代謝過程中的作用，國內(nèi)外研究者開展了大量的研究工作，并獲得了一系列重要的研究成果。趙小玲等發(fā)現(xiàn)，Plin基因在雞腹脂和皮下組織中的發(fā)育性表達(dá)隨個(gè)體日齡的增長明顯上升，而且腹脂Plin基因的發(fā)育性變化同皮脂厚的發(fā)育性變化呈極顯著正相關(guān)，胸肌Plin基因的發(fā)育性變化同肌內(nèi)脂肪含量的發(fā)育性變化呈極顯著正相關(guān)[16]。潘志雄等發(fā)現(xiàn)，鵝Perilipin基因主要表達(dá)于腹脂和皮脂，而且填飼會(huì)引起PerilipinmRNA在鵝肝中表達(dá)豐度的極顯著增加[17]。本課題組前期利用雞全基因組芯片篩選7周齡肉雞脂肪組織特異表達(dá)基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，雞Perilipin1基因在脂肪組織中高表達(dá)，同時(shí)代謝通路分析表明，雞Perilipin1基因參與影響脂類代謝的重要調(diào)控通路—PPAR信號(hào)通路。隨后，又在雞Perilipin1基因的結(jié)構(gòu)、組織表達(dá)特性、基因的多態(tài)性與體組成性狀的相關(guān)性以及基因功能等方面進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Perilipin1可促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積[18]。

本研究利用PCR、生物信息學(xué)分析及報(bào)告基因檢測(cè)等方法對(duì)雞Perilipin1基因的啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆及分析，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與脂質(zhì)代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并初步確定了該基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域，這些結(jié)果為深入研究雞Perilipin1基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

克隆載體pEASY-T1 Simple Cloning Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；LA Taq酶購自寶生物工程(大連)有限公司；各種限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自NEB公司；凝膠回收(小量)試劑盒、質(zhì)粒(小量)抽提試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；Lipofectamine?2000 Reagent購自Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自Promega公司；熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic、啟動(dòng)子活性對(duì)照質(zhì)粒pRL-TK、雞胚成纖維細(xì)胞系(DF-1)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2方法

1.2.1雞Perilipin1基因啟動(dòng)子的克隆根據(jù)雞Perilipin1基因的mRNA序列(GenBank accession No.：GU327532.1)及雞的全基因組序列(http：//genome.ucsc.edu，UCSC)設(shè)計(jì)1對(duì)引物，用于克隆雞Perilipin1基因的啟動(dòng)子。將第一外顯子的第一個(gè)堿基定義為+1，上游引物命名為Plin-1992，下游引物命名為Plin-11，序列詳見表1，上游引物引入KpnⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線表示)。以雞基因組為模板，利用LA Taq對(duì)雞Perilipin1基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后連接到pEASY-T1 Simple載體上，重組質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ酶切鑒定正確后，送上海英駿公司測(cè)序。

1.2.2雞Perilipin1基因啟動(dòng)子的序列分析針對(duì)克隆測(cè)序獲得的雞Perilipin1基因啟動(dòng)子區(qū)序列(全長1 982 bp)，利用Promoter 2.0 Prediction Server等在線軟件進(jìn)行啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的特征分析(表2)。

表1引物序列

Table 1Primers sequence

表2啟動(dòng)子在線分析軟件

Table 2Software online for promoter analysis

1.2.3細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)將一管(1 mL)液氮保存的DF-1細(xì)胞置于37 ℃的水中，快速搖動(dòng)凍存管至細(xì)胞完全融化。用75%酒精清潔凍存管外壁后，將細(xì)胞懸液加入到裝有10 mL 37 ℃預(yù)熱的完全培養(yǎng)基的離心管中，輕輕吹打混勻，1 000 r·min-1離心10 min。棄上清，加入10 mL完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞沉淀，全部接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后換液。

待細(xì)胞生長至80%～90%匯合時(shí)，棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，然后加入37 ℃預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA混合消化液，37 ℃消化細(xì)胞約2～3 min至細(xì)胞呈流沙狀，立即加入適量完全培養(yǎng)基終止消化，重懸細(xì)胞，按照1∶4的比例進(jìn)行傳代，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后換液。

