肽聚糖水解酶
——一種潛在抗葡萄球菌的武器

王英利，趙克強

（河北省滄州市動物疫病預(yù)防控制中心，河北 滄州 061000）

肽聚糖水解酶
——一種潛在抗葡萄球菌的武器

王英利，趙克強

（河北省滄州市動物疫病預(yù)防控制中心，河北 滄州 061000）

金黃色葡萄球菌是引起人類和動物食源性疾病的主要病因。由于耐抗生素葡萄球菌的出現(xiàn)，使得這一類疾病的治療越發(fā)困難，迫切需要發(fā)展一些替代類藥物。大量研究表明，肽聚糖水解酶（PHs）可控制和治療這一菌屬引起的感染。肽聚糖水解酶可快速的水解并引起金黃色葡萄糖球菌死亡。通常PHs對水解金黃色葡萄球菌的細胞壁成分具有較高的特異性，也能夠裂解其他種類的葡萄球菌，對人類表皮葡萄球菌和其他的葡萄球菌同樣具有殺滅作用。一些PHs可增強抗生素的殺菌和抑菌活性，因此，PHs無論是在酶學(xué)方面還是在抗生素方面都可被視為一種潛在的藥物。一些研究表明，可以用異源性的表達系統(tǒng)來產(chǎn)生該酶類，如大腸桿菌表達系統(tǒng)。但我們更需要發(fā)展更有效的大規(guī)模生產(chǎn)此類酶的技術(shù)。

葡萄球菌；金黃色葡萄球菌；抗生素抗性；肽聚糖水解酶

葡萄球菌屬于人和動物最重要的病原菌之一，它們可以引起廣泛的疾病，如：皮膚和眼部感染、食物中毒、肺炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、骨髓炎。它的高致病性基于廣泛的毒力因子如：蛋白A、凝固酶、膠原酶、透明質(zhì)酸酶、溶血素、脂肪酶、不同的毒素、粘附蛋白以及一些影響生物膜形成的蛋白。另外金黃色葡萄球菌還發(fā)展出許多的機制來逃避感染的人類或動物體的保護性免疫應(yīng)答。其中最重要和最有特征的是葡激酶、免疫球蛋白和金黃色葡萄球菌粘合因子。

由于耐藥性的出現(xiàn)，金黃色葡萄球菌病的治療顯得尤其困難。1928年蘇格蘭生物學(xué)家弗雷明發(fā)現(xiàn)青霉素，并于20世紀(jì)40年代用于臨床治療。1942年發(fā)現(xiàn)了耐青霉素的葡萄球菌，先是在醫(yī)院隨后在醫(yī)療社區(qū)被發(fā)現(xiàn)，到20世紀(jì)60年代大約80%的在醫(yī)院和社區(qū)分離出的金黃色葡萄球菌都是抗青霉素的。為了克服產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶的金黃色葡萄球菌的感染，一些來自比徹姆醫(yī)藥公司的英國科學(xué)家發(fā)明了一個半合成的窄譜抗生素—甲氧西林。1960年杰文斯和他的同事們發(fā)現(xiàn)，從科林戴爾地區(qū)一家醫(yī)院分離的5440株金黃色葡萄球菌菌株發(fā)現(xiàn)有3株是抗甲氧西林的。隨后具有甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌菌株陸續(xù)從土耳其、印度以及波蘭等多國分離到。從甲氧西林抗性葡萄球菌分離到葡萄球菌盒式染色體（SCC）MEC。SCCmec中最重要的部分是基因MecA，它是編碼細胞壁合成的非敏感性β內(nèi)酰胺酶，叫青霉素連接蛋白2a或2′（PBP 2a or PBP 2′），一個78-kDa的蛋白與β內(nèi)酰胺類抗生素具有很低的親緣性。甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌菌株（MRSA）通常被視作是具有多重抗藥性的金黃色葡萄球菌菌株（MDR），這是由于許多耐藥性基因重組到SCCmec序列上的結(jié)果，這也是關(guān)于基因移動元素的熱點整合，如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、插入序列。

