GRP78、GRP94及CHOP在亞砷酸鈉致肝損傷過(guò)程中的表達(dá)變化

李建勛 李艷 何陽(yáng) 韓冰

(1.武警貴州省總隊(duì)離職干部休養(yǎng)所，貴州 貴陽(yáng) 550002;2.貴陽(yáng)市公共衛(wèi)生救治中心,貴州 貴陽(yáng) 550002；3.貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550001；4.貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

·論 著·

GRP78、GRP94及CHOP在亞砷酸鈉致肝損傷過(guò)程中的表達(dá)變化

李建勛1李艷2何陽(yáng)3韓冰4△

(1.武警貴州省總隊(duì)離職干部休養(yǎng)所，貴州 貴陽(yáng) 550002;2.貴陽(yáng)市公共衛(wèi)生救治中心,貴州 貴陽(yáng) 550002；3.貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550001；4.貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

目的 觀察亞砷酸鈉致肝損傷過(guò)程中肝臟內(nèi)GRP78、GRP94及CHOP的表達(dá)變化并探討其在亞砷酸鈉致肝損傷中的可能作用。方法 Wistar大鼠20只，隨機(jī)分為正常組及亞砷酸鈉組，每組各10只。亞砷酸鈉組大鼠自由飲用含200 mg/L的NaAsO2自來(lái)水制備砷中毒致肝損傷模型，正常組大鼠則自由飲用自來(lái)水，時(shí)間為8周。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)肝組織中GRP78、GRP94及CHOP蛋白的表達(dá)變化；采用PCR技術(shù)檢測(cè)肝臟中GRP78、GRP94及CHOP mRNA的變化；同時(shí)應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡。結(jié)果 免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)亞砷酸鈉組大鼠肝臟中GRP78、GRP94及CHOP 在蛋白水平的表達(dá)較正常組大鼠顯著增加(P<0.05)；PCR檢測(cè)結(jié)果顯示亞砷酸鈉組大鼠肝臟中GRP78、GRP94及CHOP mRNA的表達(dá)也較正常組顯著增加(P<0.05)；此外與正常組比較，亞砷酸鈉組大鼠肝臟中肝細(xì)胞凋亡明顯增多(P<0.05)。結(jié)論 GRP78、GRP94及CHOP在基因及蛋白水平表達(dá)上調(diào)可能參與了亞砷酸鈉致肝損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

砷中毒； 肝損傷； 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78； 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94； CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白

我國(guó)是砷中毒最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，目前病區(qū)人口達(dá)300多萬(wàn)，砷中毒已被列入國(guó)家“十五”、“十一五”和“健康中國(guó)2020行動(dòng)計(jì)劃”中重大防治疾病?，F(xiàn)有的流行病學(xué)調(diào)查和研究顯示砷中毒主要以肝臟和皮膚損害為主[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是指在病因作用下引起大量錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生理功能發(fā)生嚴(yán)重紊亂的一種亞細(xì)胞器病理過(guò)程[2]。ERS 與多種肝臟疾病之間存在密切關(guān)系，但其與砷中毒導(dǎo)致的肝損傷是否有關(guān)，目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78)及葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(glucose regulated protein 94, GRP94)是廣泛分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶，其主要作用是協(xié)助蛋白質(zhì)的正確折疊、裝配和運(yùn)輸[3]。在ERS條件下，GRP78及GRP94的合成呈顯著增加趨勢(shì)，因此GRP78及GRP94表達(dá)增高可以作為ERS發(fā)生的標(biāo)志性蛋白[4]。CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)同源蛋白(homologous protein，CHOP)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78下游的信號(hào)分子，在ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[5]。本研究采用亞砷酸鈉(NaAsO2)復(fù)制砷中毒大鼠動(dòng)物模型，觀察各組大鼠肝組織中GRP78、GRP94及CHOP的表達(dá)變化，并探討上述指標(biāo)在砷致肝損傷中的可能作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗大鼠多克隆GRP78、GRP94及CHOP抗體(武漢博士德公司)；免疫組化鏈酶親和素-生物素-酶復(fù)合物(strept avidin-biotin complex，SABC)試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯色劑(北京中杉金橋公司)；TUNEL檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；SYBR Green及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)；亞砷酸鈉(美國(guó)Sigma公司)；β-actin、GRP78、GRP94及CHOP引物(上海生工生物工程有限公司)。β-actin：上游5’-TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCT-3’，下游5’-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3’；GRP78：上游5’-TGGAATCTTCACCTCAGAGTG-3’，下游5’-ATATCCAAGGTGAACACACAC-3’；GRP94：上游5’-ACTGTTGAGGAGCCCATGGAGG-3’，下游5’-GCTGAAGAGTCTCGCGGGAAAC-3’；CHOP：上游5’-CCTCGCTCTCCAGATTCCA-3’，下游5’-CTCATTCTCCTGCTCCTTCTCC-3’。

