替米沙坦對糖尿病心肌病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響及其作用機(jī)制

衛(wèi)銀芝 熊世熙 干學(xué)東 龔 斐 曹建雷

(1 湖北省黃石市中心醫(yī)院老年病科，黃石市 435000，E-mail：wyz2008yjh@163.com；2 武漢大學(xué)中南醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢市 430071)

論著·基礎(chǔ)研究

替米沙坦對糖尿病心肌病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響及其作用機(jī)制

衛(wèi)銀芝1熊世熙2干學(xué)東2龔 斐2曹建雷2

(1 湖北省黃石市中心醫(yī)院老年病科，黃石市 435000，E-mail：wyz2008yjh@163.com；2 武漢大學(xué)中南醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢市 430071)

目的 探討替米沙坦對糖尿病心肌病(DCM)大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響及其可能作用機(jī)制。方法 30只健康雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分成空白組10只和糖尿病組20只，糖尿病組用鏈脲佐菌素腹腔注射誘導(dǎo)建立DCM模型，建模成功后隨機(jī)分成對照組及治療組各10只。治療組給予替米沙坦(20 mg/kg)灌胃治療，空白組和對照組給予相同體積的生理鹽水灌胃。給藥16周后，光鏡和電鏡下觀察各組大鼠心肌病理改變，采用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記法檢測心肌細(xì)胞凋亡情況，免疫組化法檢測心肌細(xì)胞B淋巴細(xì)胞瘤因子-2(Bcl-2)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)及轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)的表達(dá)情況。結(jié)果 光鏡下對照組心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞核出現(xiàn)融合、消失、間質(zhì)纖維化等改變，電鏡下對照組心肌線粒體腫脹、嵴斷裂甚至空泡化，肌絲成分減少、斷裂。與對照組相比，治療組光鏡下心肌病理改變減輕，電鏡下心肌超微結(jié)構(gòu)病理改變也減輕。與空白組相比，對照組左室指數(shù)明顯升高、凋亡細(xì)胞增多、Bcl-2表達(dá)減少，Caspase-3的表達(dá)及TGF-β1的A值增加(P<0.05)；與對照組比較，治療組左室指數(shù)及凋亡指數(shù)下降、Bcl-2表達(dá)增加，而Caspase-3及TGF-β1的表達(dá)減少(P<0.05)。結(jié)論 替米沙坦可以改善DCM大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)，延緩心室重構(gòu)。

糖尿病心肌?。惶婷咨程?；心??；轉(zhuǎn)化生長因子β1；淋巴細(xì)胞瘤-2；半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶-3；大鼠；細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；心室重構(gòu)

糖尿病是一種發(fā)病率高的慢性疾病，估計中國目前已有超過9千萬的糖尿病患者。心血管并發(fā)癥是糖尿病患者致殘、致死的主要原因，其中糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥。DCM的發(fā)病機(jī)制是復(fù)雜的和多因素的，其具體的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)的激活是其發(fā)病的一個重要因素。本研究采用血管緊張素 Ⅱ 受體拮抗劑(angiotensin Ⅱ receptor blocker，ARB)替米沙坦治療鏈尿佐菌素(streptozotocin，STZ)誘發(fā)的DCM模型大鼠，觀察用藥前后DCM大鼠心肌病理及超微結(jié)構(gòu)的改變，探討替米沙坦對DCM的心臟保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要材料 2月齡健康雄性Wistar大鼠30只，體重200～250 g，平均體重220 g，由湖北省實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(鄂)2008-0005，在無特定病原體級動物房飼養(yǎng)。STZ購自Sigma公司；替米沙坦片(美卡素)購自上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司，批號：104337；脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記[terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL]試劑盒購自南京凱基生物有限公司；B淋巴細(xì)胞瘤因子-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)免疫組化試劑盒購自Santa Cruz公司；日本日立公司生產(chǎn)的日立H-600型透射電鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 DCM模型的建立： 采用隨機(jī)區(qū)組法將實驗動物分為空白組10只、糖尿病組20只。用0.1 mmol/L的枸櫞酸緩沖液(pH=4.2) 在冰浴中配制1%的STZ溶液。禁食12 h后，于糖尿病組大鼠的左下腹腹腔內(nèi)一次性注射55 mg/kg的 STZ溶液。注射后第3天及第7天斷尾取血測隨機(jī)血糖，如血糖≥16.7 mmol/L，且有多飲、多食、多尿現(xiàn)象者，定為糖尿病大鼠。所有實驗大鼠均建模成功。

