斑馬魚模型在中藥毒性研究中的應(yīng)用進(jìn)展*

孫 晨綜述，韓利文，何秋霞，張 云，王 雪，劉可春審校

（山東省科學(xué)院生物研究所/山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250014）

·綜 述·

斑馬魚模型在中藥毒性研究中的應(yīng)用進(jìn)展*

孫 晨綜述，韓利文，何秋霞，張 云，王 雪，劉可春△審校

（山東省科學(xué)院生物研究所/山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250014）

斑馬魚； 中草藥/毒性； 綜述

自20世紀(jì)90年代以來國際中藥市場蓬勃發(fā)展，世界各大制藥公司均投入巨資研究中藥。與化學(xué)藥物比較，中藥一直被人們認(rèn)為毒性低、安全。但若使用不當(dāng)或不能保證原料制劑質(zhì)量，中藥仍會(huì)出現(xiàn)較強(qiáng)毒性。因此，提高中藥早期毒性預(yù)測的靈敏度和可靠性已成為中藥行業(yè)的迫切需求。在此大趨勢(shì)下斑馬魚這一新的生物型模憑借獨(dú)特優(yōu)勢(shì)已逐步成為中藥研發(fā)過程中的毒性評(píng)價(jià)的重要工具。

1 斑馬魚模型的生理特征

斑馬魚屬小型熱帶魚類，體側(cè)從頭至尾遍布藍(lán)色條紋，形似斑馬，因此得名。繁殖周期較短，受精約3個(gè)月即可性成熟，5個(gè)月可至體成熟，一年四季均可產(chǎn)卵，雌魚每次產(chǎn)卵可達(dá)200多枚。斑馬魚體外受精、體外發(fā)育；胚胎透明，整個(gè)發(fā)育過程清晰可見。受精約120 hpf（hours post fertilization，受精后小時(shí)）后斑馬魚各組織、臟器均已發(fā)育完全。2005年斑馬魚全基因組測序成功。在此基礎(chǔ)上英國Sanger研究所在2013年完成了斑馬魚參考基因組[1]。比較斑馬魚與人類基因組的異同可發(fā)現(xiàn)，斑馬魚與人類基因組具有高達(dá)87.0%相似性，約70.0%人類基因至少有一個(gè)明顯的斑馬魚同源基因[1]。在信號(hào)通路傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)功能和生理結(jié)構(gòu)等方面斑馬魚與人類比較，也表現(xiàn)出很高的保守性[2]。斑馬魚現(xiàn)已被美國國家衛(wèi)生研究院列為繼人類和小鼠后的第三大模式生物。

2 斑馬魚模型在中藥毒性研究中的優(yōu)勢(shì)

中藥成分復(fù)雜、配伍多變、不同劑型對(duì)療效的影響各不相同，因此，在中藥毒性研究過程中存在許多困難，如常用中藥與有毒中藥的安全劑量范圍、毒性靶器官、量-毒效應(yīng)范圍、最小有毒劑量與有效劑量等均不明確。目前，在中藥毒性研究領(lǐng)域常以細(xì)胞或嚙齒類動(dòng)物作為模型[3]。以細(xì)胞作為模型進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，雖然具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，但細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)環(huán)境的要求較高，體外模型研究結(jié)果的種屬差異性較大。有些中藥的毒性作用需在體內(nèi)經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化后才能顯現(xiàn)，而細(xì)胞模型由于無法模擬以上過程，因此，不能在機(jī)體水平對(duì)中藥安全性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。以嚙齒類動(dòng)物作為研究對(duì)象進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，雖然具有結(jié)果可靠、綜合全面等優(yōu)點(diǎn)，但研究周期長、所用動(dòng)物多、用藥量大，且嚙齒類動(dòng)物需解剖才能觀察到靶器官，因此，無法實(shí)現(xiàn)中藥毒性的高通量快速篩選。

