微量肉湯稀釋法比較分析不同培養(yǎng)時間念珠菌屬對唑類藥物的敏感性

郭莉娜 徐志鵬 王瑤 王賀 趙穎 肖盟 徐英春

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，北京 100730)

·論著·

微量肉湯稀釋法比較分析不同培養(yǎng)時間念珠菌屬對唑類藥物的敏感性

郭莉娜 徐志鵬 王瑤 王賀 趙穎 肖盟 徐英春

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，北京 100730)

目的 探討微量肉湯稀釋法檢測念珠菌屬對唑類藥物的體外敏感性時，培養(yǎng)24 h和48 h讀取MIC值的差異。方法 微量肉湯稀釋法檢測653株念珠菌對氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑的體外藥物敏感性，分別于24 h和48 h讀取MIC值，比較不同孵育時間所得MIC總一致率 (EA)、敏感性判定一致率 (CA)及敏感性判定錯誤率 (Error)。結(jié)果 絕大多數(shù)念珠菌培養(yǎng)24 h能夠生長充分并進行MIC值讀?。环跤?4 h和48 h讀取MIC值總EA較好，分別為：氟康唑 (91.9%),伏立康唑 (92.0%)，伊曲康唑 (95.6%)；CA分別為氟康唑 (96.9%),伏立康唑 (90.4%)，伊曲康唑 (88.2%)，不同菌種類型CA有差異；未發(fā)現(xiàn)極嚴重錯誤 (VME)的結(jié)果，錯誤多為一般錯誤 (MiE)，653株菌敏感性判定錯誤率ME/MiE分別為氟康唑 (1.7%/2.9%)、伏立康唑 (2.0%/10.6%)和伊曲康唑 (1.5%/13.0%)。結(jié)論 微量肉湯稀釋法檢測念珠菌屬對唑類藥物體外敏感性時，孵育24 h與48 h MIC值一致率較好，24 h讀取MIC值可縮短藥敏報告時間，減少拖尾現(xiàn)象導致的判讀錯誤。

微量肉湯稀釋法;藥敏試驗;念珠菌;唑類;MIC值

[Chin J Mycol，2016，11(6):332-336]

近幾十年來，隨著侵襲性真菌感染逐年增多，抗真菌藥物的選用以及真菌耐藥現(xiàn)象已成為臨床實際工作中的一個重要難題，特別是對于免疫受損人群[1]。臨床微生物實驗室積極開展真菌體外藥物敏感性檢測對臨床醫(yī)生合理使用抗真菌藥物、了解本地區(qū)真菌耐藥特征及流行病學研究均提供了充分的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。真菌體外藥物敏感性檢測不僅有助于選擇臨床治療可能有效的藥物，更重要的功能是避開臨床極有可能無效的藥物，即中介或耐藥。

目前多種方法可用于念珠菌體外藥物敏感性檢測，其中美國臨床和實驗室標準化委員會 (CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法被認為是金標準方法，該標準詳細規(guī)定了微量肉湯稀釋法的操作流程及藥敏判定折點。早期的標準文件M27-A3[2]指出氟康唑的MIC值讀取時間可以是24 h或48 h，但藥敏折點是基于48 h MIC值 (CLSI M27-S3)[3]，而伏立康唑和伊曲康唑的MIC讀取時間是48 h。近來CLSI委員會基于24 h培養(yǎng)制定了新的敏感性判定折點 (CLSI M27-S4)[4]及流行病學折點 (ECVs)[5]，推薦對絕大多數(shù)念珠菌來說，孵育24 h可以生長充分并進行MIC值讀取，這樣既可以為臨床更快地報告藥敏結(jié)果，又可以降低實驗室工作人員勞動量，提高工作效率。