1.2.2 處理方法：糖尿組大鼠建模成功后采用配對比較法隨機(jī)分組，分成對照組10只及治療組10只。治療組用替米沙坦20 mg/(kg·d)，以自來水溶解后灌胃，空白組和對照組給予相同體積的生理鹽水灌胃，1次/d，持續(xù)16周。所有大鼠均給予常規(guī)飲食和飲水，每2周測血糖1次，期間空白組隨機(jī)血糖≥7.8 mmol/L、其他兩組隨機(jī)血糖<16.7 mmol/L者被剔除出實驗。給藥16周末空腹12 h，結(jié)束實驗。

1.2.3 標(biāo)本的取材及制備：斷頸處死大鼠，迅速打開胸腔取出心臟，輕柔除去心臟周圍組織，用4℃預(yù)冷生理鹽水沖洗，過濾紙吸取水分，用電子天平稱重后迅速分解心臟，取左心室(含室間隔部分) 在電子天平上稱重。左心室重量/體重值表示左心室指數(shù)(mg/g)。取一部分含心尖部左心室心肌用4%多聚甲醛中固定24 h后，石蠟包埋制成切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，光鏡下觀察心肌病理改變。另取一部分含心尖部的左心室心肌用3%戊二醛和1%鋨酸固定，乙醇逐級脫水，丙酮浸透，環(huán)氧樹脂812包埋，制成500～700 Ao(埃)的超薄切片，在透射電鏡下觀察心肌超微結(jié)構(gòu)。

1.2.4 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)與心肌細(xì)胞Bcl-2、Caspase-3及TGF-β1表達(dá)的檢測：(1)根據(jù)試劑盒說明書的操作步驟，采用TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡，顯微鏡下細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，即凋亡心肌細(xì)胞。隨機(jī)計算5個高倍視野(×400)下的凋亡細(xì)胞數(shù)，凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)=凋亡細(xì)胞/100個細(xì)胞×100%。(2)根據(jù)試劑盒說明書的操作步驟，免疫組化法檢測心肌細(xì)胞Bcl-2、Caspase-3及TGF-β1表達(dá)。Bcl-2在細(xì)胞質(zhì)和核膜表達(dá)，陽性表達(dá)細(xì)胞為黃色或棕黃色。Caspase-3 主要存在細(xì)胞質(zhì)中，陽性為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒。TGF-β1表達(dá)的陽性結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕色或棕褐色染色。Bcl-2、Caspase-3采用每張切片在陽性表達(dá)區(qū)域選擇5個無重疊視野，以平均計數(shù)陽性細(xì)胞核數(shù)所占視野所有細(xì)胞數(shù)目的百分比作為表達(dá)率；TGF-β1采用平均光密度值表示各樣本心肌組織中TGF-β1免疫組化結(jié)果，以5個吸光度(A)的平均值作為各標(biāo)本心肌組織中的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以(x±s)表示，比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血糖變化 建模前空白組、對照組及治療組血糖分別為(4.84±1.52)mmol/L、(4.73±1.48)mmol/L及(5.01±1.33)mmol/L，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.153，P=0.874)；實驗過程中，空白組無大鼠血糖≥7.8 mmol/L，對照組及治療組血糖均處于異常升高水平，無大鼠被剔除出實驗。實驗結(jié)束時，建模前空白組、對照組及治療組血糖分別為(4.62±1.55)mmol/L、(25.12±8.23)mmol/L及(23.76±7.19)mmol/L，3組間血糖水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=115.472，P=0.001)，其中對照組及治療組的血糖均高于空白組(P<0.05)，而對照組及治療組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 3組大鼠體重及左心室指數(shù) 建模時3組大鼠體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗結(jié)束時，與空白組相比，對照組及治療組大鼠體重下降(P<0.05)，左室重量及左室指數(shù)明顯增加(P<0.05)；與對照組相比，治療組體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而左室重量及左心室指數(shù)下降(P<0.05)；見表1。

表1 3組大鼠體重及左心室指數(shù)比較(x±s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與糖尿病對照組比較，#P<0.05。

2.3 光鏡和電鏡下觀察心肌病理改變 光鏡下觀察，空白組心肌細(xì)胞排列整齊致密，細(xì)胞間質(zhì)較少，細(xì)胞核分布均勻一致，肌纖維整齊，無明顯斷裂；對照組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，或可見微小心肌壞死，間質(zhì)纖維化明顯，肌纖維部分?jǐn)嗔?；治療組心肌出現(xiàn)類似對照組病理改變，但程度減輕。電鏡下觀察，空白組大鼠心肌線粒體膜完整，嵴排列連續(xù)、整齊，肌絲整齊排列；對照組大鼠心肌線粒體腫脹、嵴斷裂、大部分丟失、甚至空泡化，肌絲成分減少、斷裂；治療組大鼠心肌線粒體膜基本完整，少部分嵴斷裂，線粒體損傷較對照組明顯減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠電鏡下心肌超微結(jié)構(gòu)(×10 000)