最初在醫(yī)院發(fā)現(xiàn)的耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌被稱作醫(yī)療相關(guān)MRSA（HAMRSA）。20世紀(jì)90年在西澳大利亞的土著居民身上發(fā)現(xiàn)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌被叫做醫(yī)療社區(qū)獲得性耐甲氧西林葡萄球菌（CA-MRSA)。兩者醫(yī)療相關(guān)性的克隆群不同，后者對絕大多數(shù)的抗生素敏感，但對β內(nèi)酰胺類抗生素不敏感，呈現(xiàn)出一種潛在的毒力。1997年美國最先報道社區(qū)相關(guān)一名健康兒童死于MRSA感染的案例，表明這種社區(qū)獲得性的耐甲氧西林葡萄球菌（CA-MRSA）的毒力更強。CA-MRSA對絕大多數(shù)的抗生素敏感。有數(shù)據(jù)表明MRSA感染已經(jīng)占醫(yī)院相關(guān)感染的50%，發(fā)病率和死亡率都比較高。在一些地區(qū)MRSA感染已超過50%，美國從1999-2005年MRSA感染病例增長到了62%，從294570增長到了477927人。而MRSA感染的人數(shù)增長了將近2倍，從127036人增長到了278203人。作者也提到2005年因葡萄球菌感染死亡的11400人當(dāng)中大約有6640人死于MRSA感染。MRSA通常表現(xiàn)出MDR表型，其某些菌株出現(xiàn)了糖肽抗性和對糖肽的低敏感性。糖肽對治療MRSA也變得不特效。目前發(fā)現(xiàn)了三類耐萬古霉素的葡萄球菌：耐萬古霉素葡萄球菌（VISA），異源性耐萬古霉素葡萄球菌（hVISA）及高萬古霉素耐性的葡萄球菌（VRSA）。目前從美國、伊朗和印度地區(qū)分離的耐萬古霉素葡萄球菌僅有一些（Van A基因）表現(xiàn)出萬古霉素完全抗性。VISA和hVISA對糖肽呈現(xiàn)低敏感性的潛在流行趨勢。在VISA和hVISA首次報道于日本后，這兩種菌株在世界各地陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。

葡萄球菌具有合成生物膜的功能，生物膜是一種細菌細胞產(chǎn)生的聚合體粘附于細菌細胞的表面對各種藥物呈現(xiàn)惰性或是活性。生物膜可以延緩藥物作用率和藥物滲透，使微生物體對抗生素表現(xiàn)低敏感性。之前一些研究表明，在體外抗菌活性測定過程中，有生物膜的菌體比沒有生物膜的菌體對抗生素的抗性高10～1000倍不等。

1 金黃色葡萄球菌細菌細胞壁成分

金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性球桿菌，直徑約1μm，它的細胞包被有胞壁質(zhì)球囊。其細胞壁由磷壁酸、表面蛋白，及大分子肽聚糖網(wǎng)絡(luò)。肽聚糖由糖鏈組成，糖鏈?zhǔn)怯山惶娴陌被荖-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸構(gòu)成，五干肽成分是（L-Ala-D-iso-Gln-L-Lys-D-Ala-D-Ala），它與乙酰胞壁酸的羧基端相連。每個肽干的賴氨酸部分與倒數(shù)第二個D-丙氨酸鄰近的干肽相連，其中糖鏈與短的機動肽段相交聯(lián)（Tomasz 2006）。細胞壁有壓力容器的作用，可緩解內(nèi)外壓力，抑制酶活性。它還有參與肽聚糖合成的特性。肽聚糖結(jié)構(gòu)中至少有五種化學(xué)鍵組，這些都是肽聚糖水解酶的靶位點?？缒ぬ蛭甯拾彼崾墙瘘S色葡萄球菌細胞壁的唯一組成部分，是特殊的底物溶葡萄糖球菌酶，肽聚糖水解酶具有較強的殺菌作用，可成為一類可以替代抗生素類藥物的武器，最近也被廣泛的用于臨床治療，以及食品和獸醫(yī)領(lǐng)域當(dāng)中。為了防止水解酶對細菌菌體的水解作用，細菌菌體有自己特殊的調(diào)節(jié)機制-骨干肽。一些特殊的調(diào)節(jié)如N-乙?；?，糖基化，O-乙?；?。亦或是一些胎橋氨基酸序列的修飾給細菌帶來了抗肽聚糖水解酶的能力。

2 抗葡萄球菌活性的水解酶

肽聚糖水解酶結(jié)構(gòu)中有兩個結(jié)構(gòu)域：具有催化活性的N端結(jié)構(gòu)域和C端的細胞壁結(jié)構(gòu)域。噬菌體的PHs可稱為裂解酶或內(nèi)溶酶，又叫自溶素。它們在病毒感染的宿主菌體內(nèi)具有重要作用。細菌的細胞壁是一個動態(tài)的結(jié)構(gòu)，直接受細胞循環(huán)的調(diào)節(jié)。自溶素在細菌的生長中起重要作用，菌體的分化、細胞壁的流動、為遺傳轉(zhuǎn)化提供支持、形成鞭毛、產(chǎn)生孢子以及在β內(nèi)酰胺類抗生素誘導(dǎo)下裂解細菌。

