DMT1:多種二價(jià)金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)載體

唐家明，鄒亞學(xué)，王秋悅，呂 林，張麗陽，羅緒剛*，李素芬*

（1.河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島 066004；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100093）

DMT1:多種二價(jià)金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)載體

唐家明1，鄒亞學(xué)1，王秋悅1，呂 林2，張麗陽2，羅緒剛2*，李素芬1*

（1.河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島 066004；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100093）

二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）是一種在哺乳動(dòng)物廣泛表達(dá)的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體，參與機(jī)體內(nèi)多種金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)。本文綜述DMT1分子結(jié)構(gòu)與分布、生理功能及其對二價(jià)金屬離子吸收的調(diào)控機(jī)制，旨在通過對DMT1在微量元素吸收中的作用機(jī)制的研究，來提高動(dòng)物微量元素的吸收效率和利用率。

DMT1；二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）又稱為自然抵抗相關(guān)巨噬蛋白2（natural resisitance associated macrophage protein 2，Nramp2），或二價(jià)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體1（divalent cation transporter 1，DCT1），屬于可溶性載體家族成員（solute carrier family 11 member 2，SLC11A2），是哺乳動(dòng)物體內(nèi)質(zhì)子偶聯(lián)的跨膜金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體。1995年，Gruenheid等在篩選小鼠天然抗性的巨噬細(xì)胞蛋白1 （Nramp1）時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)了與Nramp1同源的Nramp2。1997年，F(xiàn)leming和Gunshin兩位科學(xué)家?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)DMT1是哺乳動(dòng)物第一個(gè)跨膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。當(dāng)它被首次發(fā)現(xiàn)時(shí),由于與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Nramp1基因同源性高達(dá)78%，因此被命名為Nramp2。從DMT1發(fā)現(xiàn)以來，關(guān)于它的結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)等方面已經(jīng)獲得很多重要發(fā)現(xiàn)，對于DMT1的研究已經(jīng)成為鐵乃至整個(gè)微量元素研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)問題。

1 DMT1的分子結(jié)構(gòu)和分布

1.1 DMT1的分子結(jié)構(gòu) Gruenheid等（1995）在研究具有天然抗性的巨噬細(xì)胞蛋白 1（nature resistance-associated macrophage protein 1，Nramp1）的過程中發(fā)現(xiàn)另一種與Nrampl有極高同源性（達(dá)78%）和相似的二級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)（DMT1）。1997年哈佛大學(xué)和耶魯大學(xué)的兩個(gè)研究小組分別鑒別分離出功能基因DMT1，這是迄今為止所克隆的第一個(gè)哺乳動(dòng)物跨膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)載體。生物信息學(xué)可知DMT1的結(jié)構(gòu)和Nramp1相似，DMT1分子量為61456，等電點(diǎn)為6.02，含有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，在第7和8跨膜結(jié)構(gòu)域之間的天門冬氨酸殘基是一個(gè)糖基化位點(diǎn)，其糖基化的細(xì)胞外袢狀結(jié)構(gòu)和高度保守的細(xì)胞內(nèi)序列都具有高度的疏水性。DMT1的第4跨膜結(jié)構(gòu)域是一個(gè)重要的功能區(qū)，若此域發(fā)生突變將會(huì)嚴(yán)重影響DMTl功能的正常發(fā)揮。DMT1基因組DNA含有43999個(gè)堿基，包括16個(gè)外顯子，其cDNA有4142個(gè)堿基,所編碼蛋白含561個(gè)氨基酸，其羧基端和氨基端均位于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。DMT1與同家族Nramp1的基因同源性高達(dá)78%,氨基酸相似性達(dá)到64%，二者的主要區(qū)別在于氨基端的不同。DMT1有高度的疏水性,它的氨基端和羧基端都嵌入胞漿內(nèi)。Andrews等研究發(fā)現(xiàn)DMT1的mRNA存在“+IRE”和“-IRE”型2種形式?！?IRE”型的3’非翻譯區(qū)含有1個(gè)與運(yùn)鐵蛋白受體（TfR）mRNA的3’非翻譯區(qū)相似的鐵調(diào)節(jié)元件（iron regulatory element，IRE），“-IRE”型則沒有此元件?！?IRE”和“-IRE”分別編碼561個(gè)和568個(gè)氨基酸，其中N-端543個(gè)氨基酸相同，只有C-端18或25個(gè)氨基酸不同。DMT1 mRNA的5’調(diào)控區(qū)無TATA盒子，但包含2個(gè)CCAAT盒子，3個(gè)SP1的結(jié)合位點(diǎn)，5個(gè)金屬反應(yīng)元件（metalresponse element，MRE），2個(gè)Hif結(jié)合位點(diǎn)和1個(gè)γ-干擾素調(diào)節(jié)元件。

