山臘梅提取物對慢性阻塞性肺病大鼠炎癥細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素-8水平的影響

湯　森　胡建軍　劉　多　彭　霞　迪麗沙·迪力夏提　彭英福

(吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南　吉首　416000)

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山臘梅提取物對慢性阻塞性肺病大鼠炎癥細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素-8水平的影響

湯森胡建軍劉多彭霞迪麗沙·迪力夏提彭英福

(吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南吉首416000)

摘要〔〕目的觀察山臘梅莖水提物對慢性阻塞性肺病(COPD)模型大鼠炎癥細(xì)胞和C-反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素(IL)-8的影響。方法采用反復(fù)煙熏加內(nèi)毒素氣管內(nèi)滴入法復(fù)制COPD大鼠模型，將60只SD大鼠隨機(jī)分為五組：正常組、模型組和低、中、高劑量山脂梅組。模型組及正常組給予生理鹽水灌胃，山臘梅組分別給予低、中、高劑量進(jìn)行灌胃，療程21 d。觀察各組大鼠肺組織的病理學(xué)改變，測定各組支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比率及各組血清和肺組織中CRP、IL-8水平。結(jié)果模型組大鼠出現(xiàn)慢性支氣管炎特征性病理改變明顯，氣管及血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺氣腫明顯，低、中、高劑量治療組肺氣腫和炎癥浸潤較模型組有明顯減輕，正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本正常。模型組大鼠肺組織和血清CRP、IL-8較正常對照組顯著增多，高、中、低劑量山臘梅組大鼠肺組織和血清CRP、IL-8均明顯較模型組減少(P<0.05)。模型組中白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞比率較各山臘梅組增加(P<0.01)，各山臘梅組白細(xì)胞計(jì)數(shù)及中性粒細(xì)胞較正常組明顯增多(P<0.01)。結(jié)論山臘梅莖水提物可降低COPD大鼠肺組織和血清中CRP及IL-8水平，對COPD大鼠的炎癥有抑制作用。

關(guān)鍵詞〔〕C-反應(yīng)蛋白；慢性阻塞性肺病；山臘梅莖水提物；支氣管肺泡灌洗液

第一作者：湯森(1993-)，男，在讀碩士，主要從事民族藥物教學(xué)與研究。

山臘梅葉具有抗菌消炎、止咳化痰、清熱排毒、抗病毒、助消化、止瀉、減肥、消脂降壓、預(yù)防心腦血管疾病以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用，對其作用機(jī)制的研究提示山臘梅葉可減少腫瘤壞死因子(TNF)-α及白細(xì)胞介素(IL)-8、IL-10等生成〔1〕。對山臘梅的藥理基礎(chǔ)研究及其開發(fā)仍局限于山臘梅葉，而對山臘梅莖、花、根的藥理學(xué)研究未見報(bào)道。長期以來，山臘梅對慢性阻塞性肺病(COPD)的治療缺乏深入研究。本研究探討山臘梅莖對COPD大鼠炎癥的影響及其作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1山臘梅莖水提物的提取在湘西吉首地區(qū)采集山臘梅，由我院中藥學(xué)李春艷教授鑒定。稱取陰干后的山臘梅莖1 000 g，粉碎，約60℃水提3次，每次120 min，合并水煎液，濃縮為1 g生藥/ml，得到山臘梅莖水提物。

1.2實(shí)驗(yàn)動物與分組清潔級SD大鼠60只，雌雄兼用，湖南長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動物科技服務(wù)部購買，動物編號HNACSDC20120292，鼠齡13 w，體重(280±20) g。隨機(jī)分為：正常組(n=12)、模型組(n=12)和低劑量山臘梅組(n=12)，中劑量山臘梅組(n=12)、高劑量山臘梅組(n=12)。實(shí)驗(yàn)中大鼠死亡3只，進(jìn)入統(tǒng)計(jì)動物數(shù)實(shí)為57只。

1.3COPD模型制備方法采用兩次氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS)和反復(fù)煙熏的方法制作COPD大鼠模型。第1、14天淺麻醉后向氣管內(nèi)緩慢注入脂多糖200 μg (200 μl)/只，將大鼠放入自制的有機(jī)玻璃染毒箱(120 cm×100 cm×100 cm)內(nèi)，在其正下方開一個(gè)4 cm×2 cm的通氣孔。將煙葉點(diǎn)燃后放入煙熏箱中(煙葉購于吉首農(nóng)貿(mào)市場)，大鼠每天吸煙2次，每次煙葉用量250 g，時(shí)間30 min，2次間隔4 h，連續(xù)28 d。用藥組：大鼠吸煙染毒8 d后每天吸煙染毒前予以山臘梅莖水提物灌胃(低劑量組原藥0.5 ml+生理鹽水1.5 ml/每次，中劑量組原藥1 ml+生理鹽水0.5 ml/每次，高劑量組原藥2 ml/每次)至造模結(jié)束，共20 d。正常組氣管內(nèi)滴入等量生理鹽水及2 ml/d生理鹽水灌胃，28 d天后處死大鼠用于實(shí)驗(yàn)觀察。