那么究竟24 h和48 h讀取MIC有什么差異？本研究將從以下三個方面對微量肉湯稀釋法檢測念珠菌對唑類藥物體外敏感性時孵育24 h和48 h MIC值進行比較：①MIC值總一致率 (essential agreement，EA)。②敏感性判定一致率 (categorical agreement，CA)。③敏感性判定錯誤率 (Errors)，探討對于念珠菌屬，培養(yǎng)24 h和48 h讀取MIC值一致率情況。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2012～2013年從各類臨床標本中分離到的念珠菌共653株，其中包括白念珠菌364株，光滑念珠菌89株，熱帶念珠菌90株，近平滑念珠菌90株，克柔念珠菌8株，葡萄牙念珠菌4株，季也蒙念珠菌8株；質(zhì)控菌株ATCC22019近平滑念珠菌和ATCC6258克柔念珠菌。

1.2 材料與儀器

氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑標準物質(zhì) (中國食品藥品檢定研究院)；科瑪嘉顯色培養(yǎng)基 (法國科瑪嘉公司)；沙氏培養(yǎng)基 (英國OXOID公司);RPMI 1640培養(yǎng)基，含谷氨酰胺不含碳酸氫鹽并以酚紅為指示劑，使用0.165 mol/L MOPS緩沖液調(diào)pH7.0±0.1 (德國sigma-aldrich公司)；無菌U型96孔板 (江蘇省海門盛泰實驗器材廠)；全自動加樣儀器Sensititre AIM○R(賽默飛世爾科技公司)。

1.3 方法

菌種鑒定 所有菌株經(jīng)科馬嘉顯色培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)進行初步鑒定，純培養(yǎng)物采用MALDI-TOF MS (Vitek MS,法國生物梅里埃公司)質(zhì)譜儀進行準確鑒定，質(zhì)譜儀鑒定可信度低者或顯色表型與質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果不一致的菌株采用rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (internal transcribed spacer，ITS1,5.8S,ITS2)序列分析的方法準確定種，引物序列見文獻[6]。

敏感性檢測 微量肉湯稀釋法操作嚴格按照美國臨床和實驗室標準化委員會 (CLSI)推薦的方法M27-A3[2]進行，抗真菌藥物濃度范圍：氟康唑0.125～64 μg/mL，伏立康唑0.031 3～16 μg/mL，伊曲康唑0.031 3～16 μg/mL，孵育條件為35℃空氣培養(yǎng)箱，24 h和48 h各進行一次讀數(shù)，結(jié)果判讀與生長對照孔相比50%抑制的MIC值，氟康唑和伏立康唑敏感性判定折點參考文件CLSI M27-S4[4]，對于暫無可參考敏感性判定折點的菌種或抗真菌藥物參考文獻報道的流行病學折點 (ECVs)[5]。

質(zhì)量控制 每批次微量肉湯稀釋法藥敏試驗，質(zhì)控菌株ATCC22019近平滑念珠菌和ATCC6258克柔念珠菌隨試驗菌株平行操作，質(zhì)控菌株24 h和48 h MIC值范圍參考CLSI文件M27-S4[4]，質(zhì)控菌株超出參考范圍時的藥敏結(jié)果不參加最后統(tǒng)計分析。

結(jié)果分析 按照文獻[7-9]報道的計算方法，培養(yǎng)24 h和48 h MIC值總一致率 (Essential Agreement,EA)：對每一種念珠菌類型，24 h和48 h讀取的MIC值差異不超過兩個稀釋度 (包含)的菌株占總測定株數(shù)的比例；敏感性判定一致率 (categorical agreement，CA):按照CLSI M27-S4敏感性判定折點及文獻中報道的流行病學折點[4-5],對每一種念珠菌類型，24 h和48 h讀取的MIC值敏感性判定完全一致 (均為敏感、中介或耐藥)的菌株占總測定株數(shù)的比率；敏感性判定錯誤率 (Errors)：對每一種念珠菌類型，以培養(yǎng)24 h敏感性判讀結(jié)果為參考，極嚴重錯誤率 (Very Major Errors,VME)：24 h檢測結(jié)果為耐藥，48 h為敏感的菌株占總測定株數(shù)的比率 (假敏感)；嚴重錯誤率 (Major Errors,ME):24 h檢測結(jié)果為敏感，而48 h為耐藥的菌株占總測定株數(shù)的比率 (假耐藥)；一般錯誤率 (Minor Errors,MiE):24 h為耐藥或敏感，而48 h為中介 (SDD),或者24 h的結(jié)果為中介 (SDD),48 h為敏感或耐藥的菌株占總測定株數(shù)的比率。參照美國食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA)關(guān)于抗菌藥物敏感性檢測系統(tǒng)評價標準[7，10]，極嚴重錯誤率不超過1.5%，嚴重錯誤率不超過3%。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)控結(jié)果