2.4 各組心肌組織細(xì)胞AI與Bcl-2、Caspase-3及TGF-β1表達(dá)率的比較 空白組偶見凋亡細(xì)胞；與空白組相比，對照組及治療組AI明顯增高，且Bcl-2表達(dá)率減少，Caspase-3表達(dá)率增加，大鼠心臟組織中TGF-β1平均A值顯著升高(均P<0.05)；與對照組相比，治療組AI明顯降低，Bcl-2表達(dá)率增加，Caspase-3表達(dá)率減少，TGF-β1平均A值降低。見表2及圖2。

表2 3組心肌細(xì)胞AI與Bcl-2、Caspase-3及TGF-β1表達(dá)率的比較(x±s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05。

圖2 各組心肌細(xì)胞凋亡情況(HE染色，×400)

3 討 論

目前普遍認(rèn)為DCM的特點是早期出現(xiàn)左室舒張功能障礙，并伴有心肌肥厚、心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)展[1]。本實驗中，對照組血糖處于異常升高水平，左室重量增加，左室指數(shù)升高，存在心肌肥厚；光鏡下觀察到心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞核出現(xiàn)融合、消失、間質(zhì)纖維化等改變； TUNEL法檢測心肌細(xì)胞AI也明顯升高。這提示本實驗的DCM大鼠模型成功。

在糖尿病者的心臟組織中可觀察到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(如肌纖維膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、肌原纖維和細(xì)胞外基質(zhì))存在不同程度的缺陷[2]。本實驗在電鏡下還觀察到對照組大鼠心肌細(xì)胞肥大、 肌纖維斷裂、肌絲扭曲以及線粒體增多、腫脹、變形、排列紊亂、結(jié)構(gòu)不清等病理改變。荷爾蒙失調(diào)(包括升高的血漿兒茶酚胺和血管緊張素Ⅱ水平)、代謝障礙及氧化應(yīng)激均是糖尿病的初始階段導(dǎo)致心肌亞細(xì)胞缺陷的因素[2]。而DCM的致病因素包括高血糖、胰島素抵抗、代謝紊亂、RAAS和內(nèi)皮素系統(tǒng)的激活[1]。血管緊張素Ⅱ是RAAS系統(tǒng)中最主要的活性物質(zhì)，也是導(dǎo)致心肌病理改變的重要因素，其在糖尿病心臟局部的生成量明顯高于在循環(huán)系統(tǒng)中[3]，其可以使心肌細(xì)胞肥大[4]以及左心室肥厚、心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡[3]，并主要通過血管緊張素-Ⅰ(angiotensin-Ⅰ，AT-Ⅰ)受體介導(dǎo)發(fā)揮作用[5]。替米沙坦是一種高選擇性的ARB，可特異性地作用于AT-Ⅰ受體亞型，本實驗給予替米沙坦干預(yù)后，與對照組相比，治療組光鏡下心肌病理改變減輕，電鏡下心肌超微結(jié)構(gòu)病理改變也減輕，左心室指數(shù)下降，心肌細(xì)胞凋亡減少。Ikejima等[6]發(fā)現(xiàn)替米沙坦可以抑制自身免疫性心肌病動物模型氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥因子表達(dá)，減輕心肌細(xì)胞凋亡，抑制心臟重構(gòu)，改善心功能。那么，替米沙坦是通過怎樣的機(jī)制改善DCM病理改變呢？

