原發(fā)免疫性血小板減少癥患者Th1/Th2水平及臨床意義

費(fèi)曉莉，練 穎，官曉紅，雷麗華，陶 黎，何 東，林 娟，任 倩

（成都市第一人民醫(yī)院血液內(nèi)科，四川610041）

原發(fā)免疫性血小板減少癥患者Th1/Th2水平及臨床意義

費(fèi)曉莉，練 穎，官曉紅，雷麗華，陶 黎，何 東，林 娟，任 倩

（成都市第一人民醫(yī)院血液內(nèi)科，四川610041）

目的 研究原發(fā)免疫性血小板減少癥（ITP）患者血清輔助性T細(xì)胞1（Th1）即白介素-2（IL-2）、IL-3、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和Th2即IL-6、IL-10、IL-13水平變化及臨床意義。方法 采用雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)2011年9月至2016年3月該院收治的42例ITP患者（研究組）經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療前后及20例健康志愿者（對(duì)照組）外周血清IL-2、IL-3、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-13水平。結(jié)果 研究組患者治療前Th1水平明顯高于對(duì)照組，Th2水平明顯低于對(duì)照組，治療后Th1水平明顯低于治療前，Th2水平明顯高于治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 Th1/Th2失衡與ITP發(fā)病有關(guān)，糖皮質(zhì)激素治療可調(diào)整Th1/Th2失衡狀態(tài)。

免疫； 血小板減少； Th1細(xì)胞； Th2細(xì)胞； 細(xì)胞因子類

原發(fā)免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia，ITP）是一種獲得性自身免疫性疾病[1]，目前主要認(rèn)為是自身抗體對(duì)抗自身血小板，導(dǎo)致網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，尤其是脾內(nèi)的巨噬細(xì)胞，通過(guò)Fc受體介導(dǎo)的吞噬作用增強(qiáng)，使血小板被破壞。除以上體液免疫機(jī)制外，細(xì)胞免疫在ITP發(fā)病中的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注，大量研究發(fā)現(xiàn)，不同T細(xì)胞亞群之間及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子之間的平衡紊亂在發(fā)病中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，如ITP患者輔助性T細(xì)胞1（helper T cell 1，Th1）/Th2比例升高[2-4]，Th17細(xì)胞增多[5]，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（簡(jiǎn)稱Treg）減少等[6-7]。在疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中多種細(xì)胞因子隨之發(fā)生著變化，反映疾病的發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，通過(guò)檢測(cè)這些細(xì)胞因子水平從而了解疾病發(fā)生、發(fā)展對(duì)臨床診療具有一定意義。因此，本研究采用雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)42例ITP患者經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療前后和20例健康志愿者Th1 [白介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-3、腫瘤壞死因子α（tumornecrosis factor-αTNF-α）]和Th2（IL-6、IL-10、IL-13）水平變化，旨在探討Th1/Th2失衡與ITP發(fā)病的關(guān)系，糖皮質(zhì)激素治療是否可調(diào)整Th1/Th2失衡狀態(tài)，為臨床治療ITP患者提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年9月至2016年3月本院收治的ITP患者42例作為研究組，均為初診患者，治療前采血均未應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑。42例患者中男16例，女26例；年齡16～66歲，中位年齡35歲。均符合《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國(guó)專家共識(shí)（2016年版）》[8]的診斷標(biāo)準(zhǔn)。選取健康志愿者20例作為對(duì)照組，其中男11例，女9例；年齡20～56歲，中位年齡37歲。兩組研究對(duì)象年齡、性別等比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究通過(guò)本院醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及健康志愿者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方案 ITP患者采血后均給予地塞米松（湖北天藥藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：12110111、5150461）

20 mg靜脈滴注，4 d后改為潑尼松（浙江仙居制藥有限公司，批號(hào)：130493、150129）1 mg/（kg·d）口服，治療開始后隔天進(jìn)行血常規(guī)檢查，直至治療后3周再次采血，以血小板計(jì)數(shù)較治療前上升30×109L-1或血小板計(jì)數(shù)大于或等于50×109L-1判定為激素治療有效，反之如激素治療4周仍無(wú)反應(yīng)判定為無(wú)效。42例ITP患者中激素治療有效37例，無(wú)效5例。

1.2.2 標(biāo)本采集 分別采集研究組患者治療前、治療后3周及對(duì)照組研究對(duì)象外周靜脈血標(biāo)本5.0 mL，離心分離血清后放置于1.5 ml Eppendorf微型離心管中，標(biāo)記編號(hào)后儲(chǔ)存于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 標(biāo)本檢測(cè) 患者血清中Th1（IL-2、IL-3、TNF-α）和Th2（IL-6、IL-10、IL-13）水平檢測(cè)采用雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法，試劑盒由長(zhǎng)沙湘宇生物技術(shù)有限公司提供。主要步驟：取出板條，留1個(gè)空白孔，其他孔加血清標(biāo)本或不同水平標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，加50 μL生物素標(biāo)記的抗體，蓋上模板后輕輕震蕩混勻，37℃溫育1h后洗滌3次，加入80 μL酶結(jié)合物，37℃溫育30 min后洗滌3次，加人100 μL底物，37℃溫育10 min，避光，取出酶標(biāo)板，迅速加入終止液，于450 nm波長(zhǎng)處讀取光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用成組t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 研究組患者治療前Th1/Th2水平與對(duì)照組比較（±s，pg/mL）