3 溶菌酶

病原性的葡萄球菌對各種溶菌酶都呈現(xiàn)出較高的抗性，如雞蛋清溶菌酶。葡萄球菌的細胞壁可降低此類酶的敏感性，有部分研究表明，這主要是由C-6位置的O甲?；约癗-乙酰胞酸殘基形成的。Bera等人的研究表明，O乙?；D(zhuǎn)肽酶在不同種類的葡萄球菌中的出現(xiàn)是導(dǎo)致溶菌酶抗性和致病性的原因。O乙酰胞壁酸只出現(xiàn)在具有致病性和溶菌酶抗性的葡萄球菌菌株中（如金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，路鄧葡萄球菌，以及其他的葡萄球菌）。所有的非致病性的葡萄球菌都對溶菌酶敏感（如肉質(zhì)葡萄球菌，沙門氏菌葡萄球菌，木糖葡萄球菌）。有報道稱葡萄球菌對溶菌酶的抗性的機制有兩種，第一：連接C-6位置的磷壁酸的甲?；５诙河捎诖竺娣e的肽聚糖的僑聯(lián)導(dǎo)致青霉素接合蛋白4活性的改變。

4 溶葡萄球菌酶

溶葡萄球菌酶是一種從模仿葡萄球菌體內(nèi)分離的Zn2+金屬蛋白酶。它能降解所有葡萄球菌菌屬的細菌的細胞壁。其活性位點是葡萄球菌專有的五干肽跨膜橋。其他的革蘭氏陰性和陽性菌對此溶菌酶不敏感。原始的溶葡萄球菌酶是由前蛋白體組成的包括33個氨基酸殘基和一個由211個氨基酸組成的肽段前體以及一個由246個氨基酸組成的成熟蛋白。N端的肽（信號肽）連接于細胞內(nèi)，被半胱氨酸蛋白酶移出細胞外的太短部分不參與降解葡萄球菌的細胞壁。已經(jīng)成熟的具有催化活性的27kDa的溶葡萄球菌酶是前體蛋白溶菌活性的4.5倍，只有這種片段的酶在將來才有一定的應(yīng)用作用。由模仿葡萄球菌產(chǎn)生的溶葡萄球菌酶不易自溶，因為它能夠表達LIF蛋白（溶葡萄球菌酶免疫因子），這種蛋白是一種在穿膜橋梁3號和5號位具有絲氨酸殘基的蛋白。組成蛋白主要是絲氨酸和丙氨酸而非甘氨酸，可以使得許多凝固酶陰性葡萄球菌降低對溶葡萄球菌酶的敏感性。因為葡萄球菌酶不水解甘氨酸-絲氨酸，絲氨酸-甘氨酸，丙氨酸-甘氨酸，甘氨酸-丙氨酸形成的肽鍵。此酶在pH為7.5溫度為40℃的時候具有最佳活性，受外源性鋅制劑的抑制如鄰菲羅啉和EDTA。

具有五干肽跨膜橋的金黃色葡萄球菌對溶葡萄球菌酶非常敏感，可以此來區(qū)分葡萄球菌和其他菌屬以及與葡萄球菌菌屬極為近似的微球菌。

溶葡萄球菌酶于1964年被發(fā)現(xiàn)，在20世紀(jì)70年代已被成功的用于治療又中性粒細胞減少引起的膿腫及由人類鼻腔內(nèi)攜帶金黃色葡萄球菌引起的感染。到20世紀(jì)90年代，有大量的報道表明溶葡萄球菌酶是一個可以治療MRSA 和VISA引起感染的潛在藥物。Climo等人通過臨床分離的甲氧青霉素抗性的葡萄球菌引起的兔子動物模型罹患主動脈瓣心內(nèi)膜炎分別使用萬古霉素和不同的靜脈給藥抗葡萄球菌素。在增加糖肽濃度的情況下，可逐步產(chǎn)生菌株對萬古霉素抗性的降低。最有效的給藥方案是將抗葡萄球菌素每天給藥3次，飼喂無菌蔬菜的兔子的治愈率是10/11。與此同時未給藥的對照組的兔子體內(nèi)菌體水平上升至8.5×103CFU/g。但由耐苯唑西林的表皮葡萄球菌引起的主動脈心內(nèi)膜炎卻需要用到萘夫西林和抗葡萄球菌酶聯(lián)合療法。這種聯(lián)合療法的效果強于這兩種藥物的單獨使用。

