中藥復(fù)骨方對糖皮質(zhì)激素致骨質(zhì)疏松骨折大鼠骨代謝及骨密度的影響

徐　進(jìn)　丁　任　石曉兵　馬　臺　王宇池

(上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科，上?！?01999)

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中藥復(fù)骨方對糖皮質(zhì)激素致骨質(zhì)疏松骨折大鼠骨代謝及骨密度的影響

徐進(jìn)丁任石曉兵馬臺王宇池

(上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科，上海201999)

摘要〔〕目的探討中藥復(fù)骨方對糖皮質(zhì)激素致骨質(zhì)疏松(GIOP)骨折大鼠骨代謝及骨密度的影響。方法清潔級雌性SD大鼠165只，3月齡，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為對照組、模型組和治療組，各55只，適應(yīng)性培養(yǎng)1 w后，模型組和治療組大鼠肌肉注射地塞米松1 mg·kg-1·d-1，3次/w，持續(xù)12 w，構(gòu)建GIOP模型，對照組給予生理鹽水；12 w后行手術(shù)造成大鼠左側(cè)股骨中段閉合性骨折，治療組給予復(fù)古方藥液10 ml/kg灌胃，1次/d，持續(xù)8 w治療，對照組和模型組給予同劑量的生理鹽水作對照。測量12、20 w末時(shí)大鼠骨密度、血清Ca、P含量、堿性磷酸酶(ALP)含量、骨鈣素(BGP)活性。結(jié)果實(shí)驗(yàn)12 w末，模型組和治療組大鼠全身骨密度值顯著低于對照，表明大鼠GIOP模型構(gòu)建成功。20 w末，模型組股骨去骨痂骨密度及骨痂骨密度均顯著低于對照組(P<0.05)，而治療組股骨去骨痂骨密度及骨痂骨密度均高于模型組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)12 w末，模型組、治療組大鼠血清Ca、P含量，ALP、BGP活性顯著低于對照組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)20 w末，模型組大鼠血清Ca、P含量，ALP、BGP活性顯著低于對照組和治療組(均P<0.05)。結(jié)論中藥復(fù)骨方能夠提高GIOP骨折大鼠骨密度，升高GIOP骨折大鼠血清中Ca、P含量，提高ALP、BGP活性，改善GIOP骨折大鼠骨代謝，促進(jìn)骨折愈合。

關(guān)鍵詞〔〕復(fù)骨方；骨代謝；骨密度；糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松

第一作者：徐進(jìn)(1981-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事顯微外科，創(chuàng)傷骨科方面的研究。

糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松(GIOP)是由內(nèi)源性或外源性糖皮質(zhì)激素所致的代謝性骨病，人體正常骨組織內(nèi)由骨吸收和骨形成維持動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)骨吸收高于骨形成時(shí)發(fā)生骨質(zhì)疏松，表現(xiàn)為骨強(qiáng)度降低、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加〔1〕。有研究表明，20%的患者在服用糖皮質(zhì)激素12個(gè)月內(nèi)發(fā)生了骨質(zhì)疏松，服用5～10年后這一比例上升至50%〔2〕。骨折是GIOP最嚴(yán)重的并發(fā)癥，常延遲愈合，致殘率極高，又缺乏有效的預(yù)防和治療措施〔3〕。本研究使用糖皮質(zhì)激素構(gòu)建GIOP大鼠，行手術(shù)造成GIOP大鼠骨折，采用復(fù)骨方對大鼠進(jìn)行治療，觀察其對大鼠骨代謝及骨密度的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3月齡雌性SD大鼠165只，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司〔合格證號：SCXK(滬)2009-0005，清潔級〕。動(dòng)物飼喂在我院實(shí)驗(yàn)室(實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)水平為 BSL-1)。實(shí)驗(yàn)室溫度恒定(24±1)℃，相對濕度50%～70%，維持12 h光照節(jié)律，自由攝食、飲水。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥材復(fù)骨方由骨碎補(bǔ)、杜仲、續(xù)斷、紅花、歸尾、川穹等熬制而成，藥材購自本院中藥房，由本院中醫(yī)藥劑科煎煮并濃縮到0.5 g/ml，分裝后置于4℃保存。地塞米松(Sigma，規(guī)格1 ml∶5 mg)；生理鹽水(北京天壇生物制品股份有限公司，國藥準(zhǔn)字S10870001，規(guī)格500 ml∶4.5 g)；青霉素(廣州白云山天心制藥股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字號H20013260)；水合氯醛(Sigma，規(guī)格：25 g)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組和建模所有試驗(yàn)大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組和治療組，各55只，適應(yīng)性培養(yǎng)1 w后，模型組大鼠給予肌肉注射地塞米松1 mg·kg-1·d-1，3次/w，持續(xù)12 w，每周稱量大鼠體重1次，并按體重調(diào)節(jié)給藥劑量，構(gòu)建GIOP模型，12 w末手術(shù)造成大鼠左側(cè)股骨骨折，術(shù)后用支架固定，并給予抗感染藥物，術(shù)后第2天開始生理鹽水10 ml/kg灌胃，1次/d，持續(xù)8 w。治療組大鼠采用同樣方法構(gòu)建大鼠GIOP模型并手術(shù)造成骨折，術(shù)后第2天給予復(fù)古方藥液10 ml/kg灌胃，1次/d，持續(xù)8 w。對照組不構(gòu)建GIOP模型大鼠，僅給予相同劑量的生理鹽水灌胃12 w，行手術(shù)造成骨折，術(shù)后給予相同劑量生理鹽水灌胃，持續(xù)8 w。