表1 研究組患者治療前Th1/Th2水平與對(duì)照組比較（±s，pg/mL）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05。

組別對(duì)照組研究組n 20 42 TNF-α 27.80±4.55 50.38±6.01aIL-3 IL-2 IL-6 IL-10 IL-13 31.02±2.01 63.11±8.52a78.14±10.13 112.10±6.98a59.23±6.31 28.69±4.87a25.2±7.6 17.4±4.9a43.66±3.81 25.41±7.90a

表2 研究組患者治療前后Th1/Th2水平比較（±s，pg/mL）

表2 研究組患者治療前后Th1/Th2水平比較（±s，pg/mL）

注：與治療前比較，aP＜0.05。

治療前治療后時(shí)間 TNF-α 50.38±6.01 30.12±5.89an 42 37 IL-3 IL-2 IL-6 IL-10 IL-13 63.11±8.52 35.25±7.56a112.10±6.98 69.23±5.31a28.69±4.87 49.85±5.32a17.40±4.9 24.36±5.01a25.41±7.90 42.66±6.91a

2 結(jié) 果

2.1 研究組患者治療前Th1/Th2水平與對(duì)照組比較 研究組患者治療前Th1水平明顯高于對(duì)照組，Th2水平明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 研究組患者治療前后Th1/Th2水平比較 研究組患者治療前Th1水平明顯低于治療后，Th2水平明顯高于治療后，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。研究組患者中激素治療無(wú)效5例，治療前后Th1/Th2水平無(wú)明顯變化。

3 討 論

ITP是一種排除其他疾病所致血小板減少的免疫性疾病，目前研究結(jié)果顯示，細(xì)胞免疫在ITP的發(fā)病中具有重要作用，主要表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞亞型漂移，尤其是Th1/Th2及Th17/Treg兩對(duì)細(xì)胞平衡紊亂與ITP發(fā)病有關(guān)。Th1主要分泌IL-2、IL-3、γ干擾素、TNF-α、TNF-β等細(xì)胞因子，促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞、腫瘤殺傷細(xì)胞及巨噬細(xì)胞活化和增殖，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，清除細(xì)胞內(nèi)病原微生物和誘發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)。Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等細(xì)胞因子，介導(dǎo)體液免疫、嗜酸粒細(xì)胞、B細(xì)胞活化及免疫球蛋白E的生成。在機(jī)體正常狀態(tài)下Th1、Th2功能處于一種動(dòng)態(tài)平衡，能精準(zhǔn)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答。反之，機(jī)體Th1、Th2狀態(tài)失衡，發(fā)生漂移，則導(dǎo)致疾病。Th1/Th2失衡與多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后具有密切關(guān)系[9]，且多數(shù)傾向于Th1細(xì)胞亞型優(yōu)勢(shì)反應(yīng)，ITP即是其中之一。

為進(jìn)一步明確ITP患者發(fā)病與Th1/Th2平衡的關(guān)系及臨床意義，本研究通過(guò)測(cè)定ITP患者不同時(shí)間點(diǎn)血清Th1（IL-2、IL-3、TNF-α）和Th2（IL-6、IL-10、IL-13）水平發(fā)現(xiàn)：（1）ITP患者治療前Th1水平明顯高于對(duì)照組，Th2水平明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示ITP患者發(fā)病存在Th1/Th2平衡紊亂，且以Th1活化優(yōu)勢(shì)為主。趙艷紅等[10]選取半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)分別對(duì)ITP患者和健康志愿者Th1（IL-2、TNF-α）mRNA和Th2（IL-4、IL-6）mRNA進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ITP患者表現(xiàn)為以Th1為主的表達(dá)。國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也顯示，ITP患者治療前Th1/Th2水平明顯升高，趨向于Th1優(yōu)勢(shì)表達(dá)[11]。（2）ITP患者治療后Th1水平明顯低于治療前，Th2水平明顯高于治療前，提示激素可調(diào)整Th1/ Th2平衡紊亂，使之重新達(dá)到平衡，預(yù)示也可通過(guò)檢測(cè)Th1/Th2水平變化反映疾病轉(zhuǎn)歸，盡快恢復(fù)該平衡可能成為ITP治療的有效手段，可為臨床治療提供幫助。有研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者治療前外周血IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-13等水平均低于對(duì)照組，應(yīng)用大劑量地塞米松治療后細(xì)胞因子水平較治療前升高，Th1/Th2平衡紊亂得到調(diào)整[12]。也有研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者應(yīng)用利妥昔單抗治療后Th1/Th2升高的情況得到改善，但治療無(wú)效患者該比例仍高[13]。由此推斷，Th1/Th2平衡紊亂與ITP發(fā)病有關(guān)。