1.4血清及支氣管肺泡灌洗液(BALF)的采集將大鼠用2%的戊巴比妥鈉(25 mg/kg)麻醉后仰臥固定于操作臺，切開胸部，暴露出氣管和雙肺，從頸總動脈插管取血后，3 500 r/min，離心10 min，取上清液血清于-85℃低溫冰箱保存。結(jié)扎右主支氣管，在隆突上用套管針穿刺至左肺，緩慢注入無菌生理鹽水3 ml，每次注入后立即回吸得到BALF，重復(fù)3次。灌洗液紗布過濾，回收率為60%～70%，混勻灌洗液做白細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比率測定。

1.5肺組織勻漿制備取適量肺組織，冰生理鹽水漂洗兩次，濾紙吸干、稱重、剪碎，加入9倍冰生理鹽水，超聲勻漿器制成10%勻漿，低溫離心機(jī)4 000 r/min離心10 min，取上清液，置于-85℃冰箱中保存至生化指標(biāo)檢測。

1.6病理學(xué)檢查實(shí)驗(yàn)各組于吸煙染毒結(jié)束后取每只大鼠右中葉肺組織，10%中性福爾馬林固定后，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色。在400倍光鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，根據(jù)文獻(xiàn)〔2〕對氣道炎癥進(jìn)行病理學(xué)評分。病理學(xué)檢查由湘西州人民醫(yī)院病理科進(jìn)行，采用單盲法。

1.7血清和肺組織勻漿中C-反應(yīng)蛋白(CRP)、IL-8水平檢測利用H6000-020全自動生化分析儀，大鼠CRP試劑盒、IL-8試劑盒購于武漢博士德生物有限公司，嚴(yán)格按照說明書操作步驟進(jìn)行檢測。

2結(jié)果

2.1一般情況實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，造模開始后模型組大鼠食量下降、活動減少，毛色暗黃，出現(xiàn)慢性咳、喘癥狀，體重較正常組顯著減輕(P<0.01)；給藥組較模型組進(jìn)食增多，咳、喘減輕，活動增多，體重增加，但仍不及正常組(P<0.01)(表1)。

表1　各組大鼠體重比較

與實(shí)驗(yàn)后正常組比較：1)P<0.01；與實(shí)驗(yàn)后模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；與中劑量山臘梅組比較：4)P<0.01

2.2病理改變大體觀察，模型組大鼠肺較正常組顏色蒼白，體積增大；鏡檢結(jié)果(圖1)：正常組大鼠肺組織未見明顯異常改變，模型組大鼠血管充血明顯并累及周圍肺泡，肺泡腔明顯擴(kuò)張，肺泡壁出現(xiàn)斷裂，氣道壁及管腔內(nèi)有大量炎性細(xì)胞滲出，黏液滲出阻塞氣道，支氣管黏膜上皮脫落、壞死。低、中及高劑量山臘梅組大鼠的支氣管充血、黏膜上皮脫落、炎性細(xì)胞浸潤以及肺泡腔擴(kuò)大情況較模型組減輕，較正常組重。氣道炎癥病理學(xué)總評分模型組高于正常組(72.5±13.9 vs 13.6±2.6，P<0.000 1)，山臘梅干預(yù)后病理評分下降，(低、中、高劑量山臘梅組評分分別為51.6±14.7、46.8±11.3、37.9±9.5)但仍高于正常組(P<0.05)。

2.3各組大鼠BALF白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞比率模型組中白細(xì)胞總數(shù)增加，與正常組比較差異顯著(P<0.01)。各山臘梅組炎癥細(xì)胞總數(shù)較模型組明顯減少(P<0.01)。與正常組比較，模型組和各山臘梅組中白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞比率均顯著升高，與模型組比較，各山臘梅劑量組白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞比率均顯著下降，并呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.01)(表2)。

模型組

正常組

低劑量山臘梅組

中劑量山臘梅組

高劑量山臘梅組

表2　各組大鼠BALF白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比率比較±s)

與模型組比較:1)P<0.01；與高劑量山臘梅組比較：2)P<0.01；與中劑量山臘梅組比較：3)P<0.01；下表同

2.4血清中CRP、IL-8的測定模型組血清CRP明顯較正常組增多(P<0.01)。高、中、低劑量山臘梅組血清CRP均較模型組明顯減少(P<0.05或0.01)。低、中劑量山臘梅組間血清CRP水平無明顯差異(P>0.05)，高與低劑量山臘梅組比較，差異顯著(P<0.05)(表3)。

