中藥抗耐藥大腸埃希菌的機(jī)制研究進(jìn)展▲

劉坤友

(廣西柳江縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，柳江縣 545100，E-mail：Ljrylky@163.com)

綜 述

中藥抗耐藥大腸埃希菌的機(jī)制研究進(jìn)展▲

劉坤友

(廣西柳江縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，柳江縣 545100，E-mail：Ljrylky@163.com)

耐藥大腸埃希菌是社區(qū)和醫(yī)院感染的常見致病菌之一，其耐藥機(jī)制復(fù)雜多變。中藥及其方劑抗耐藥大腸埃希菌的機(jī)制主要有抑制超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、消除R質(zhì)粒、改變細(xì)菌外膜通透性、干擾細(xì)菌的代謝、提高機(jī)體免疫功能及消除炎癥反應(yīng)等。構(gòu)建新的方劑，純化中藥的有效成分、明確其分子結(jié)構(gòu)，探討其消除耐藥的機(jī)理，是今后研究的方向。

大腸埃希菌；耐藥；中藥；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；R質(zhì)粒；細(xì)菌外膜；綜述

大腸埃希菌是臨床最常見的一種致病菌，常引起爆發(fā)流行，也是引起醫(yī)院內(nèi)感染和社區(qū)獲得性感染重要病原菌之一。在近10 年的醫(yī)院細(xì)菌檢驗(yàn)標(biāo)本中，大腸埃希菌標(biāo)本數(shù)量歷年均居前5位[1]。據(jù)2013年我國細(xì)菌耐藥監(jiān)測報(bào)告，在檢出的致病菌中，大腸埃希菌居首位占18.3%，其耐藥菌株占72.2%，且對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢呋辛、慶大霉素、氨芐西林/舒巴坦、頭孢曲松等一線抗生素高度耐藥[2]，給臨床治療帶來極大的困難。中醫(yī)藥治療感染性疾病歷史悠久，療效顯著，從中草藥中尋找抗耐藥的有效成分、研發(fā)新型抗感染藥物已成為當(dāng)前國內(nèi)外有關(guān)研究的熱點(diǎn)之一。本文對中藥抗耐藥大腸埃希菌的研究進(jìn)展綜述如下。

1 抑制超廣譜β-內(nèi)酰胺酶

大腸埃希菌耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，且變化迅速，其中產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)是其重要機(jī)制之一。ESBLs因能水解β胺類抗生素(氨曲南、卡蘆莫南等)而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥。ESBLs的活性可以被克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦等ESBLs抑制劑所抑制，因此抑制ESBLs的活性、減少其分泌量，是消除大腸埃希菌耐藥的有效途徑之一[3]。

近年，國內(nèi)學(xué)者對中草藥進(jìn)行大規(guī)模研究后發(fā)現(xiàn)，體外具有抑菌作用的中草藥繁多，主要集中在清熱解毒(半枝蓮、金銀花、板藍(lán)根、魚腥草、白頭翁、穿心蓮、白花蛇舌草等)、清熱燥濕(大黃、黃芩、黃連、黃柏、龍膽草、苦參等)、清熱瀉火(知母、天花粉、梔子、夏枯草等)、理氣化痰(橘紅、薤白、白芥子、蘇子等)、活血化淤(厚樸、桃仁、川芎、川斷、丹參、紅花)等中藥，其水提物濃度為0.1～0.8 g/ml時(shí)即對產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌有較強(qiáng)的抑制作用，用這些中藥組成的方劑治療感染性疾病具有較好的臨床效果。雙黃連粉針劑(哈藥集團(tuán)中藥二廠)和清開靈注射液[由膽酸、珍珠母(粉)、豬去氧膽酸、梔子、水牛角(粉)、板藍(lán)根、黃芩苷和金銀花組成，神威藥業(yè)有限公司]均具有廣譜抗菌作用，是治療感染性疾病的常用藥物，能減輕臟器損傷，消除患者菌血癥癥狀，縮短臨床病程，提高治療效果。雷云[4]用雙黃連粉針劑、清開靈注射液處理產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌，其 ESBLs活性為(3.68±0.21)U/mg，明顯低于空白對照組的(12.75±0.42)U/mg(P<0.05)，說明雙黃連粉針劑、清開靈注射液抑制大腸埃希菌是通過降低ESBLs活性實(shí)現(xiàn)的。