質(zhì)控菌株ATCC22019近平滑念珠菌和ATCC6258克柔念珠菌隨試驗菌株平行操作，共測定6次，經(jīng)24 h和48 h培養(yǎng)，所測得的MIC值均在規(guī)定的范圍內(nèi)。

目前，城市軌道交通應急疏散系統(tǒng)的指揮引導，主要依賴指示標志與標志燈來實施。但該系統(tǒng)存在技術(shù)缺陷和條件限制，因此亟需采用更好的技術(shù)手段來進行突發(fā)事件時的應急疏散指揮與引導，以盡可能減少事件發(fā)生時造成的人員傷害。大功率參量陣定向揚聲器的技術(shù)較為成熟，為解決上述問題提供了有效的技術(shù)手段。

2.2 MIC值總一致率 (EA)

微量肉湯稀釋法檢測653株念珠菌對三種唑類藥物體外敏感性時，孵育24 h和48 h讀取MIC值對不同種念珠菌總一致率 (EA)分別為氟康唑 (74.4%～100%)、伏立康唑 (87.5%～100%)，伊曲康唑 (82.2%～100%)，結(jié)果見表1。對白念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌和葡萄牙念珠菌，三種唑類藥物24 h和48 h讀取MIC值差異較小，而對于近平滑念珠菌、克柔念珠菌和季也蒙念珠菌來說，24 h和48 h讀取MIC值差異較明顯，EA多數(shù)低于90%。

表1 微量肉湯稀釋法檢測653株念珠菌對三種唑類藥物的體外敏感性，孵育24 h和48 h后MIC值比較

Tab.1 Susceptibilities of 653Candidaisolates to three azoles as determined by the CLSI broth microdilution method after 24 h and 48 h of incubation

菌種類型(n)孵育時間(h)MIC50/MIC90(μg/mL)EA(%)氟康唑伏立康唑伊曲康唑氟康唑/伏立康唑/伊曲康唑白念珠菌(364)240.25/0.50.016/0.0640.25/0.594.8/90.7/98.1480.25/10.032/0.1250.25/0.5光滑念珠菌(89)248/320.25/11/198.9/94.4/96.64816/320.5/21/2熱帶念珠菌(90)240.5/40.032/0.250.5/193.3/94.4/98.9481/640.125/40.5/1近平滑念珠菌(90)240.5/20.016/0.0320.25/0.574.4/93.3/82.2481/20.032/0.1250.5/0.5克柔念珠菌(8)248/320.125/0.50.5/175.0/87.5/87.54832/640.25/0.50.25/2葡萄牙念珠菌(4)241/320.016/0.250.25/0.5100/100/100481/320.016/10.5/1季也蒙念珠菌(8)244/80.125/0.250.5/175/87.5/87.5488/160.25/0.50.5/2合計(653)240.25/80.032/0.250.25/191.9/92.0/95.6480.5/160.032/0.50.5/1

注：EA.MIC總一致率

2.3 敏感性判定一致率 (CA)