1.2 DMT1的體內(nèi)分布 DMT1在哺乳動(dòng)物各組織中廣泛表達(dá)，尤其在十二指腸和腎的表達(dá)最高，在胸腺和腦有中等程度的表達(dá)，而在睪丸、肝、結(jié)腸、心臟、脾、骨骼肌、肺、骨髓的含量相對較低。DMT1在小腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)主要定位在腸細(xì)胞絨毛膜刷狀緣上，但Trinder等（2000）通過共聚焦免疫熒光顯微鏡觀察小腸絨毛細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，不僅在細(xì)胞膜上有DMT1定位，在絨毛頂端胞漿中也可觀察到DMT1表達(dá)，提示DMT1可能在這些位點(diǎn)之間循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)。DMT1在腎臟中主要存在于腎臟皮質(zhì)，且從近端小管和集合管發(fā)散出，存在位置既不是頂膜，也不是基底外側(cè)膜，而是晚期胞內(nèi)體和溶酶體內(nèi)。

2 DMT1的生理功能

2.1 DMT1介導(dǎo)小腸鐵吸收和轉(zhuǎn)運(yùn) 鐵在小腸的吸收包括兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)過程，即粘膜吸收過程（鐵吸收進(jìn)入腸上皮細(xì)胞）和粘膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程（鐵從腸上皮細(xì)胞的基底側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)到血液循環(huán)），其中粘膜吸收過程是機(jī)體維持鐵平衡的最關(guān)鍵一步。Fleming等研究發(fā)現(xiàn)腸腔內(nèi)鐵主要是以二價(jià)形式經(jīng)小腸上皮頂膜上的DMT1介導(dǎo)由腸腔進(jìn)入上皮細(xì)胞內(nèi)，然后再經(jīng)基底膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（Ferroprtin1，F(xiàn)PN1）介導(dǎo)由腸細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)。DMT1介導(dǎo)的二價(jià)鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)是H+依賴的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程。在患有嚴(yán)重缺鐵性貧血小鼠和Begeade大鼠都存在相同的DMT1基因G185R位點(diǎn)突變，表明DMT1表達(dá)障礙嚴(yán)重影響小腸鐵吸收，導(dǎo)致鐵缺乏性小細(xì)胞、低色素性貧血。

運(yùn)鐵蛋白（Transferrin，Tf）和運(yùn)鐵蛋白受體（Transferrin receiptor，TfR）途徑是細(xì)胞攝取鐵的主要生理途徑。在這一過程中，內(nèi)吞小體酸化使三價(jià)鐵從Tf上釋放并變?yōu)槎r(jià)鐵。然后，二價(jià)鐵穿過內(nèi)吞小體膜進(jìn)入胞漿。Begrade大鼠能夠正常地通過Tf和TfR將鐵吸收，并在細(xì)胞內(nèi)形成內(nèi)吞小體，但隨后內(nèi)吞小體內(nèi)的鐵卻無法轉(zhuǎn)運(yùn)入胞漿。最終內(nèi)吞小體的鐵又全部返回到細(xì)胞表面，釋放回血液中。研究也已證實(shí)，DMT1 與TfR在內(nèi)吞小體上共同存在。DMT1在鐵“移位”中的重要作用，證明Tf-TfR不依賴的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制是細(xì)胞生理鐵攝取所必需的。正是Tf-TfR依賴的和Tf-TfR不依賴的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制共同作用，才能最終完成細(xì)胞生理鐵攝取的全過程。

2.2 DMT1介導(dǎo)其他金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn) DMT1能夠轉(zhuǎn)運(yùn)的金屬離子達(dá)8種之多，除了Fe2+以外，還可以轉(zhuǎn)運(yùn)Mn2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Cd2+和Pb2+。研究表明，DMT1與轉(zhuǎn)運(yùn)金屬的親和力順序?yàn)镸n2+＞Cd2+＞Fe2+＞Pb2+～Co2+～Ni2+＞Zn2+。DMT1是動(dòng)物腸道中發(fā)現(xiàn)的唯一二價(jià)錳轉(zhuǎn)運(yùn)載體，在哺乳動(dòng)物腸道錳的吸收過程中起重要作用，從胃部排出的可溶性二價(jià)錳，通過腸微絨毛DMT1的轉(zhuǎn)運(yùn)才能被機(jī)體吸收。已經(jīng)證實(shí)，DMT1參與大鼠、豬和雞腸上皮細(xì)胞對錳的攝取。DMT1突變Belgrade大鼠細(xì)胞攝取錳的能力也降低。