有研究發(fā)現(xiàn)，在中藥毒性研究中斑馬魚模型兼具細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的高通量性和嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的高內(nèi)涵性等雙重優(yōu)勢(shì)[4]。由于斑馬魚體積較小、產(chǎn)卵量大、繁殖周期短且易于養(yǎng)殖，因此，利用斑馬魚對(duì)中藥毒性進(jìn)行研究可在細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行大規(guī)模同步實(shí)驗(yàn)，且藥物用量少，實(shí)驗(yàn)周期短、成本較低；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程易于觀察與操作，可實(shí)現(xiàn)微孔板高通量自動(dòng)篩選[5]。由于斑馬魚胚胎透明、發(fā)育快速，因此，可借助顯微鏡直接觀察各發(fā)育時(shí)期藥物對(duì)內(nèi)臟組織的毒性作用。在毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中通過這種直接觀察的方式可從多角度獲得更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，更有利于評(píng)價(jià)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的終點(diǎn)[6]。在基因、蛋白和生理結(jié)構(gòu)等多重層次方面由于斑馬魚與人類均非常相似，因此，以斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)中藥的毒性進(jìn)行研究，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠，完全適用于人類。有研究結(jié)果顯示，斑馬魚模型對(duì)藥物致畸性、發(fā)育毒性、心血管毒性、肝臟毒性、神經(jīng)毒性的評(píng)價(jià)結(jié)果與人體實(shí)驗(yàn)的一致性可達(dá)80.0%以上[7]。此外，利用斑馬魚模型可對(duì)中藥毒性進(jìn)行體內(nèi)研究，便于研究人員分析中藥在機(jī)體內(nèi)部的生物積累、物質(zhì)代謝及生物轉(zhuǎn)化等動(dòng)態(tài)過程，方便對(duì)中藥致毒機(jī)制的進(jìn)一步分析，實(shí)現(xiàn)高內(nèi)涵性的毒性研究。雖然出于動(dòng)物保護(hù)條例等因素，目前，各國特別是歐盟對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用進(jìn)行了限制；但在斑馬魚研究領(lǐng)域，其受精120 hpf前的胚胎通常不被看成是動(dòng)物個(gè)體[8]。因此，從這一角度看，在中藥毒性研究領(lǐng)域斑馬魚模型與嚙齒類動(dòng)物比較，也更具有優(yōu)勢(shì)。

3 基于斑馬魚模型的中藥發(fā)育毒性研究

斑馬魚胚胎透明，體外發(fā)育，最早即是作為模式生物用于發(fā)育遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究[9]。1996年歐洲經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織將斑馬魚胚胎檢測技術(shù)列為測定單一化學(xué)物毒性的標(biāo)準(zhǔn)方法之一。在發(fā)育毒性研究中常用的斑馬魚毒性檢測指標(biāo)包括胚胎死亡率、胚胎畸形率、卵黃囊

水腫、色素形成、卵凝結(jié)、尾部延展、頭部形態(tài)、體節(jié)形成等[10]。應(yīng)用上述檢測指標(biāo)，以發(fā)育6～72 hpf的斑馬魚胚胎作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象發(fā)現(xiàn)，與哺乳動(dòng)物體內(nèi)毒性評(píng)價(jià)技術(shù)比較，斑馬魚胚胎對(duì)化合物毒性檢測的特異性可達(dá)70.0%～80.0%；靈敏度更是高達(dá)80.0%以上[5]。Ton等[11]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用斑馬魚胚胎對(duì)非致畸化合物的發(fā)育毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，準(zhǔn)確率可達(dá)75.0%；致畸化合物的毒性評(píng)價(jià)準(zhǔn)確率更是高達(dá)100.0%。

中藥雖然具有成分復(fù)雜、毒性靶器官不明確等特點(diǎn)，但以斑馬魚胚胎作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物仍能對(duì)發(fā)育毒性進(jìn)行準(zhǔn)確、快速評(píng)價(jià)。He等[12]發(fā)現(xiàn)，大黃素可影響斑馬魚胚胎存活率和孵化率，造成軀干彎曲、卵黃囊水腫等。陳怡君等[13]發(fā)現(xiàn)，麝香酮可引起斑馬魚胚胎心包水腫、脊柱彎曲、卵黃囊水腫等。2016年何育霖等[14]發(fā)現(xiàn)，紫草對(duì)各發(fā)育階段斑馬魚均具有致死作用，1.0 mg/L紫草可抑制胚胎發(fā)育，造成斑馬魚胚胎體節(jié)數(shù)量減少、尾部畸形、身體彎曲、黑色素減少等。