1.2.4啟動(dòng)子活性分析待傳代后的細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，按Lipofectamine?2000 Reagent說明書進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。啟動(dòng)子活性分析共進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，每次3個(gè)平行試驗(yàn)，啟動(dòng)子活性用Fluc/Rluc比值表示。

1.2.5數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)用JMP 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2結(jié)果

2.1雞Perilipin1基因啟動(dòng)子的克隆

本課題組前期的研究結(jié)果顯示，雞Perilipin1基因位于10號(hào)染色體，其mRNA序列由9個(gè)外顯子、8個(gè)內(nèi)含子組成(ATG位于第2外顯子上)。在此基礎(chǔ)上，本研究根據(jù)雞Perilipin1基因的mRNA序列(GenBank accession No.：GU327532.1)及雞的全基因組序列(http：//genome.ucsc.edu，UCSC)設(shè)計(jì)1對(duì)引物(Plin-1992/Plin-11)，以雞基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條特異性條帶，通過克隆測(cè)序后發(fā)現(xiàn)該片段長度為1 982 bp，與預(yù)測(cè)目的片段大小一致。重組質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ、XhoⅠ酶切鑒定，結(jié)果顯示，載體和目的基因條帶大小均與理論值相符(圖1)，進(jìn)一步的測(cè)序結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2雞Perilipin1基因啟動(dòng)子的序列分析2.2.1同源性分析根據(jù)人Perilipin1基因的完整序列(GenBank accession No.：NG_029172.1)，小鼠Perilipin1基因的mRNA序列(GenBank accession No.：NM_175640.2，No.：NM_001113471.1)及小鼠的全基因組序列(http：//genome.ucsc.edu，UCSC)，查找并確定人、小鼠Perilipin1基因第1外顯子上游的2 000 bp基因序列，并將這兩段序列與本研究中克隆獲得的雞Perilipin1基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行了比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雞Perilipin1基因啟動(dòng)子序列與人、小鼠的啟動(dòng)子序列同源性分別為40.44%和40.62%(表3、圖2)。

表3Clustal軟件對(duì)不同物種Perilipin1基因啟動(dòng)子序列同源性的分析結(jié)果

Table 3Identity alignment ofPerilipin1 gene promoter sequence among different species by Clustal2.1

2.2.2啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)與分析對(duì)擴(kuò)增獲得的雞Perilipin1基因5′側(cè)翼序列進(jìn)行啟動(dòng)子分析時(shí)，不同的在線軟件分析結(jié)果有所不同。Promoter 2.0和Neural Network Promoter Prediction(NNPP)軟件在該片段中預(yù)測(cè)出潛在的啟動(dòng)子位置及序列(表4、表5)，而Promoter Scan和FPROM軟件則在該段序列中未發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)(不存在典型的TATA box序列)(表6)。在對(duì)小鼠Perilipin1基因5′側(cè)翼序列進(jìn)行核心啟動(dòng)子預(yù)測(cè)時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果(表4、表5、表6)。但對(duì)人Perilipin1基因5′側(cè)翼序列進(jìn)行核心啟動(dòng)子預(yù)測(cè)時(shí)，Neural Network Promoter Prediction和FPROM軟件在該片段中預(yù)測(cè)出潛在的啟動(dòng)子位置、序列及TATA box位置(表5、表6)，而Promoter 2.0和Promoter Scan軟件則在該段序列中未發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)(表4)。

表4Promoter 2.0軟件對(duì)Perilipin1基因啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)結(jié)果

Table 4Promoter prediction ofPerilipin1 gene by Promoter 2.0

2.2.3CpG島的預(yù)測(cè)在CpG島的檢測(cè)中，本研究利用CpG Island Searcher軟件，以GC%為55%、GC二核苷酸比例(Observed-to-expected)為0.65、CpG島片段長度為600 bp、相鄰CpG島的間隔100 bp為檢測(cè)依據(jù)[19]進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人、小鼠、雞Perilipin1基因啟動(dòng)子序列中含有多個(gè)CpG位點(diǎn)，但均不存在典型的CpG島結(jié)構(gòu)(圖3)。