1.2.2大鼠骨折手術(shù)方法實(shí)驗(yàn)大鼠在3.5%水合氯醛腹腔麻醉下手術(shù)，沿大鼠左下肢髕骨內(nèi)側(cè)皮膚縱行切開，牽拉髕骨使之脫位，暴露股骨踝間凹。1 mm的克氏針自股骨踝間凹進(jìn)入髓腔至大轉(zhuǎn)子處穿出，兩端固定后閉合切口。大鼠取左下肢外展內(nèi)旋位固定于造模支架上，造模用骨刀壓與大鼠股骨中段，采用500 g砝碼，提至空中20 cm處自由落下撞擊刀背，造成實(shí)驗(yàn)大鼠股骨中段閉合性骨折。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1骨密度測定實(shí)驗(yàn)12 w末對所有大鼠行腹腔麻醉后，采用雙能X線吸收法(DEXA)測量大鼠全身骨密度。20 w末處死大鼠后，手術(shù)分離左側(cè)股骨，取出克氏針，固定于75%酒精中，用同樣的方法測量股骨去骨痂密度和骨痂處骨密度。

1.3.2血生化指標(biāo)檢測實(shí)驗(yàn)12 w末骨折手術(shù)前1 d及實(shí)驗(yàn)20 w末，在腹腔麻醉下經(jīng)腹主動(dòng)脈采血4 ml，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中室溫靜置0.5～1 h后3 000 r/min離心5 min取血清，血清置于-80℃保存，待所有樣品收集完后統(tǒng)一檢測，在HITACHI7600-110E全自動(dòng)生化分析儀和ABBOTTAXSYM化學(xué)發(fā)光分析儀上檢測分析Ca、P、堿性磷酸酶(ALP)含量，骨鈣素(BGP)活性采用放射免疫法檢測，試劑盒購自武漢優(yōu)爾生實(shí)業(yè)有限公司，操作按照說明書進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0進(jìn)行方差分析和SNK法。

2結(jié)果

2.1大鼠骨密度變化實(shí)驗(yàn)12 w末，模型組和治療組大鼠全身骨密度值顯著低于對照組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)20 w末，模型組股骨去骨痂骨密度及骨痂骨密度均顯著低于對照組(P<0.05)，而治療組均高于模型組(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠骨密度值比較

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2大鼠血生化指標(biāo)的變化實(shí)驗(yàn)12 w末，模型組、治療組大鼠血清Ca、P含量，ALP、BGP活性顯著低于對照組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)20 w末，模型組大鼠血清Ca、P含量，ALP、BGP活性顯著低于對照組和治療組(均P<0.05)。見表2。

表2　大鼠生化指標(biāo)變化

3討論

美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)將骨質(zhì)疏松定義為一種以骨強(qiáng)度受損、骨折危險(xiǎn)增加的骨骼疾病〔4〕。世界衛(wèi)生組織2010年的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示骨質(zhì)疏松發(fā)病率居世界常見病的第6位，骨折是骨質(zhì)疏松的重要并發(fā)癥，臨床上以椎骨、腕骨和髖骨常見，尤以髖骨骨折最常見〔5〕。有研究顯示，75歲以上女性約有4%～5%發(fā)生骨折，其中髖骨骨折占全部骨折患者的15%～25%，骨質(zhì)疏松患者發(fā)生骨折后，愈合慢，易導(dǎo)致內(nèi)固定松動(dòng)和再骨折，致殘率極高〔6〕。 繼發(fā)性骨質(zhì)疏松是由疾病或藥物等原因所致的骨質(zhì)疏松，臨床中糖皮質(zhì)激素的廣泛使用導(dǎo)致了GIOP發(fā)病率的增加，成為最常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松〔7〕。