4 基于斑馬魚模型的中藥心血管毒性研究

心血管毒性是制約藥物研發(fā)的重要因素之一。藥物心血管毒性的主要臨床表現(xiàn)為心律失常、心瓣膜損害、心肌缺血等。目前，常用的臨床前心血管毒性研究方法中離體心臟灌注成本較高，原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)種屬差異性較大，清醒動(dòng)物遙測技術(shù)不適于早期評(píng)價(jià)。斑馬魚心血管系統(tǒng)與人類非常類似，發(fā)育過程可分為5個(gè)階段，受精22 hpf時(shí)心臟開始具備收縮功能，48 hpf時(shí)心臟結(jié)構(gòu)基本形成，心律趨于穩(wěn)定[15]。在整個(gè)發(fā)育過程中由于斑馬魚胚胎透明，因此，其心臟結(jié)構(gòu)清晰可見；經(jīng)藥物處理后可直接在光學(xué)顯微鏡下觀察藥物對(duì)斑馬魚心血管系統(tǒng)的致毒作用，分析藥物誘導(dǎo)引起的心包水腫、心律失常、血栓形成、血流改變等情況。借助微電極還可同時(shí)對(duì)斑馬魚心室肌細(xì)胞的復(fù)合動(dòng)作電位和心電圖進(jìn)行監(jiān)控[16]，明確藥物對(duì)斑馬魚心律、心肌和心室發(fā)育等的影響。另外，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，現(xiàn)已構(gòu)建完成多種心臟、血管或血細(xì)胞等特異表達(dá)熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型。以上述轉(zhuǎn)基因斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，借助熒光顯微鏡，可更為清楚地看到藥物對(duì)斑馬魚心血管系統(tǒng)中各毒性檢測指標(biāo)的影響。按照歐洲替代方法驗(yàn)證中心的替代動(dòng)物驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)，斑馬魚模型預(yù)測藥物心血管毒性的靈敏度為78.0%～100.0%，特異性為77.0%～100.0%[17]。

史美娟等[18]對(duì)98份中藥心血管毒性文獻(xiàn)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，含有苷類和生物堿等成分的中藥多能引起心血管毒性。胡占英等[19]以發(fā)育144 hpf的斑馬魚胚胎為模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，長春新堿具有心臟發(fā)育毒性，質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)會(huì)造成斑馬魚胚胎瘀血、體長變短、圍心囊腫大等。方芳等[20]利用不同質(zhì)量濃度烏頭堿處理48 hpf斑馬魚胚胎后發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度10 mg/L以上的烏頭堿可造成胚胎心包囊水腫、血細(xì)胞堆積、心膜出血等；烏頭堿處理12 h后斑馬魚胚胎心率將受影響。長春新堿和烏頭堿均屬中國傳統(tǒng)中藥的生物堿類成分。因此，上述斑馬魚實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果與中藥心血管毒性的文獻(xiàn)報(bào)道一致，也進(jìn)一步說明斑馬魚非常適于中藥心血管毒性的研究。

5 基于斑馬魚模型的中藥肝臟毒性研究

肝臟是人類身體內(nèi)以代謝為主的一個(gè)器官，負(fù)擔(dān)著幾乎所有外來物質(zhì)的代謝和解毒作用。藥物導(dǎo)致的肝臟毒性多表現(xiàn)為肝細(xì)胞損傷，臨床表現(xiàn)類似于病毒性肝炎。據(jù)不完全資料分析，由中藥及其制劑所導(dǎo)致的肝損傷占臨床藥物性肝損傷的4.8%～32.6%[21]。斑馬魚的肝臟與人類類似，不僅具有分泌膽汁、合成蛋白質(zhì)的功能，還能中和分解有毒物質(zhì)。斑馬魚受精48 hpf時(shí)肝臟形態(tài)基本形成；受精72 hpf后肝臟形態(tài)及功能全部發(fā)育成熟[22]。斑馬魚肝臟對(duì)藥物的介入非常敏感，肝臟毒性藥物極易使其生理結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。由于在早期發(fā)育階段斑馬魚胚胎透明，因此，在光學(xué)顯微鏡下可直接對(duì)其肝臟進(jìn)行觀察；結(jié)合斑馬魚整體圖像分析技術(shù)，利用肝臟面積、卵黃囊吸收延遲和肝臟變性程度等多項(xiàng)指標(biāo)可對(duì)藥物的肝臟毒性進(jìn)行定量分析。除此之外，斑馬魚肝臟中還存在多種脂質(zhì)代謝酶和氧化酶體增殖物受體，且可通過酶的誘導(dǎo)和氧化應(yīng)激等方式對(duì)外源物質(zhì)進(jìn)行防御[23]。因此，以斑馬魚為模型，對(duì)藥物的肝臟毒性進(jìn)行研究時(shí)可通過細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶檢測、脂質(zhì)過氧化檢測、鈣離子成像檢測等對(duì)藥物的致毒機(jī)制進(jìn)一步分析。已有研究顯示，斑馬魚對(duì)藥物肝臟毒性檢測的準(zhǔn)確率可達(dá)100.0%[24]。