2.2.4轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)利用JASPAR和PROMO在線軟件預(yù)測(cè)雞Perilipin1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，JARPAR軟件在該序列中發(fā)現(xiàn)了79種轉(zhuǎn)錄因子共228個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，PROMO軟件發(fā)現(xiàn)了159種轉(zhuǎn)錄因子共2 374個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，兩種軟件共有的轉(zhuǎn)錄因子共16種，對(duì)應(yīng)20個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其中包括TFIID、Sp1、AP2、PPAR、RXR、SREBP1、C/EBP、GATA、ER、KLF5等轉(zhuǎn)錄因子(表7、圖4)。

2.3雞Perilipin1基因啟動(dòng)子報(bào)告基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

為進(jìn)一步確定雞Perilipin1基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域，本研究構(gòu)建了該基因的全長啟動(dòng)子及系列截短突變的報(bào)告基因重組質(zhì)粒。我們以Plin-1992/-11質(zhì)粒為模板，利用相應(yīng)引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以約500 bp的距離截短啟動(dòng)子，獲得了長度分別為1 824、1 297、828和350 bp的啟動(dòng)子片段。將這些片段進(jìn)一步亞克隆到pGL3-Basic載體上，獲得雞Perilipin1基因啟動(dòng)子系列片段缺失報(bào)告基因重組質(zhì)粒，各報(bào)告基因重組質(zhì)粒依次命名：Plin-1834/-11、Plin-1307/-11、Plin-838/-11及Plin-360/-11。重組質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ、XhoⅠ酶切鑒定，結(jié)果顯示，載體和目的片段條帶大小均與理論值相符(圖5)，進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

表5Neural Network Promoter Prediction軟件對(duì)Perilipin1基因啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)結(jié)果

Table 5Promoter prediction ofPerilipin1 gene by Neural Network Promoter Prediction

序列中的陰影字母表示預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

The letters in shadow in sequence mean the predicted transcription start site

表6FPROM軟件對(duì)Perilipin1基因啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)結(jié)果

Table 6Promoter prediction ofPerilipin1 gene by FPROM

表7雞Perilipin1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

Table 7Transcription factor binding sites prodictions of chickenPerilipin1 gene promoter

2.4雞Perilipin1基因的啟動(dòng)子活性檢測(cè)

將5種啟動(dòng)子報(bào)告基因重組質(zhì)粒分別與對(duì)照質(zhì)粒(pRL-TK)共轉(zhuǎn)染到DF1細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)報(bào)告基因活性。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Plin-1992/-11、Plin-1834/-11、Plin-1307/-11、Plin-838/-11及Plin-360/-11質(zhì)粒均具有極顯著的報(bào)告基因活性(P<0.01)，并且隨著啟動(dòng)子片段由5′端逐漸截短，報(bào)告基因活性表現(xiàn)出逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，其中Plin-360/-11質(zhì)粒具有最強(qiáng)的報(bào)告基因活性(圖6)，3次獨(dú)立試驗(yàn)得到了一致的結(jié)果。這表明，雞Perilipin1基因-360/-11區(qū)域的啟動(dòng)子片段具有最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，包含該基因的核心啟動(dòng)子序列。

3討論

PAT蛋白家族是一類包被在中性脂滴表面的結(jié)構(gòu)蛋白，它們與脂肪細(xì)胞中脂滴的代謝具有密切的關(guān)系[2]。其家族成員包括脂滴包被蛋白(Perilipin，Perilipin1)、脂肪細(xì)胞分化相關(guān)蛋白(ADRP，Perilipin2)、尾連蛋白(TIP47，Perilipin3)、S3-12(Perilipin4)和OXPAT/MLDP(Perilipin5)，它們?cè)诎被┒舜蠹s100個(gè)氨基酸的區(qū)域高度保守。

