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    肺上皮細(xì)胞鈣超載在急性呼吸窘迫綜合征發(fā)生中的機(jī)制研究

    2016-02-20 19:05:25張可靜李桃紅金雨虹徐赤裔
    關(guān)鍵詞:內(nèi)鈣鈣超載封三

    張可靜,李桃紅,金雨虹,徐赤裔

    肺上皮細(xì)胞鈣超載在急性呼吸窘迫綜合征發(fā)生中的機(jī)制研究

    張可靜,李桃紅,金雨虹,徐赤裔

    目的 細(xì)胞水平上闡明鈣敏感受體(CaSR)介導(dǎo)的鈣超載在急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)中的可能作用和機(jī)制。方法 肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞在不同脂多糖(LPS)濃度分別以不同時(shí)間處理;選擇Fluo-4熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度;加入相應(yīng)的siRNA和混雜對(duì)照后,Western blotting測(cè)定CaSR蛋白含量。結(jié)果 LPS對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性。加用LPS后,細(xì)胞內(nèi)的熒光含量增加;siRNA的加入,使得CaSR蛋白含量下降,同時(shí)增加的熒光含量也下降,LPS誘發(fā)的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用被逆轉(zhuǎn)。結(jié)論 實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)肺上皮細(xì)胞上有CaSR的表達(dá);LPS對(duì)肺泡上皮細(xì)胞增殖存在影響;CaSR的活化可以抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。

    鈣敏感受體;肺上皮細(xì)胞;急性呼吸窘迫綜合征

    急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是臨床常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)急危重癥,病死率高。目前尚無(wú)特效治療手段,其原因很大程度在于對(duì)其發(fā)病機(jī)制缺乏詳細(xì)、深入了解。因此,揭示ARDS的發(fā)病機(jī)制,以及在此基礎(chǔ)上,在疾病早期采取有效措施進(jìn)行防治,已成為進(jìn)一步提高ARDS治療效果的關(guān)鍵。以往相關(guān)研究更多集中在內(nèi)皮細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞是否存在鈣超載現(xiàn)象,目前尚不清楚。本研究就肺上皮細(xì)胞鈣敏感受體(CaSR)蛋白表達(dá),與ARDS的關(guān)系進(jìn)行了探討,報(bào)道如下。

    1 資料與方法

    1.1 材料 A549細(xì)胞(ATCC,美國(guó));脂多糖、單克隆抗肌動(dòng)蛋白、CaSR(Sigma公司,西班牙);Fluo-4熒光探針、脂質(zhì)體-2000(Invitrogen公司,英國(guó));siRNA,包括混雜對(duì)照(Ambion,英國(guó));CCK-8試劑盒(Dojindo實(shí)驗(yàn)室,日本)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞以杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基(含10%熱滅活胎牛血清,100U/ml的青霉素和100g/ml鏈霉素)保存,在二氧化碳培養(yǎng)箱[1]。培養(yǎng)基1周更換2次,細(xì)胞每4~5天以1∶3的比例傳代。

    1.2.2 細(xì)胞處理 A549細(xì)胞在不同脂多糖(LPS)濃度(5、10、15 g/ml)處理0、3、6、12和24 h。

    1.2.3 細(xì)胞活力測(cè)定 CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力。

    1.2.4 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測(cè)定 使用Ca2+指示劑染料Fluo-4,通過(guò)熒光顯微鏡來(lái)測(cè)定[2-3]。

    1.2.5 Western blotting測(cè)定 用放射免疫測(cè)定緩沖液裂解細(xì)胞制備全細(xì)胞裂解液,使用蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。Western印跡分析,50 g的每個(gè)樣本的描述[4]處理。使用下列抗體:抗CaSR和抗actin。二次抗體被耦合到辣根過(guò)氧化物酶和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。通過(guò)掃描光密度分析X線片確定各波段的免疫蛋白的相對(duì)含量。

    1.2.6 siRNA的轉(zhuǎn)染 細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中,被CaSR靶向siRNA(25 nM)轉(zhuǎn)染,時(shí)間在6h以上,介質(zhì)被抽吸,更換成含血清培養(yǎng)基,并且加入轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體-2000至最終濃度2 l/ml[5],處理24h。

    1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用ANOVA分析。<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 LPS對(duì)肺泡上皮細(xì)胞增殖的影響 LPS對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性。肺泡上皮細(xì)胞系 A549細(xì)胞 50%抑制濃度的條件是 10g/ml (12 h)。見(jiàn)封三彩圖5。

    2.2 LPS對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響選擇Fluo-4熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的熒光含量增加。見(jiàn)封三彩圖6。

    2.3 CaSR活化與鈣之間的關(guān)系 以LPS(10 g/ml)處理細(xì)胞12 h后,蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)中,加CaSR抗體組,在蛋白裂解液中發(fā)現(xiàn)了140 kD分子量大小的蛋白條帶;加入相應(yīng)的siRNA和混雜對(duì)照后,CaSR蛋白含量下降,同時(shí)增加的鈣濃度也下降,對(duì)照陰性。見(jiàn)封三彩圖7。2.4 Western blotting測(cè)定CaSR蛋白含量 加入相應(yīng)的siRNA后,LPS誘發(fā)的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用被逆轉(zhuǎn)CaSR活化與細(xì)胞增殖間的聯(lián)系。見(jiàn)封三彩圖8。

    3 討論

    雖然ARDS的發(fā)病率和死亡率很高,但是臨床治療手段也在不斷進(jìn)步。研究者的聚焦點(diǎn)主要在于LPS導(dǎo)致的肺炎癥反應(yīng),且更多關(guān)注內(nèi)皮細(xì)胞,作為肺重要組成的上皮細(xì)胞,關(guān)注甚少。鈣是重要的第二信使[6],掌管多種重要的細(xì)胞應(yīng)答,包括增殖、遷移和細(xì)胞因子的分泌。以往研究發(fā)現(xiàn)CaSR在管理整體鈣的新陳代謝上發(fā)揮了關(guān)鍵作用[7-8]。在許多哺乳動(dòng)物的組織廣泛表達(dá),包括一些沒(méi)有清楚涉及鈣新陳代謝的組織[9]。因此,CaSR的活化和多種功能結(jié)果相關(guān),包括細(xì)胞收縮、增殖、分化和炎癥。

    本研究發(fā)現(xiàn):LPS的細(xì)胞毒效應(yīng)具有劑量依賴性,伴隨細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著增加。

    本研究首次證實(shí),A549細(xì)胞有CaSR蛋白的表達(dá),針對(duì)性的siRNA片段來(lái)抑制CaSR,結(jié)果導(dǎo)致CaSR蛋白表達(dá)阻滯,并且明顯減少了LPS導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)鈣離子的增加。本研還發(fā)現(xiàn):細(xì)胞增殖的減少被CaSR-siRNA的出現(xiàn)所抑制,這些結(jié)果表明CaSR的活化在LPS引發(fā)的肺炎癥反應(yīng)中,扮演了關(guān)鍵角色。

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    10.3969/j.issn.1671-0800.2016.01.009

    R563.8

    A

    1671-0800(2016)01-0020-02

    2015-09-15(本文編輯:孫海兒)

    寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2009A610175,2014A610248)

    315040寧波,寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院

    張可靜,Email:phyllice@ sohu.com

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