本實驗中，對照組心肌細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)率下降，Caspase-3及TGF-β1的表達(dá)率升高。Bcl-2是白血病蛋白家族中抗細(xì)胞凋亡亞族的主要代表，是線粒體凋亡途徑的重要調(diào)控蛋白。Caspase-3被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”，是在調(diào)控細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的半胱天冬酶家族的主要成員，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，在細(xì)胞凋亡過程中占據(jù)核心地位[7]，同時也是Bcl-2的下游調(diào)控蛋白。TGF-β1是一種從血小板中分離出來的多功能蛋白肽。研究表明，TGF-β1及其下游蛋白參與心肌間質(zhì)纖維化及心肌肥厚的病理過程[8]。通過AT-Ⅰ 受體起作用的AT-Ⅱ 和氧化應(yīng)激在糖尿病誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、肥厚和纖維化中發(fā)揮了重要作用，給予AT-Ⅰ 受體阻斷劑或抗氧化劑治療有治療DCM的作用[9]。長期高糖刺激下，心肌局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活，AT-Ⅱ 作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要介質(zhì)，刺激TGF-β生成，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)增生，而ARB能抑制TGF-β1分泌并減輕心肌纖維化程度[10]。石永英等[11]建立原代培養(yǎng)大鼠的心肌細(xì)胞肥大模型，結(jié)果顯示TGF-β1可使胚胎基因主要組織相容性復(fù)合體-β mRNA水平明顯增高，心肌細(xì)胞RNA含量增加。同時TGF-β1可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加，并顯著上調(diào)Caspase-3，并可能通過Caspase-3誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，電鏡觀察也顯示心肌細(xì)胞在TGF-β1誘導(dǎo)下同時存在肥大和凋亡表現(xiàn)。而Bcl-2與Caspase-3家族的關(guān)系也是相互的，一方面它參與抑制Caspase-3的合成，也通過抑止Cyt-c的釋放來阻止Caspase-3的激活；另一方面，Bcl-2不僅作用于Caspase-3的上游，它還是Caspase-3的直接底物[12-13]。本實驗中給予替米沙坦干預(yù)后，治療組心肌細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)率升高，Caspase-3及TGF-β1的表達(dá)率下降。提示替米沙坦可能是通過阻斷RAAS系統(tǒng)的過度激活，抑制TGF-β1分泌，下調(diào)Caspase-3的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)延緩心肌纖維化和/或肥厚，同時減少心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，改善心肌超微結(jié)構(gòu)的作用，起到保護(hù)心肌作用。但具體的機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，替米沙坦可以改善DCM大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)，延緩心室重構(gòu)，其可能的作用機(jī)制是阻斷RAS系統(tǒng)的過度激活、抑制TGF-β1分泌、下調(diào)Caspase-3表達(dá)并上調(diào)Bcl-2表達(dá)。

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Effect of telmisartan on myocardial ultrastructure in rats with diabetic cardiomyopathy and its mechanism

WEIYin-zhi1,XIONGShi-xi2,GANXue-dong2,GONGFei2,CAOJian-lei2

(1DepartmentofGeriatrics,HuangshiCenterHospital,HubeiProvince,Huangshi435000,China;2DepartmentofCardiovascularMedicine,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China)

Objective To explore the effect of telmisartan on myocardial ultrastructure in rats with diabetic cardiomyopathy(DCM) and its possible mechanism.Methods Thirty healthy male Wistar rats were randomly divided into blank group(n=10) and diabetic group(n=20).DCM model was established by transabdominal administration of streptozotocin in the diabetic group.After successful modeling,the diabetic group was randomly divided into control group and treatment group,with 10 rats in each group.Intragastric administration of telmisartan(20 mg/kg) was conducted in the treatment group,and intragastric administration of normal saline was conducted in the blank group and control group.After 16 weeks of administration,the myocardial pathological change was observed under light microscope and transmission electron microscope in each group,myocardial apoptosis index was examined by terminal deoxynueleotidyl transferase-mediated d-UTP nick end labeling,and the expressions of B-cell lymphoma-2(Bcl-2),Caspase-3 and transforming growth factor-β1(TGF-β1) were detected by immunohistochemistry.Results In the control group,the arrangement of myocardial cells was irregular,and the changes including fusion,vanishment and interstitial fibrosis were found in nucleus of myocardium under light microscope.Besides,the myocardial mitochondria lined irregularly,their cristae fractured and became vacuolation,and myofilaments decreased and fractured in the control group under transmission electron microscope.Compared with the control group,the pathological changes under light microscope and the myocardial ultrastructure under transmission electron microscope alleviated in the treatment group.Compared with the blank group,the left ventricular index and apoptosis index increased,the expression of Bcl-2 decreased,and the expression of Caspase-3 andAvalue of TGF-β1 increased in the control group(P<0.05).Compared with the control group,the left ventricular index and apoptosis index decreased,the expression of Bcl-2 increased,and the expressions of Caspase-3 andAvalue of TGF-β1 decreased in the treatment group(P<0.05).Conclusion Telmisartan can inprove the myocardial ultrastructure of rat with DCM，and slow the ventricular remodeling.

Diabetic cardiomyopathy,Telmisartan,Myocardium,Transforming growth factor-β1,B-cell lymphoma-2,Caspase-3,Rat,Cellular ultrastructure,Ventricular remodeling

衛(wèi)銀芝(1980～)，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：心肌保護(hù)方面的研究。

熊世熙(1957～)，男，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：心血管疾病，E-mail：xiongshixi@126.com。

R 362；R 587.1

A

0253-4304(2016)06-0766-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.06.04

2016-02-19

2016-05-04)