作為磷蛋白家族的主要成員之一，Perilipin1特異性的包被于脂肪細(xì)胞中脂滴的表面[20]，其在調(diào)控基礎(chǔ)脂解代謝以及刺激脂肪細(xì)胞脂解過程中發(fā)揮著重要作用。一方面，在飼喂或基礎(chǔ)條件下，Perilipin1形成一個(gè)中性脂滴的保護(hù)屏障，阻止細(xì)胞質(zhì)中的脂肪酶接近脂滴[21]，進(jìn)而抑制脂肪細(xì)胞的脂肪分解作用；另一方面，在兒茶酚胺類激素刺激、禁食或長期運(yùn)動(dòng)的狀態(tài)下，被PKA高度磷酸化的Perilipin1通過許多機(jī)制來促進(jìn)脂肪酶的作用，進(jìn)而促進(jìn)脂肪細(xì)胞的脂肪分解作用[8，22-25]。

為進(jìn)一步研究Perilipin1基因在脂肪細(xì)胞中發(fā)揮作用的機(jī)理，S.Nagai等對(duì)小鼠Perilipin1基因的5′側(cè)翼區(qū)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠Perilipin1基因啟動(dòng)子區(qū)不存在典型的TATA box、GC box和CAAT box等基本轉(zhuǎn)錄元件，并且在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近也沒有典型的啟動(dòng)子起始序列[26]。在本研究中，對(duì)雞Perilipin1基因5′側(cè)翼序列的分析結(jié)果表明，雞Perilipin1基因的啟動(dòng)子與人、小鼠Perilipin1基因的啟動(dòng)子同源性均較低，但其結(jié)構(gòu)與人的不同，與小鼠的類似，同樣也不存在TATAbox等基本轉(zhuǎn)錄元件。本研究在雞Perilipin1基因啟動(dòng)子區(qū)卻發(fā)現(xiàn)了TFIID轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)(-967～-975 bp)，該轉(zhuǎn)錄因子是TATA-box結(jié)合蛋白(TATA-box binding protein，TBP)和13種TBP協(xié)同因子(TBP-associated factors，TAFs)在體內(nèi)裝配的多蛋白復(fù)合物，可與轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合形成共激活因子，啟動(dòng)RNA轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，引發(fā)RNA合成過程，是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的基本轉(zhuǎn)錄因子[27]。因此，推測(cè)雞Perilipin1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可能與此位點(diǎn)有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，人、小鼠、雞Perilipin1基因的啟動(dòng)子區(qū)雖存在多個(gè)CpG位點(diǎn)，但均沒有典型的CpG島，暗示Perilipin1基因的表達(dá)調(diào)控受DNA甲基化影響的可能性較小。