有研究表明，中藥肝臟毒性的主要作用機(jī)制包括CYP450酶代謝異常、脂質(zhì)過氧化損傷、鈣離子平衡失調(diào)等。上述毒性機(jī)制均可通過斑馬魚模型進(jìn)行分析驗(yàn)證。鄭潤凱等[25]對(duì)飛機(jī)草提取物的毒性進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，95%乙醇提取物具有肝臟毒性，會(huì)造成斑馬魚肝臟界限模糊，肝細(xì)胞腫脹、壞死。

6 基于斑馬魚模型的中藥腎臟毒性研究

腎臟為多種藥物進(jìn)行排泄過濾的場所，因此，在濾過、重吸收、排泄等過程中藥物非常容易對(duì)其造成損傷。2000年5月、2001年4月美國食品藥品管理局2次發(fā)布公告提醒醫(yī)藥專業(yè)人士注意植物中具有腎臟毒性的相應(yīng)成分。2001年11月至2012年4月我國國家藥品不良監(jiān)測中心發(fā)布了《藥品不良反應(yīng)信息通報(bào)》，共涉及51種中藥材及制劑；被通報(bào)腎臟毒性的中成藥約占總通報(bào)中成藥的1/3。腎臟毒性已成為制約中藥發(fā)展的重要因素之一。常用的藥物腎臟毒性研究方法多以哺乳動(dòng)物為模型，通過血、尿等生化指標(biāo)的檢測和腎臟組織病理學(xué)觀察等對(duì)藥物毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。這些實(shí)驗(yàn)過程周期較長，成本較高，且哺乳動(dòng)物模型對(duì)輕、中度腎臟毒性的靈敏度不高。斑馬魚腎臟屬于原腎，雖然結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單，但

其功能及構(gòu)成腎小球的細(xì)胞類型均與人類非常類似。受精約40 hpf時(shí)斑馬魚前腎即具有濾過功能，96 hpf時(shí)腎臟濾過的超微結(jié)構(gòu)發(fā)育完全。當(dāng)斑馬魚腎功能受損后由于無法調(diào)節(jié)滲透壓會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重水腫，腎小球?yàn)V過功能也將受影響。斑馬魚胚胎受精168 hpf內(nèi)由于鰓還未發(fā)育完全，主要依賴腎臟排出體內(nèi)代謝廢物和多余水分，加之該階段仔魚不必喂食即可存活，因此，干擾因素少，非常便于開展腎臟毒性相關(guān)研究。在該階段加藥處理可直接在光學(xué)顯微鏡下觀察斑馬魚腎包膜水腫、腎臟扭曲等情況；通過計(jì)算胚胎體內(nèi)菊粉等類似物的清除速率，還可對(duì)腎小球?yàn)V過功能進(jìn)行分析。除此之外，借助免疫組織化學(xué)或病理切片等技術(shù)可觀察斑馬魚腎單位、腎小球等組織形態(tài)改變，方便對(duì)藥物毒性的進(jìn)一步分析。

馬兜鈴酸為硝基菲類有機(jī)酸，多種中藥中均含有該成分。近年來，隨著大量臨床報(bào)道，馬兜鈴酸引起的腎臟毒性陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。2012年Ding等[26]和2015年王雪等[27]分別以斑馬魚作為模型，對(duì)馬兜鈴酸腎臟毒性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，馬兜鈴酸能誘導(dǎo)斑馬魚腎臟出現(xiàn)畸形，造成腎小管上皮排列紊亂。當(dāng)其劑量增加時(shí)可明顯降低斑馬魚腎小球?yàn)V過率，結(jié)果與中藥腎臟毒性臨床報(bào)道一致，說明斑馬魚模型非常適用于中藥腎臟毒性的研究。

7 小結(jié)與展望

作為毒理學(xué)常用的替代型模，斑馬魚在中藥毒性研究中的應(yīng)用尚處于探索階段。目前，利用斑馬魚模型對(duì)中藥毒性進(jìn)行的研究很大部分只是針對(duì)單體化合物進(jìn)行篩選和評(píng)價(jià)。而中藥復(fù)方中的化學(xué)成分極其復(fù)雜，一個(gè)復(fù)方可能包含幾百種化合物；各化合物可能通過多種途徑、對(duì)機(jī)體的多個(gè)靶點(diǎn)同時(shí)造成毒性。因此，如何利用斑馬魚模型對(duì)中藥復(fù)雜成分之間的相互作用進(jìn)行分析、明確復(fù)方中各成分的具體作用靶點(diǎn)和毒性機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

總體而言，斑馬魚模型是一種能簡單、快速研究中藥毒性的生物模型。隨著生物科技的不斷發(fā)展，斑馬魚模型在中藥毒性研究領(lǐng)域的應(yīng)用前景將更為廣闊。

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△通訊作者，E-mail：hliukch@sdas.org。