三黃湯(大黃、黃連、黃芩)、黃連解毒湯(黃連、黃芩、黃柏、梔子)、五味消毒飲(金銀花、蒲公英、紫花地丁、紫背天葵子、野菊花)是治療消化、呼吸、泌尿生殖系統(tǒng)急性感染性疾病的常用方藥。賈云鵬等[5]用試管二倍稀釋法測定3種中藥方劑的最低抑菌濃度分別為0.2 g/ml、0.1 g/ml、0.3 g/ml，認(rèn)為3種方劑對多重耐藥的大腸埃希菌均有抑制作用，酶活性測定試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其能降低ESBLs活性；采用Bradford法測定菌體內(nèi)蛋白質(zhì)總含量，發(fā)現(xiàn)3 種方劑能減少ESBLs的產(chǎn)量的含量；三黃湯、黃連解毒湯、五味消毒飲體外抑制試驗(yàn)效果與ESBLs抑制劑——克拉維酸相當(dāng)，但抑制ESBLs活性及減少ESBLs的含量效果卻不及克拉維酸(P<0.05)，說明三黃湯、黃連解毒湯、五味消毒飲逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性尚存在其他機(jī)制。目前已發(fā)現(xiàn)ESBLs基因型有200余種，主要為CTX-M、TEM、OXA和SHV型[6]，但三黃湯對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的體內(nèi)的ESBLs編碼基因OXA有抑制作用，可使其表達(dá)量下降，而對TEM、CTX-M、SHV、Acr-AB基因無明顯抑制作用[7]。

2 消除R質(zhì)粒

質(zhì)粒是細(xì)菌核質(zhì)以外的DNA，其種類繁多，其中R質(zhì)粒攜帶著耐藥基因。R質(zhì)?？梢栽诰w內(nèi)復(fù)制，在細(xì)胞分裂時(shí)傳給子代細(xì)菌；也可以通過細(xì)菌菌毛、噬菌體等媒介在細(xì)菌間傳播，從耐藥菌株轉(zhuǎn)移到敏感菌，使耐藥性得以快速傳播[8-9]。因此，通過消除耐藥大腸埃希菌R 質(zhì)粒，可使藥物恢復(fù)敏感性。

李玉虎等[10]用木香、黃精水煎提取液與痢疾桿菌氯霉素耐藥株(S.flexneRiD15 R-plasmid CmR)和大腸埃希菌氯霉素敏感株(Escherichiacoli1485 RifR)培養(yǎng)48 h后，兩種細(xì)菌間R質(zhì)粒轉(zhuǎn)移率為3.5%，明顯低于R質(zhì)粒自然轉(zhuǎn)移率63.5%(P<0.01)；R質(zhì)粒轉(zhuǎn)移抑制率95.9%，與消除劑——溴化乙錠的R質(zhì)粒轉(zhuǎn)移抑制率(95.3%)比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明木香、黃精能抑制CmR質(zhì)粒；在S.flexneRiD15 R-plasmid CmR與Escherichiacoli1485 RifR間的接合傳遞，從而使質(zhì)粒在細(xì)菌間的接合傳遞受阻，能控制細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和蔓延。

黃連、黃芩、大黃是最常用的清熱、燥濕、瀉下中藥，由其組成的二黃湯1號(黃連+大黃)、二黃湯2號(黃芩+大黃)、三黃湯(黃芩+黃連+大黃)、三黃片(大黃+黃芩總苷+鹽酸黃連素)是治療肺炎、細(xì)菌性痢疾、腹瀉等感染性疾病的常用藥物，體外實(shí)驗(yàn)證明其水煎提取液能有效抑制大腸埃希菌的作用；通過質(zhì)粒圖譜比對分析，表明大腸埃希菌的耐藥逆轉(zhuǎn)率為11%；用堿裂解法進(jìn)行質(zhì)粒抽提，對大腸埃希菌耐藥R質(zhì)粒消除率為31%，質(zhì)粒變化相關(guān)度(耐藥逆轉(zhuǎn)與質(zhì)粒丟失之間的關(guān)系)達(dá)75%以上。說明其逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性作用的機(jī)制可能與耐藥質(zhì)粒的消除有關(guān)，R質(zhì)粒消除后可能部分改變了染色體的結(jié)構(gòu)，造成染色體上耐藥基因的失活或丟失等[11]。