人和小鼠上的研究結(jié)果表明，Perilipin1基因是PPARγ、ERRα和LXR的靶基因[5-7]。PPARγ直接結(jié)合于Perilipin1基因的-1 986～-1 974 bp區(qū)域，上調(diào)Perilipin1基因表達(dá)[5]；ERRα直接結(jié)合于Perilipin1基因的-414～-406 bp區(qū)域，上調(diào)Perilipin1基因表達(dá)[6]；LXR直接結(jié)合于Perilipin1基因啟動(dòng)子區(qū)域近端，下調(diào)Perilipin1基因表達(dá)[7]。本研究的結(jié)果表明，雞Perilipin1基因的5′側(cè)翼序列也存在許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如Sp1、AP2、PPAR、RXR、SREBP1、C/EBP、GATA、ER、KLF5等，但未發(fā)現(xiàn)ERRα、LXR等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)果表明，雞Perilipin1基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)與人類、小鼠的不盡相同，暗示其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制也有所區(qū)別，其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析啟動(dòng)子序列后，需要進(jìn)行啟動(dòng)子缺失突變轉(zhuǎn)化分析，目的是驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果，同時(shí)縮小啟動(dòng)子功能序列的范圍。在本研究中，生物信息學(xué)方法對(duì)雞Perilipin1基因啟動(dòng)子區(qū)域的預(yù)測(cè)結(jié)果與報(bào)告基因獲得的結(jié)果有較大不同，前者預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在-493 bp(Promoter 2.0，表4)，啟動(dòng)子區(qū)域在-1505/-1455、-1078/-1028、-700/-650三個(gè)區(qū)域(Neural Network Promoter Prediction，NNPP，表5)，后者則發(fā)現(xiàn)該基因的-360/-11區(qū)域表現(xiàn)出最強(qiáng)的啟動(dòng)子活性。究其原因，一方面是Promoter 2.0的結(jié)果僅為“臨界預(yù)測(cè)(Marginal predictions)”，即僅有65%的真實(shí)性；另一方面是NNPP軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果主要依據(jù)于人和果蠅的相關(guān)數(shù)據(jù)和算法，利用此軟件分析禽類的啟動(dòng)子也存在一定的誤差。而報(bào)告基因的結(jié)果則是在雞胚成纖維細(xì)胞中試驗(yàn)驗(yàn)證的數(shù)據(jù)，更具有可信性。因此，推測(cè)-360/-11區(qū)域包含雞Perilipin1基因的核心啟動(dòng)子序列，在該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有重要作用。但該片段中控制雞Perilipin1基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件及確切的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)尚需進(jìn)一步研究確定。

此外，報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果表明，啟動(dòng)子片段由-838/-11截短至-360/-11時(shí)，報(bào)告基因活性有極顯著的提高(P<0.01)，結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果可知，雞Perilipin1基因的-838～-360 bp區(qū)域存在GATA-2等負(fù)調(diào)控因子的結(jié)合位點(diǎn)，因此，推測(cè)這些負(fù)調(diào)控因子可能對(duì)雞Perilipin1基因的轉(zhuǎn)錄活性有一定的抑制作用[28]，其確切的調(diào)控機(jī)制有待后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

4結(jié)論

本研究成功克隆了雞Perilipin1基因的啟動(dòng)子，并對(duì)其進(jìn)行了初步的結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子活性分析。研究結(jié)果表明，雞Perilipin1基因的-360/-11區(qū)域具備最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，是其核心啟動(dòng)子區(qū)域，這些結(jié)果為深入研究雞Perilipin1基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]張淑妍，杜雅蘭，汪洋，等.脂滴——細(xì)胞脂類代謝的細(xì)胞器[J].生物物理學(xué)報(bào)，2010，26(2)：97-105.

ZHANG S Y，DU Y L，WANG Y，et al.Lipid droplet——A cellular organelle for lipid metabolism[J].ActaBiophysicaSinica，2010，26(2)：97-105.(in Chinese)

[2]BRASAEMLE D L.Thematic review series：Adipocyte biology.The perilipin family of structural lipid droplet proteins：Stabilization of lipid droplets and control of lipolysis[J].JLipidRes，2007，48(12)：2547-2559.

[3]BRASAEMLE D L，RUBIN B，HARTEN I A，et al.Perilipin A increases triacylglycerol storage by decreasing the rate of triacylglycerol hydrolysis[J].JBiolChem，2000，275(49)：38486-38493.

[4]TANSEY J T，HUML A M，VOGT R，et al.Functional studies on native and mutated forms of perilipins.A role in protein kinase A-mediated lipolysis of triacylglycerols[J].JBiolChem，2003，278(10)：8401-8406.

[5]ARIMURA N，HORIBA T，IMAGAWA M，et al.The peroxisome proliferator-activated receptor gamma regulates expression of the perilipin gene in adipocytes[J].JBiolChem，2004，279(11)：10070-10076.

[6]AKTER M H，YAMAGUCHI T，HIROSE F，et al.Perilipin，a critical regulator of fat storage and breakdown，is a target gene of estrogen receptor-related receptor alpha[J].BiochemBiophysResCommun，2008，368(3)：563-568.

[7]STENSON B M，RYDéN M，VENTECLEF N，et al.Liver X receptor (LXR) regulates human adipocyte lipolysis[J].JBiolChem，2011，286(1)：370-379.