ALP和BGP是與骨形成有關(guān)的代謝指標(biāo)，能直接反映成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性。ALP是成骨細(xì)胞發(fā)揮成骨作用的關(guān)鍵酶，ALP由成骨細(xì)胞合成后可以進(jìn)入血液，因此血液中ALP活性升高提示成骨細(xì)胞增殖活躍，是骨折愈合和骨重建的重要生物標(biāo)志〔7〕；BGP也是成骨細(xì)胞分泌的物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)和維持骨鈣的功能，是骨組織中非膠原性蛋白的主要成分，占骨質(zhì)的3%，因此BGP也是反映成骨細(xì)胞活性的重要指標(biāo)〔8〕。本研究表明糖皮質(zhì)激素能顯著抑制成骨細(xì)胞活性，使大鼠體內(nèi)骨代謝被破壞，骨吸收大于骨形成，即骨質(zhì)疏松狀態(tài)，也證實(shí)了地塞米松誘導(dǎo)大鼠構(gòu)建GIOP模型的可靠性，與以往研究一致。

中醫(yī)治療骨折歷史悠久。早在清代就提出了“血不活則瘀不去，瘀不去則新不能生，新不能生則骨不能合”的骨折中醫(yī)辯證施治理論，認(rèn)為應(yīng)采用補(bǔ)腎和活血化瘀類藥物治療骨折〔9〕。復(fù)骨方中骨碎補(bǔ)具有升高血Ca、血P水平，激活成骨細(xì)胞的作用；杜仲在骨折前期具有降低血Ca、升高血P的作用，能促進(jìn)骨痂生長，此外杜仲還含有相當(dāng)豐富的膠原、P、Ca等微量元素，能促進(jìn)骨折愈合；續(xù)斷已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、增殖，也有報(bào)道斷續(xù)能繼續(xù)刺激人成骨細(xì)胞的分化和增殖。復(fù)骨方中還配伍具有行氣活血、化瘀止痛功能的歸尾、川芎和紅花，是復(fù)骨方組方科學(xué)合理〔10〕。本研究提示復(fù)骨方能有效提高GIOP大鼠骨折股骨骨密度，促進(jìn)骨折的愈合；血生化指標(biāo)提示復(fù)骨方能提高成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨折處成骨細(xì)胞增殖，提高骨折愈合功能。

參考文獻(xiàn)4

1方楚玲.糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制與預(yù)防〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2014；20(20)：3718-20，3723.

2任兆舟.抑制IL-17對糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松小鼠的防治作用及其調(diào)節(jié)骨代謝機(jī)制研究〔D〕.沈陽：中國醫(yī)科大學(xué)博士論文，2013.

3楊琳，田金徽，何智余，等.阿侖膦酸鈉對糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致骨質(zhì)疏松防治作用的Meta分析〔J〕.中華內(nèi)科雜志，2013；52(10)：838-43.

4夏吉利，張霄雁，李哲海，等.糖皮質(zhì)激素在影響骨形成和骨吸收方面引起骨質(zhì)疏松的機(jī)制研究進(jìn)展〔J〕.中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2014；11(15)：189-90，192.

5明江華，吳希林，趙奇，等.經(jīng)皮椎體后凸成形術(shù)聯(lián)合唑來膦酸治療絕經(jīng)期婦女骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015；15(9)：1674-7.

6康學(xué)，周琦，李嶄，等.淫羊藿-女貞子對GIOP大鼠骨密度和激素水平的相關(guān)性分析〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013；19(23)：250-3.

7俞華威，王兆杰，胡小軍，等.抗骨質(zhì)疏松藥物應(yīng)用的依據(jù)：骨生化代謝標(biāo)志物及骨組織病理學(xué)〔J〕.中國組織工程研究，2013；17(28)：5126-32.

8李鵬，羅民，馬洪順，等.藥物治療老齡骨質(zhì)疏松大鼠骨顯微結(jié)構(gòu)與骨組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)的變化〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014；34(14)：3975-7.

9Klop C，de Vries F，Vinks T，etal.Increase in prophylaxis of glucocorticoid-induced osteoporosis by pharmacist feedback：A randomised controlled trial〔J〕.Osteoporos Int，2014；25(1)：385-92.

10曹國龍，劉小坡，馮云波，等.洛伐他汀聯(lián)合降鈣素治療骨質(zhì)疏松大鼠骨折的效果分析〔J〕.天津醫(yī)藥，2014；42(3)：238-40.

〔2015-07-15修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

基金項(xiàng)目：上海市寶山區(qū)衛(wèi)生青年醫(yī)學(xué)人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(bswsyq-2015-A05)

中圖分類號〔〕R6〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0021-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.009