雷云[4]采用凝膠成像儀進(jìn)行檢查， 發(fā)現(xiàn)使用雙黃連及清開靈前后耐藥大腸埃希菌質(zhì)粒圖譜中丟失一條R 質(zhì)粒帶，說明其可消除耐藥大腸埃希菌R質(zhì)粒。然而，康梅等[12]的研究表明，雖然三黃片對大腸埃希菌有非常明顯的抑制作用，但質(zhì)粒指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒譜卻無改變，說明其未真正消除質(zhì)粒，其抗菌作用可能是滅活該耐藥質(zhì)?；蛞种屏速|(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性基因表達(dá)，這也說明這類中藥的抗大腸埃希菌機(jī)制十分復(fù)雜。

克痢痧(由白芷、蒼術(shù)、石菖蒲、細(xì)辛、蓽茇、鵝不食草、豬牙皂、丁香、硝石、白礬、雄黃、冰片組成，浙江蘇泊爾南洋藥業(yè)有限公司)對大腸埃希菌有明顯的抑菌作用，是治療腹瀉與細(xì)菌性痢疾的常用藥物之一。李延鴻等[13]對耐慶大霉素、氨芐西林的致病性大腸埃希菌，加克痢痧培養(yǎng)24 h，用紫外透射儀檢測凝膠分析系統(tǒng)攝像分析，顯示質(zhì)粒帶消失，R質(zhì)粒消除率為17.45%，與傳統(tǒng)R質(zhì)粒消除劑——十二烷基硫酸鈉比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明克痢痧消除大腸埃希菌R質(zhì)粒的作用是非常強(qiáng)大的?？傮w而言，中藥消除質(zhì)粒作用低于化學(xué)消質(zhì)劑(如十二烷基硫酸鈉)，而單味中藥消除大腸埃希菌R 質(zhì)粒的作用不及復(fù)方中藥。

3 改變細(xì)菌外膜通透性

細(xì)菌外膜具有阻止抗生素等外來物質(zhì)入侵的作用，使細(xì)菌自身得以生存和繁殖。大腸埃希菌外膜mar區(qū)基因突變導(dǎo)致F、C蛋白減少或缺失，使細(xì)菌細(xì)胞壁或外膜通透性改變而產(chǎn)生多重耐藥性[14]。

千里光有清熱解毒的功用，體外實(shí)驗(yàn)證明其能有效抑制大腸埃希菌。張文平等[15]用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)千里光處理的大腸埃希菌，菌體表面粗糙，部分菌體出現(xiàn)縊痕，并在縊痕處出現(xiàn)縊縮或斷裂等變化；同位素前體參入試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌DNA、RNA、蛋白質(zhì)和肽聚糖合成也受到明顯的抑制。這些作用可能與其有效成分黃酮類化合物有關(guān)。張金霞等[16]采用丙酮加熱回流法對中藥當(dāng)歸進(jìn)行提取，其對大腸埃希菌的最低抑菌濃度為2 500 μg/ml。掃描電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)測試菌變形，失去原有形態(tài)；大部分測試菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破裂，內(nèi)容物外溢。藥物濃度越高，上述改變越明顯。

黃衍強(qiáng)等[17]發(fā)現(xiàn)對氧氟沙星、環(huán)氧沙星和諾氟沙星等多重耐藥性大腸埃希菌均出現(xiàn)解旋酶基因(gyrase subunit A，gyrA) 基因突變，主要是第83和87位點(diǎn)分別出現(xiàn)C-T和G-A的突變。在含黃連素、大黃素、苦參堿等提取物的脅迫環(huán)境下培養(yǎng)多重耐藥性大腸桿菌30 d，傳代15次，經(jīng)PCR擴(kuò)增gyrA基因，檢測基因序列后未發(fā)現(xiàn)上述突變基因有回復(fù)跡象，認(rèn)為黃連素、大黃素、苦參堿等對多重耐藥大腸埃希菌的抑制作用，可能與生物膜被抑制或調(diào)控外排泵被黃連素、大黃素、苦參堿抑制有關(guān)，而與gyrA基因的突變回復(fù)無關(guān)。