[8]SOUZA S C，PALMER H J，KANG Y H，et al.TNF-alpha induction of lipolysis is mediated through activation of the extracellular signal related kinase pathway in 3T3-L1 adipocytes[J].JCellBiochem，2003，89(6)：1077-1086.

[9]OHOKA N，KATO S，TAKAHASHI Y，et al.The orphan nuclear receptor RORalpha restrains adipocyte differentiation through a reduction of C/EBPbeta activity and perilipin gene expression[J].MolEndocrinol，2009，23(6)：759-771.

[10]WANG Y C，KUO W H，CHEN C Y，et al.Docosahexaenoic acid regulates serum amyloid A protein to promote lipolysis through down regulation of perilipin[J].JNutrBiochem，2010，21(4)：317-324.

[11]WOHLERS L M，SPANGENBURG E E.17beta-estradiol supplementation attenuates ovariectomy-induced increases in ATGL signaling and reduced perilipin expression in visceral adipose tissue[J].JCellBiochem，2010，110(2)：420-427.

[12]WU J，JIAO Z Y，LU H L，et al.The molecular mechanism of acylation stimulating protein regulation of adipophilin and perilipin expression：Involvement of phosphoinositide 3-kinase and phospholipase C[J].JCellBiochem，2011，112(6)：1622-1629.

[13]LIU L R，LIN S P，CHEN C C，et al.Serum amyloid A induces lipolysis by downregulating perilipin through ERK1/2 and PKA signaling pathways[J].Obesity(SilverSpring)，2011，19(12)：2301-2309.

[14]LECCHI C，INVERNIZZI G，AGAZZI A，et al.Effects of EPA and DHA on lipid droplet accumulation and mRNA abundance of PAT proteins in caprine monocytes[J].ResVetSci，2013，94(2)：246-251.

[15]WEND K，WEND P，DREW B G，et al.ERα regulates lipid metabolism in bone through ATGL and perilipin[J].JCellBiochem，2013，114(6)：1306-1314.

[16]趙小玲，劉益平，羅軼，等.雞多個(gè)組織Perilipin基因表達(dá)的發(fā)育性變化與脂肪性狀的相關(guān)研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，40(2)：149-154.

ZHAO X L，LIU Y P，LUO Y，et al.Study on the relationship between developmental variants ofPLINgene expression and fatness traits in chickens[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2009，40(2)：149-154.(in Chinese)

[17]潘志雄，王繼文，唐慧，等.鵝Perilipin基因部分片段的克隆、不同品種及填飼對(duì)組織mRNA表達(dá)水平的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，41(8)：939-943.

PAN Z X，WANG J W，TANG H，et al.Cloning of goosePerilipingene，tissues expression and the effect of overfeeding on its mRNA level[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2010，41(8)：939-943.(in Chinese)

[18]周緯男，王宇祥，李輝.脂滴包被蛋白對(duì)雞前脂肪細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2012，28(9)：944-947，951.

ZHOU W N，WANG Y X，LI H.Effect of perilipin 1 on chicken preadipocyte lipid accumulation[J].ChineseJournalofCellularandMolecularImmunology，2012，28(9)：944-947，951.(in Chinese)

[19]TAKAI D，JONES P A.Comprehensive analysis of CpG islands in human chromosomes 21 and 22[J].ProcNatlAcadSciUSA，2002，99(6)：3740-3745.

[20]CASTRO-CHAVEZ F，YECHOOR V K，SAHA P K，et al.Coordinated upregulation of oxidative pathways and downregulation of lipid biosynthesis underlie obesity resistance in perilipin knockout mice：A microarray gene expression profile[J].Diabetes，2003，52(11)：2666-2674.

[21]MARTINEZ-BOTAS J，ANDERSON J B，TESSIER D，et al.Absence of perilipin results in leanness and reverses obesity in Lepr(db/db) mice[J].NatGenet，2000，26(4)：474-479.