圣路易斯安娜州立大學(xué)的卡拉漢實驗組揭示，溶葡萄球菌酶能夠有效的治療由甲氧西林敏感性和耐甲氧西林葡萄球菌引起的角膜炎，以及由MRSA引起的眼內(nèi)炎。甲氧西林抗性的葡萄球菌菌株301（MRSA301）或者是一個低毒力的甲氧西林敏感性菌株ISP546注入兔的角膜基質(zhì)中。在感染后4～9h或10～15h每30min兔子眼睛可以被局部治愈。用早期的療法（感染后4～9h給藥），溶葡萄球菌酶可以殺滅角膜內(nèi)感染的所有的MRSA 301菌株，而對照組的角膜菌體濃度達到6.52×103CFU。感染MRSA301的角膜用萬古霉素進行治療仍然保持角膜內(nèi)菌體濃度2.3±0.85×103CFU。當(dāng)治療在（感染后10～15h）開始時用抗葡萄球菌酶治療的的眼部具體殘存要小于使用萬古霉素治療的眼睛（0.58±0.34 vs.

5.83±0.16×103CFU/眼角膜）。卡拉漢和他的同事們也檢測了由凝固酶陰性葡萄球菌引起的眼內(nèi)炎在用抗葡萄球菌酶對其的治療效果，凝固酶陰性葡萄球菌對于抗葡萄球菌酶更具有抗性，有趣的是調(diào)查的結(jié)果是成功的。用溶葡萄球菌酶對13個菌株進行的體外試驗表明，它可以顯著的降低細菌數(shù)量，只有耐甲氧西林的表皮葡萄球菌株（MRSE），科氏葡萄球菌菌株表現(xiàn)的結(jié)果不是很令人滿意。用溶葡萄球菌酶治療的耐甲氧青霉素型葡萄球菌和甲氧西林敏感性表皮葡萄球菌可有效抑制菌落形成達6倍以上。對沃葡萄球菌只是兩倍抑制，對其它種屬的葡萄球菌可以達到4倍抑制。

最近Desbois和Coote（2011）揭示出了溶葡萄球菌素和其他種類的抗菌素聯(lián)合具有協(xié)同效應(yīng)。酶的殺菌活性可被食物防腐劑或自然界中一些物質(zhì)增強。一些溶葡萄球菌素和其他制劑聯(lián)合使用可將食品產(chǎn)業(yè)中的葡萄球菌徹底根除。另外其他細菌對溶葡萄球菌素的抗性，使此酶變得非常有用。

5 Las-A葡萄球菌溶血素

除溶葡萄球菌素外，Las-A葡萄球菌溶血素的抑菌活性也已被發(fā)現(xiàn)。Las-A是由一個3kDa的信號肽，一個22kDa的前蛋白和一個20kDa的催化結(jié)構(gòu)域組成。信號肽嵌插穿過內(nèi)膜，前蛋白結(jié)構(gòu)域共價連接于一種非胞內(nèi)蛋白，之后它便被銅綠假單胞菌所產(chǎn)生的胞外蛋白酶水解。Las-A被推測出對于銅綠假單胞菌的毒力具有很重要的作用。包括胞外域脫落的細胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖的降解，以及syndecan-1和彈性蛋白在結(jié)締組織中降解。與溶葡萄球菌素相似的是這種酶也可以切割金黃色葡萄球菌細胞壁內(nèi)的五干肽橋梁。但是Las-A這種酶卻更有耐受性，它能夠在其五干肽橋梁上做部分氨基酸的修飾，使得此類酶也具有水解其他種類的葡萄球菌的功能包括：腐生葡萄球菌，表皮葡萄球菌，沃氏葡萄球菌。這種酶的詳細的催化機制已經(jīng)被Spencer等人解決，這是由于Las-A具有3個特殊的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。

實驗證明Las-A殺滅葡萄球菌比β內(nèi)酰胺類抗生素和萬古霉素更有效，但應(yīng)用此酶抗葡萄球菌感染方面還有待于進一步的研究。Las-A比溶葡萄球菌素有更廣泛的抗菌譜，它能治療由表皮葡萄球菌引起的感染。目前為止，這種酶Las-A都是從綠膿桿菌培養(yǎng)基中分離出來的。在我們看來，生產(chǎn)此類酶的新方法和它在科研領(lǐng)域的應(yīng)用將是近期需要研究的熱點。

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．03.003