羅芬芳[18]研究發(fā)現(xiàn)，黃藤素、沒食子酸體外實(shí)驗(yàn)對產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌無抑制作用，但可提高β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性。單獨(dú)的黃藤素或聯(lián)合頭孢噻肟與產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌增殖培養(yǎng)15代，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌酶基因mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ESBLs酶基因blaCTX-M-1G、blaCTX-M-9G的mRNA表達(dá)水平無明顯改變，表明黃藤素的抗菌增敏感作用不是通過影響β-內(nèi)酰胺酶mRNA表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的；單獨(dú)的沒食子酸或聯(lián)合頭孢噻肟與產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌增殖培養(yǎng)15代，對ESBLs酶基因blaCTx-M-1G mRNA表達(dá)水平無明顯影響，但能降低ESBLs酶基因blaCTX-M-1G mRNA表達(dá)水平，沒食子酸對頭孢噻肟的增敏作用可能是通過這一機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。

銀花泌炎靈片(吉林華康藥業(yè)股份有限公司)由車前子、桑寄生、金銀花、半枝蓮、燈芯草、半枝蓮、萹蓄等清熱利濕中藥組成，治療泌尿系感染、前列腺炎、慢性盆腔炎等疾病的總有效率達(dá)到90%。賽景影等[19]研究證明，銀花泌炎靈片95%乙醇提取物對大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC2592和產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌有明顯的抑制作用。掃描電子顯微鏡下觀察，經(jīng)銀花泌炎靈片95%乙醇提取物作用后，超薄切片透射電子顯微鏡可見菌體固縮膨大，細(xì)胞壁模糊不清甚至缺失，細(xì)胞質(zhì)固縮解體，形成小空泡；負(fù)染透射電子顯微鏡下可見菌體變形并出現(xiàn)褶皺，細(xì)胞壁出現(xiàn)凹陷。認(rèn)為銀花泌炎靈片的抑菌機(jī)制可能是藥物干擾或破壞大腸埃希菌細(xì)胞壁合成或破壞菌體內(nèi)大分子量蛋白，以致菌體超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變。王槐棟等[20]在含左氧氟沙星的培養(yǎng)基中對大腸埃希菌ATCC25922連續(xù)傳代，用DNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)其編碼parC基因第381位發(fā)生突變，A→T，其編碼的賴氨酸(127)→天冬酰胺，并在第386位堿基插入T。而用銀花泌炎靈片95%乙醇提取物則無此現(xiàn)象，說明在特定的環(huán)境壓力下銀花泌炎靈片不容易誘導(dǎo)大腸埃希菌發(fā)生耐藥性，細(xì)菌外膜parC基因突變可能是細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的原因之一。

4 干擾細(xì)菌的代謝

細(xì)菌可以通過改變自身的代謝途徑以對抗抗菌藥物而獲得耐藥性。細(xì)菌外膜存在一種能改變自身結(jié)構(gòu)的膜蛋白，在細(xì)菌自身能量支持下將藥物選擇性或非選擇性地排出細(xì)菌細(xì)胞外，如細(xì)菌外排泵，抗生素很容易誘導(dǎo)細(xì)菌外排泵的超表達(dá)，使細(xì)菌泵出更多的抗菌藥物，從而使靶位的藥物濃度明顯降低以利于細(xì)菌生存，由此導(dǎo)致細(xì)菌耐藥或多重耐藥[21]。

尉景娟等[22]采用瓊脂稀釋法測定黃芩黃酮、大黃蒽醌、敗醬草皂苷、白頭翁皂苷、重樓皂苷A、大血藤鞣、丹參素及丹參酮ⅡA等8種中藥單體的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)其對產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌、不產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌均有抑菌作用，其體外最低抑菌濃度基本相同，說明這8種中藥單體的抑菌作用不受ESBLs的影響，其機(jī)制可能與干擾細(xì)菌的代謝有關(guān)。桂勇等[23]報(bào)告烏梅、五倍子、黃連、黃芩對產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌株的體外抑菌活性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。上述研究表明前述中藥雖對ESBLs沒有水解作用，而這些中藥中含有的一些特殊成分如五倍子中的鞣酸、黃連中的小檗堿等卻均能抑制和干擾細(xì)菌的代謝。