[22]SZTALRYD C，XU G，DORWARD H，et al.Perilipin A is essential for the translocation of hormone-sensitive lipase during lipolytic activation[J].JCellBiol，2003，161(6)：1093-1103.

[23]ZHANG H H，SOUZA S C，MULIRO K V，et al.Lipase-selective functional domains of perilipin A differentially regulate constitutive and protein kinase A-stimulated lipolysis[J].JBiolChem，2003，278(51)：51535-51542.

[24]MIYOSHI H，SOUZA S C，ZHANG H H，et al.Perilipin promotes hormone-sensitive lipase-mediated adipocyte lipolysis via phosphorylation-dependent and-independent mechanisms[J].JBiolChem，2006，281(23)：15837-15844.

[25]MIYOSHI H，PERFIELD J W 2nd，SOUZA S C，et al.Control of adipose triglyceride lipase action by serine 517 of perilipin A globally regulates protein kinase A-stimulated lipolysis in adipocytes[J].JBiolChem，2007，282(2)：996-1002.

[26]NAGAI S，SHIMIZU C，UMETSU M，et al.Identification of a functional peroxisome proliferator-activated receptor responsive element within the murine perilipin gene[J].Endocrinology，2004，145(5)：2346-2356.

[27]BIENIOSSEK C，PAPAI G，SCHAFFITZEL C，et al.The architecture of human general transcription factor TFIID core complex[J].Nature，2013，493(7434)：699-702.

[28]張志威，陳月嬋，裴文宇，等.過表達(dá)雞Gata2或Gata3基因抑制Pparγ基因的轉(zhuǎn)錄[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2012，28(9)：835-842.

ZHANG Z W，CHEN Y C，PEI W Y，et al.Overexpression of chickenGata2 orGata3 suppressed the transcription ofPparγgene[J].ChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiology，2012，28(9)：835-842.(in Chinese)

(編輯郭云雁)

Promoter Cloning and Analysis of ChickenPerilipin1 Gene

ZHOU Wei-nan，SHI Ming-xin，QIAO Shu-pei，SHI Hong-yan，WANG Yu-xiang*

(KeyLaboratoryofChickenGeneticsandBreedingofMinistryofAgriculture，KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproductionofEducationDepartmentofHeilongjiangProvince，CollegeofAnimalScienceandTechnology，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

Key words:chicken；Perilipin1；promoter；clone；analysis

Abstract:The purpose of this study was to analyze the structure and characteristics of promoter of the chickenPerilipin1 gene.A DNA fragment with 2 kb was cloned from the 5′-flanking region ofPerilipin1，then sequenced and analyzed by bioinformatics methods.Subsequently，the luciferase reporter gene plasmids containing the full-length region ofPerilipin1 gene promoter and its serial truncation mutations were constructed，and transfected into chicken embryonic fibroblast cell line (DF-1).Through detecting the level of luciferase activity，the core promoter region was determined.The result of bioinformatics analysis revealed that the promoter region of the chickenPerilipin1 gene had no typical TATA box and CpG islands，but many binding sites of transcription factors，such as TFIID，Sp1，AP2，PPAR，RXR，SREBP1，C/EBP，GATA，ER and KLF5.Luciferase reporter assays demonstrated that the chickenPerilipin1 gene promoter could significantly trigger the expression of the reporter gene (P<0.01).With the promoter fragment gradually truncated from the 5′ end，luciferase activity increased correspondingly，and the -360/-11 promoter fragment showed the strongest activity.Taken together，the promoter region from -360/-11 bp has the highest transcriptional activity，which could be the core regulatory region of the chickenPerilipin1 gene.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.006

收稿日期：2015-03-04

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(青年科學(xué)基金)項(xiàng)目(31201796)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20122325120008)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-42)

作者簡(jiǎn)介：周緯男(1987-)，男，黑龍江哈爾濱人，碩士，主要從事家禽遺傳育種研究，E-mail：zwn0501@163.com *通信作者：王宇祥，副教授，E-mail：wyx2000@neau.edu.cn

中圖分類號(hào)：S831.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)02-0249-11