DMT1是否參與銅的轉(zhuǎn)運(yùn)還不清楚。用Coca-2細(xì)胞模型研究表明，在小腸細(xì)胞中DMT1的生理功能與Cu1+的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，且鐵和銅在小腸中的吸收存在拮抗關(guān)系。DMT1 IRE亞基可以轉(zhuǎn)運(yùn)銅，但是以Cu+的形式被轉(zhuǎn)運(yùn)。Espinoza等采用shRNA技術(shù)使DMT1蛋白表達(dá)沉默后，Caco-2細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)鐵、銅和鋅的量分別減少51%、25.8%和23.1%，說明DMT1不同程度地參與鐵、銅和鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)。研究也發(fā)現(xiàn)DMT1 的-IRE亞基能夠轉(zhuǎn)運(yùn)Ni2+，DMT1轉(zhuǎn)運(yùn)Cd2+可能與鎘的毒性有關(guān)。Cd2+和Mn2+能抑制鐵的運(yùn)輸，Zn2+和Pb2+卻不能，這為DMT1在Caco-2細(xì)胞直接參與攝取鐵和鎘提供了證據(jù)，其結(jié)果解釋了鐵缺乏是鎘中毒的危險(xiǎn)因素。pH依賴的Co2+運(yùn)輸也已經(jīng)被證明，但是其生理學(xué)意義尚不清楚。

3 DMT1的二價(jià)金屬離子吸收依賴調(diào)控機(jī)制

3.1 Fe對DMT1表達(dá)的影響 DMT1是十二指腸轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的主要載體，并受到體內(nèi)鐵狀況的調(diào)控。Dupic等報(bào)道，斷奶大鼠飼喂無鐵飼糧或添加2%羧酸鐵的高鐵飼糧2周，無鐵飼糧組十二指腸中與鐵吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因Dcytb、DMT1、FPN1 和TfR1的mRNA水平均提高，而高鐵飼糧組上述基因mRNA水平則明顯降低。Hansen等在21日齡斷奶仔豬脫脂奶粉-酪蛋白-玉米半純合飼糧中以硫酸亞鐵形式添加100 或500mg/kg鐵飼喂32d后，加鐵組十二指腸粘膜DMT1 mRNA水平隨鐵水平降低而降低，DMT1和FPN1蛋白水平也有降低的趨勢；在21日齡斷奶仔豬含鐵97mg/kg玉米-豆粕-乳清粉飼糧中以硫酸亞鐵形式添加700mg/kg鐵，飼喂21、42或63d后，盡管基因表達(dá)水平在不同日齡有變化，加鐵組十二指腸粘膜DMT1 mRNA水平僅為不加鐵組10%。Tako等在肉雞飼糧中以硫酸亞鐵形式添加100mg/kg鐵，十二指腸中DMT1 mRNA水平降低。但Hansen等在8周齡斷奶犢牛飼糧中以硫酸亞鐵形式添加750mg/kg鐵飼喂56d后，發(fā)現(xiàn)高鐵組十二指腸粘膜DMT1 mRNA和蛋白都表現(xiàn)出降低趨勢。

鐵調(diào)控DMT1表達(dá)的機(jī)制可能與DMT1 mRNA穩(wěn)定性增加有關(guān)。DMT1 mRNA3’非翻譯區(qū)的IRE可以像TfR一樣受鐵調(diào)控蛋白（iron regulatory protein，IRP）的調(diào)控。當(dāng)機(jī)體鐵缺乏時(shí)，IRP緊密地與DMT1 mRNA3’非翻譯區(qū)IRE結(jié)合，DMT1 mRNA穩(wěn)定性增加，DMT1 mRNA水平增加，蛋白表達(dá)量也增加，高鐵狀態(tài)時(shí)正好相反。不同組織中“+IRE”與“-IRE”型所占的比例不同，腦和腸道中“+IRE”型比例高，而脾、胸腺和胰臟中“-IRE”型比例高?！?IRE”型mRNA的穩(wěn)定性是否也受鐵調(diào)控還不清楚，但有證據(jù)表明，缺鐵動(dòng)物的小腸、腦等組織發(fā)現(xiàn)DMT1 mRNA和蛋白表達(dá)量增加。這些都支持“+IRE”型的DMT1表達(dá)可能是受IRP/IRE介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的觀點(diǎn)。Arredondo等最近的研究發(fā)現(xiàn)，鐵對DMT1表達(dá)的調(diào)控可能通過5’端外顯子1和含有IRE的3’外顯子兩個(gè)區(qū)域進(jìn)行。