參考CLSI最新敏感性判定折點及流行病學折點,孵育24 h和48 h后敏感性判定見表2。MIC值差異與敏感性判定未發(fā)現(xiàn)確定的相關(guān)性，如檢測白念珠菌和葡萄牙念珠菌對伊曲康唑以及光滑念珠菌和季也蒙念珠菌對伏立康唑的體外敏感性時，盡管孵育24 h和48 h MIC值一致率 (EA)高達98.1%、100%和94.4%、87.5%，但敏感性判定一致率 (CA)僅79.7%、75%和67.4%、62.5%，孵育48 h后判讀結(jié)果更耐藥；雖然孵育24 h和48 h，近平滑念珠菌對氟康唑和伊曲康唑MIC差異 (EA)較大，但并未影響敏感性判定結(jié)果。

2.4 敏感性判定錯誤率 (Errors)

相對于24 h檢測結(jié)果，48 h檢測結(jié)果判定錯誤率見表3。未發(fā)現(xiàn)極嚴重錯誤 (VME)的結(jié)果，嚴重錯誤率除伊曲康唑?qū)饣钪榫舾行詸z測為3.4%，略高于美國FDA標準外，其余均能滿足要求；錯誤多數(shù)為一般錯誤 (MiE)，對白念珠菌和葡萄牙念珠菌，MiE多見于伊曲康唑 (19.0%)；對光滑念珠菌，MiE易見于對伏立康唑的體外敏感性 (32.6%)；熱帶念珠菌和季也蒙念珠菌對三種唑類藥物嚴重錯誤率極低，一般錯誤率較高；653株菌敏感性判定總錯誤率最低的為氟康唑 (1.7%/2.9%)，其次為伏立康唑和伊曲康唑。

表2 不同孵育時間微量肉湯稀釋法檢測653株念珠菌對唑類敏感性判定一致率

Tab.2 Categorical agreements between 24 h and 48 h MICs determined by CLSI broth microdilution for three azoles against 653Candidaisolates

菌種類型(n)孵育時間(h)氟康唑伏立康唑伊曲康唑SorWT(%)CA(%)SorWT(%)CA(%)SorWT(%)CA(%)白念珠菌(364)2499.59798.991.812.179.74896.490.711光滑念珠菌(89)2487.696.688.867.494.4914880.956.292.1熱帶念珠菌(90)2481.185.682.282.284.488.94873.364.478.9近平滑念珠菌(90)2496.797.897.895.61001004894.493.396.7克柔念珠菌(8)240100100100100100480100100葡萄牙念珠菌(4)2475100751001007548757575季也蒙念珠菌(8)2410087.510062.510087.54887.562.587.5合計(653)2494.896.994.990.448.188.24890.782.445.5

注：S.敏感，WT.野生型，CA.敏感性判定一致率

3 討 論

表3 以孵育24h結(jié)果為參照，48h檢測念珠菌體外藥物敏感性判定錯誤率(%)

Tab.3 Rates of categorical errors of MICs obtained at 48h compared with 24h incubation

菌種類型(n)氟康唑伏立康唑伊曲康唑ME(%)MiE(%)ME(%)MiE(%)ME(%)MiE(%)白念珠菌(364)1.91.12.55.81.419.0光滑念珠菌(89)03.4032.63.45.6熱帶念珠菌(90)2.212.22.215.62.28.9近平滑念珠菌(90)2.202.22.20.00.0克柔念珠菌(8)00000.012.5葡萄牙念珠菌(4)00000.025.0季也蒙念珠菌(8)012.5037.50.012.5合計(653)1.72.92.010.61.513.0