綜上所述，本研究進(jìn)一步證實(shí)了ITP患者存在Th1/

Th2平衡紊亂，且以Th1優(yōu)勢(shì)模式為主；激素可通過(guò)調(diào)整Th1/Th2平衡紊亂，使ITP患者病情得以控制，預(yù)示臨床可通過(guò)檢測(cè)Th1/Th2水平變化了解疾病轉(zhuǎn)歸，通過(guò)細(xì)胞因子誘導(dǎo)重建Th1/Th2免疫反應(yīng)平衡是一種很有前景的治療手段。

[1] Rodeghiero F，Stasi R，Gernsheimer T，et al.Standardization of terminology，definitions and outcome criteria in immune thrombocytopenic purpura of adults and children：report from an international working group[J].Blood，2009，113（11）：2386-2393.

[2] Semple JW，Provan D.The immunopathogenesis of immune thrombocytopenia：T cells still take center-stage[J].Curr Opin Hematol，2012，19（5）：357-362.

[3] Yazdanbakhsh K，Zhong H，Bao W.Immune dysregulation in immune thrombocytopenia[J]．Semin Hematol，2013，50 Suppl 1：S63-67.

[4] LiHY，Zhang DL，Ge J，et al.Elevated interleukin-27 enhances the polarization of Th1/Tc1 cells and the production of proinflammatory cytokines in primary immune thrombocytopenia[J].Hum Immunol，2012，73（3）：240-247.

[5] 錢崢，崔慶亞，鄧安梅，等.45例原發(fā)免疫性血小板減少癥患者IL-23/IL-17軸表達(dá)的研究[J].中華血液學(xué)雜志，2015，36（12）：1035-1036.

[6] GaffenSL，JainR，GargAV，etal.TheIL-23-IL-17immuneaxis：from mechanisms to therapeutic testing[J].Nat Rev Immunol，2014，14（9）：585-600.

[7] Wong CK，Lit LC，Tam LS，et al.Hyperproduction of IL-23 and IL-17 in patients with systemic lupus erythematosus：Implications for Th17-mediated inflammation in auto-immunity[J].Clin Immunol，2008，127（3）：385-393.

[8] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì)止血與血栓學(xué)組．成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國(guó)專家共識(shí)（2016年版）[J]．中華血液學(xué)雜志，2016，37（2）：89-93．

[9] Talaat RM，Mohamed SF，Bassyouni IH，et al.Th1/Th2/Th17/Treg cytokine imbalance in systemic lupus erythematosus（SLE）patients：Correlation with disease activity[J].Cytokine，2015，72（2）：146-153.

[10]趙艷紅，趙艷秋，楊昆鵬，等.特發(fā)性血小板減少性紫癜患者激素抵抗與Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性研究[J].國(guó)際免疫雜志，2014，37（2）：161-164.

[11]Jin CQ，Liu F，Dong HX，et al.Type 2 polarized immune response holds a major position in Epstein-Barr virus-related idiopathic thrombocytopenic purpura（EBV-ITP）[J].Int J Lab Hematol，2012，34（2）：164-171.

[12]Zhan Y，Zou S，Hua F，et al.High-dose dexamethasone modulates serum cytokine profile in patients with primary immune thrombocytopenia[J]. Immunol Lett，2014，160（1）：33-38.

[13]閆志凌，李振宇，張煥新，等.大劑量地塞米松聯(lián)合小劑量利妥昔單抗作為二線方案治療65例原發(fā)免疫性血小板減少癥患者的臨床觀察[J].中華血液學(xué)雜志，2015，36（3）：206-209.

Th1/Th2 level and clinical significance in patients with primary immune thrombocytopenia

Fei Xiaoli，Lian Ying，Guan Xiaohong，Lei Lihua，Tao Li，He Dong，Lin Juan，Ren Qian
（Department of Hematology，Chengdu Municipal First People′s Hospital，Chengdu，Sichuan 610041，China）

Objective To investigate the change of serum Th1（IL-2，IL-3，TNF-α）and Th2（IL-6，IL-10，IL-13）levels and its clinical significance in the patients with primary immune thrombocytopenia（ITP）.Methods The levels of serum IL-2，IL-3，TNF-α，IL-6，IL-10 and IL-13 were detected by double sandwich enzyme-linked immunoabsorbent assay（ELISA）before and after treatment in 42 cases of ITP（research group）and 20 healthy volunteers（control group）in our hospital from September 2011 to March 2016．Results The Th1 level before treatment in the research group was significantly higher than that in the control group，while the Th2 level was significantly lower than that in the control group，the Th1 level after treatment in the research group was significantly lower than before treatment，while the Th2 level was significantly higher than before the treatment，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion Th1/Th2 imbalance is associated with the onset of ITP and the glucocorticoid therapy can adjust the imbalance status of Th1/Th2.

Immunity； Thrombocytopenia； Th1 cells； Th2 cells； Cytokines

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.22.009

A

1009-5519（2016）22-3443-03

2016-07-19）

費(fèi)曉莉（1981-），碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事細(xì)胞因子與血小板減少性紫癜相關(guān)性研究。