細(xì)菌外排泵抑制劑是提高抑菌敏感度的一條有效途徑。張靜等[24]用142種中藥提取液對大腸埃希菌進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其有明顯的抑菌作用，用熒光定量PCR技術(shù)證實(shí)，這些中藥是通過下調(diào)大腸埃希菌的外排泵acrA基因mRNA表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步將142種中藥提取液、乳酸環(huán)丙沙星加入大腸埃希菌培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)，僅4種(2.8%)藥液能促使菌體內(nèi)藥物外排量減少、儲存量增加，從而提高藥物的敏感性；124種(87.3%)中藥提取物與乳酸環(huán)丙沙星(細(xì)菌外排抑制劑)聯(lián)用表現(xiàn)為拮抗作用，說明大部分中藥的抑菌作用不是通過細(xì)菌外排泵抑制機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，而是存在其他作用機(jī)制。

5 提高機(jī)體免疫功能，消除炎癥反應(yīng)

提高機(jī)體免疫力、消除炎癥反應(yīng)是中藥抗細(xì)菌耐藥的機(jī)制之一。楊東等[25]用吸附樹脂法、離子交換法和硅膠層析法，從白鮮皮水煎液中分離出生物堿類成分BXP-A。給小鼠注射抗內(nèi)毒素/脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)造成毒血癥，然后給毒血癥小鼠靜脈注射BXP-A，發(fā)現(xiàn)BXP-A能較好地中和LPS的作用，抑制炎癥細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)和白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6，對熱滅活的LPS 攻擊所致膿毒癥模型小鼠具有保護(hù)作用。

小檗堿是從黃連、黃柏等中藥提取的生物堿，體外實(shí)驗(yàn)證明其具有抗細(xì)菌和病毒感染、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、降血糖、改善心腦血管循環(huán)等功效。莊浩林等[26]報(bào)告其對產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌的最低抑菌濃度為62.5 g/L，并能降低血清TNF-α，IL-6含量，與抗生素聯(lián)用則具有增敏作用。認(rèn)為小檗堿保護(hù)大腸埃希菌所致的小鼠菌血癥模型，是通過消除炎癥反應(yīng)、提高機(jī)體免疫功能實(shí)現(xiàn)的。

苗健等[27]對大腸埃希菌腹膜炎誘發(fā)的膿毒癥大鼠模型，用復(fù)方清下湯(大黃、厚樸、 枳實(shí)、 芒硝、連翹、公英、 金銀花、梔子、牡丹皮)灌胃，發(fā)現(xiàn)血清IL-1、IL-6水平明顯降低(P<0.01)；組織病理顯示肺濕/干比值明顯降低(P<0.01)，鏡下見肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹減輕，纖維素滲出減少，出血減輕，肺泡間隔變窄。認(rèn)為復(fù)方清下湯對膿毒癥大鼠的保護(hù)作用是通過消除炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。

顧向晨等[28]對大腸埃希菌感染的膀胱炎SD大鼠，灌注二丁二仙湯(地丁草、蒲公英、知母、黃柏、仙靈脾、仙茅、巴戟天、當(dāng)歸)后膀胱刺激癥狀明顯減輕，采用Western Blot法檢測膀胱組織中的TNF-α、抑制性卡巴蛋白(inhibitor-kappaB α，IKBα)、磷酸化抑制性卡巴蛋白，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量明顯下降，膀胱雌激素受體βmRNA明顯上升(P<0.05)。認(rèn)為二丁二仙湯預(yù)防泌尿道感染發(fā)生，其機(jī)制可能為上調(diào)血清雌激素，局部激活膀胱雌激素受體β，調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子kappa B通路，抑制IKBα磷酸化，下調(diào)TNF-α分泌。

6 問題與展望

大腸埃希菌耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，且變化迅速，是臨床治療中的一個(gè)棘手問題。近年的研究證明，清熱解毒、燥濕瀉火及活血化淤中藥對大腸埃菌有較好的抑制作用，但研究多集中在體外抑制大腸埃希菌效果觀察方面，對其有效成分、機(jī)理的研究不多。中藥成分復(fù)雜，在人體內(nèi)可能存在協(xié)同作用。從發(fā)現(xiàn)青蒿素并取得諾貝爾獎(jiǎng)的啟示中可見，構(gòu)建新的方劑，純化中草藥的有效成分并弄清其分子結(jié)構(gòu)，探討其消除耐藥的機(jī)理，是今后研究的方向。

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廣西醫(yī)藥衛(wèi)生科研課題(Z2010047)

劉坤友(1973～)，男，本科，副主任技師，研究方向：醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。

R 284

A

0253-4304(2016)06-0842-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.06.24

2018-01-18

2016-04-18)