3.2 Mn對DMT1的表達(dá)影響 Bai等報(bào)道，在55周齡臨界缺錳蛋雞飼糧中添加300mg/kg錳，飼喂12周后，加錳組十二指腸、心臟和肝臟中DMT1 mRNA水平明顯降低；用肉雞結(jié)扎十二指腸段灌注錳，也發(fā)現(xiàn)腸粘膜中DMT1 mRNA水平降低。Li等報(bào)道，體外培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)液中加入錳800μmol/L，DMT1 mRNA表達(dá)水平降低，但Wang等在脈絡(luò)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中加入錳100或 200μmol/L，卻上調(diào)了DMT1 mRNA表達(dá)。造成這種差異的原因，可能與錳添加水平不同有關(guān)。

3.3 其他金屬離子對DMT1表達(dá)的影響 哺乳動(dòng)物后期幼鼠膳食高鋅時(shí)DMT1 mRNA水平顯著降低，表達(dá)量約為缺鋅或適鋅組的1/3～1/4。Sachie等發(fā)現(xiàn)，鋅上調(diào)Caco-2中DMT1蛋白和mRNA表達(dá)量。Caco-2細(xì)胞暴露于含鋅50、100和200mol/L環(huán)境24h后，細(xì)胞中DMT1 mRNA表達(dá)量分別比對照組上調(diào)了32%、79%和134%。上述結(jié)果提示，補(bǔ)鋅后小腸細(xì)胞對鐵的攝取增加。

Caco-2對銅的攝取與細(xì)胞內(nèi)鐵含量成負(fù)相關(guān)，去鐵銨處理細(xì)胞對銅的攝取量增加，而高銅處理則降低DMT1 mRNA及蛋白表達(dá)量。但在肉牛的小腸研究中添加和不添加銅對小腸中DMT1兩種亞型mRNA表達(dá)量沒有明顯影響，對DMT1蛋白表達(dá)量也沒有明顯影響，提示銅是被DMT1轉(zhuǎn)運(yùn)的，但轉(zhuǎn)運(yùn)方式為Cu1+，并且轉(zhuǎn)運(yùn)量很小。

3.4 非金屬離子對DMT1表達(dá)的影響 徐君等發(fā)現(xiàn)大豆球蛋白與β-伴球蛋白對小鼠腸上皮細(xì)胞DMT1基因的表達(dá)有抑制作用。由于抗原蛋白引起上皮細(xì)胞過敏反應(yīng)，炎性細(xì)胞因子的增加，細(xì)胞內(nèi)代謝發(fā)生紊亂，DMT1的基因轉(zhuǎn)錄所需要的物質(zhì)比正常情況下降低，也在一定程度上影響了DMT1的基因表達(dá),從而影響了二價(jià)金屬離子的吸收。DMT1基因表達(dá)的調(diào)控因素還有很多，炎癥因子、脂多糖、TNF-α、INF-γ、蛋白激酶C和發(fā)育階段等因素均參與其調(diào)控。

4 今后的研究方向

4.1 現(xiàn)在的研究水平多見與在mRNA水平的研究，而機(jī)體直接起作用是在蛋白水平，DMT1蛋白水平研究是大勢所趨。

4.2 目前對DMT1的研究，大多是體外實(shí)驗(yàn)，體外模擬體內(nèi)環(huán)境實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)真實(shí)環(huán)境有很大差距。因此，應(yīng)加強(qiáng)體內(nèi)試驗(yàn)研究。

4.3 應(yīng)進(jìn)一步深入研究DMT1在多種金屬元素轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的作用機(jī)制及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

4.4 DMT1在小腸中是否也參與有機(jī)金屬元素的轉(zhuǎn)運(yùn)。

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10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．07.004

國家自然科學(xué)基金（31272465）

唐家明，碩士研究生，從事動(dòng)物營養(yǎng)生理研究。

★通訊作者：羅緒剛，研究員，博士生導(dǎo)師，從事家禽礦物元素營養(yǎng)與分子生物學(xué)研究。

★通訊作者：：李素芬，教授，碩士生導(dǎo)師，從事動(dòng)物營養(yǎng)生理研究