注：ME.嚴重錯誤，MiE.一般錯誤

盡管伏立康唑?qū)饣钪榫w外藥物敏感性檢測24 h和48 h EA高達94.4%，但二者CA明顯偏低 (67.4%)，文獻中報道EA和CA分別介于73.3%～99.6%和87.9%～96.0%[7，9，11]，較其他菌種類型偏低，差異主要源于48 h MIC值偏高，另外Espinel-Ingroff等[7]認為不同實驗室客觀條件及對48 h拖尾現(xiàn)象的認知也是造成這種差異的一個因素。既往研究表明拖尾現(xiàn)象已成為檢測唑類藥物對光滑念珠菌和熱帶念珠菌體外敏感性時的一個不可忽視的重要問題[12-13]，微量肉湯稀釋法檢測念珠菌對唑類藥物的體外敏感性時，約5%的菌株結(jié)果判讀時會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象[14]，即相對于對照孔真菌生長受到抑制但會持續(xù)若干個濃度梯度，拖尾嚴重的情況下可以表現(xiàn)為24 h為敏感，延長培養(yǎng)到48 h為耐藥。曾有學者提出疑問，到底“24 h敏感到48 h耐藥”這種變化是由于拖尾現(xiàn)象導致的結(jié)果判讀錯誤，還是說延長培養(yǎng)可以檢測出部分菌株的潛在耐藥性[7]。動物試驗模型表明，侵襲性念珠菌感染體內(nèi)療效與24 h MIC值相關(guān)性更好，而且臨床證實，對于存在拖尾現(xiàn)象念珠菌導致的口咽部念珠菌病，采用敏感株劑量治療即有效[13]。

微量肉湯稀釋法檢測氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑?qū)δ钪榫鷮俚捏w外藥物敏感性時，大多情況下經(jīng)24 h培養(yǎng)即可讀取MIC值，且24 h和48 h MIC值具有較好的一致率，由于拖尾等原因48 h培養(yǎng)更容易判定為假耐藥，與臨床療效不符，建議臨床微生物實驗室進行唑類藥物對念珠菌屬的體外藥物敏感性檢測時應基于培養(yǎng)24 h MIC值，從而更快速地為臨床提供有效的藥敏信息。

本研究的不足之處，首先克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌和季也蒙念珠菌菌株數(shù)量偏少，其他一些少見菌種沒能全部涵蓋，研究結(jié)論代表性不足，期待同行專家驗證和補充；其次由于CLSI M27-S4僅公布了有限幾種念珠菌對氟康唑和伏立康唑的敏感性判定折點，在數(shù)據(jù)分析時伊曲康唑及其他念珠菌屬參考了文獻報道中的流行病學判定折點，故而研究結(jié)論有待于更進一步完善和改進。

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[本文編輯] 施 慧

Comparison of azoles MICs againstCandidaspp.determined by the broth microdilution method at different incubation time

GUO Li-na,XU Zhi-peng,WANG Yao,WANG He,ZHAO Ying,XIAO Meng,XU Ying-chun

(ChineseAcademyofMedicalSciences，PekingUnionMedicalCollegeHospital，ClinicalMicrobiologyLaboratory，Beijing100730)

Objective To investigate the agreement between the 24 h and 48 h azoles MICs againstCandidaspecies by broth microdilution method.Methods Antifungal susceptibility testing was carried out by broth microdilution method against 653Candidaisolates and MICs were obtained at 24 h and 48 h incubation for assessing of essential agreement (EA),categorical agreement (CA) and categorical error (Error).Results Most ofCandidaisolates tested could obtain sufficient growth after 24 h incubation.The overall EAs of 24 h and 48 h MICs were excellent with the three azoles for most of the species,fluconazole (91.9%),voriconazole (92.0%) and itraconazole (95.6%);the overall CAs were wonderful with fluconazole (96.9%),voriconazole (90.4%) and itraconazole (88.2%),depending on the species type tested.Very major errors (VMEs) were absent in our study,minor errors were reported most of the time.The ME/MiE for the total 653Candidaisolates were fluconazole (1.7%/2.9%),voriconazole (2.0%/10.6%) and itraconazole (1.5%/13.0%).Conclusion These data suggested that the performance 24 h MIC readings gave results similar to those of 48 h MICs and reading MICs at 24 h incubation would shorten the MIC determination of azoles and avoid errors due to trailing misinterpretation.

broth microdilution method;antifungal susceptibility;Candida;triazole;MIC

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項 (2016-1-4013)

郭莉娜，女 (漢族)，碩士，助理研究員.E-mail:guo0201205@126.com

徐英春,E-mail:xycpumch@139.com

R 379.4

A

1673-3827(2016)11-0332-05

2016-08-15