表3　各組大鼠血清CRP、IL-8水平比較

2.5各組大鼠肺組織勻漿中CRP、IL-8的測定模型組大鼠肺組織CRP、IL-8明顯較正常組增多(P<0.01)。各山臘梅組肺組織CRP、IL-8均明顯較模型組減少(P<0.05)。低、中劑量山臘梅組間血清CRP、IL-8水平無明顯差異(P>0.05)。高低劑量山臘梅組比較差異顯著(P<0.05)(表4)。

表4　各組大鼠肺組織勻漿中CRP、IL-8比較

3討論

吸煙和反復(fù)下呼吸道感染是COPD發(fā)生發(fā)展的主要原因〔3〕。本實(shí)驗(yàn)通過熏吸香煙加氣管內(nèi)注射LPS法建立COPD大鼠模型，結(jié)果符合COPD病理改變，說明造模成功，且山臘梅對COPD的氣道炎癥有一定的緩解作用。

氣道炎癥(尤其是小氣道的炎癥)是COPD的基礎(chǔ)性病變，以中性粒細(xì)胞為主〔4〕的氣道炎癥在其發(fā)病過程中起著非常重要的作用。中性粒細(xì)胞在COPD氣道腔內(nèi)聚集增加，并通過釋放蛋白酶如基質(zhì)金屬蛋白酶、氧自由基等引起組織損傷 參與COPD 氣流阻塞的形成。IL-8在中性粒細(xì)胞激活的過程中起著重要的作用，它可以激活中性粒細(xì)胞多方面的功能，可以作為評估呼吸道炎癥和受損程度的一個(gè)指標(biāo)。在COPD發(fā)病過程中，IL-8在中性粒細(xì)胞所致炎癥中起了相當(dāng)重要的作用，IL-8水平與氣流阻塞程度、氣道的炎癥相匹配〔5〕。本研究提示中性粒細(xì)胞的活化和聚集是慢性支氣管炎與肺氣腫炎癥過程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，利用山臘梅干預(yù)后，中性粒細(xì)胞明顯減少，提示該藥物對煙熏加脂多糖誘發(fā)大鼠COPD模型有顯著減少白細(xì)胞數(shù)量的作用，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)說明山臘梅水提物能降低慢性阻塞性大鼠血清及肺組織中IL-8的表達(dá)，減少炎性細(xì)胞因子的釋放，從而控制氣道炎癥。

CRP是一種對多種刺激因素包括感染、組織損傷、壞死都能迅速發(fā)生反應(yīng)的蛋白，?？勺鳛橐环N反應(yīng)炎癥、組織損傷程度以及評價(jià)治療反應(yīng)的非特異性敏感指標(biāo)〔5〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CRP不僅對COPD具有慢性表達(dá)，是COPD病情的重要生物學(xué)標(biāo)志，且山臘梅對大鼠COPD模型大鼠的抗炎作用與減少COPD病變中IL-8及CRP有關(guān)。

參考文獻(xiàn)4

1李莎莎，舒任庚.山臘梅化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展〔J〕.華西藥學(xué)雜志，2009;24(2):198-200.

2Lee SY，Park KH，Oh KJ，etal.The relationship of serum C-reactive protein and clinical chorioamnionists，funisitis，and early onset neonatal sepsis in preterm delivery 〔J〕.Am J Obstet Gynecol，2011;204：S210.

3周新.COPD發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展〔J〕.臨床肺科雜志,2001;93(6):47-8.

4Gallelli L，Pelaia G，F(xiàn)ratto D，etal.Effects of budesonideon P38MAPK activation，apoptosis and IL-8 secretion，induced by TNF alpha and H aemophilus influenzae in human bronchial epithelial cells〔J〕.Int J Immunopathol Pharmacol，2010;23(2)：471-9.

5Dulay A，Buhimsch I，Zhao GM，etal.Systematic evaluation of prototype acute phase reactants 〔Interleukin-6(IL-6)，C-reactive protein (CRP) and procalcitonin (PCT)〕 as non-invasive biomarkers of intra-amniotic infection (IAI)〔J〕.Am J Obst Gynecol，2011;204：S248.

〔2014-08-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者：彭英福(1968-)，男，碩士，講師，主要從事民族藥物教學(xué)與研究。

基金項(xiàng)目：湖南省教育廳大學(xué)生創(chuàng)新性課題基金資助(湘教通〔2012〕141號)；吉首大學(xué) (JSU-CX-2012-44)

中圖分類號〔〕R361；R932〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0026-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.011