1.2 砷中毒模型制備 雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量190～200 g，隨機(jī)分為正常組及砷中毒組，每組各10只大鼠。砷中毒組大鼠給予含200 mg/L的NaAsO2自來(lái)水自由飲用以制備砷中毒模型，造模時(shí)間為8周；正常組大鼠則自由飲用自來(lái)水。在第8周末處死各組大鼠，取每只大鼠相同部位的肝葉固定于4%中性甲醛溶液中以備進(jìn)行組織病理學(xué)檢查及免疫組化檢測(cè)，其余肝組織保存于-80 ℃低溫冰箱中以備進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè)方法

1.3.1 肝組織病理學(xué)檢查 每只大鼠相同部位的肝組織經(jīng)4 %多聚甲醛固定后，進(jìn)行石蠟包埋、切片及HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟的組織病理學(xué)改變。

1.3.2 肝組織免疫組化檢測(cè) 肝組織石蠟切片經(jīng)二甲苯及梯度酒精脫蠟水化后，在3% H2O2溶液中室溫放置10 min封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；隨后經(jīng)微波修復(fù)抗原后，滴加封閉液室溫放置20 min，甩掉多余的封閉液后滴加兔抗大鼠GRP78、GRP94及CHOP一抗 (工作濃度為1∶100)，置于4℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜。次日加生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育30 min后用PBS洗3次，加SABC工作液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。陰性對(duì)照以PBS 緩沖液代替一抗。隨機(jī)抽取5個(gè)高倍鏡視野，觀察GRP78、GRP94及CHOP陽(yáng)性表達(dá)的定位及陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。

1.3.3 Real-time PCR 檢測(cè) 從肝組織中提取總RNA，應(yīng)用梯度PCR儀逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后進(jìn)行Real-time PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系：10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板 4 μL，2×SYBR Green I 12.5 μL， RNase-free H2O 6.5 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，最后兩步重復(fù)40個(gè)循環(huán)。

1.3.4 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 肝組織病理學(xué)改變 正常大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，無(wú)肝細(xì)胞變性、壞死；砷中毒大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,匯管區(qū)有少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞有不同程度的氣球樣變性。大鼠肝組織病理學(xué)改變見(jiàn)圖1。

正常組(×400) 砷中毒模型組(×400)圖1 大鼠肝組織病理學(xué)改變(HE染色)

2.2 肝臟中GRP78、GRP94及CHOP蛋白的表達(dá) 正常組大鼠肝臟中鮮有GRP78、GRP94及CHOP陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞，而砷中毒組大鼠肝臟內(nèi)可見(jiàn)大量胞漿呈棕黃色染色的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，砷中毒大鼠肝臟內(nèi)GRP78、GRP94及CHOP陽(yáng)性表達(dá)均較正常組顯著增多,見(jiàn)表1，圖2。

表1 肝臟中GRP78、GRP94及CHOP蛋白的表達(dá)(±s，n=10)

注：與正常組比較，*P<0.05；與正常組比較，▲P<0.01。

2.3 肝臟中GRP78、GRP94及CHOP mRNA表達(dá) 與正常組大鼠比較，砷中毒組大鼠肝臟中GRP78、GRP94及CHOP mRNA的表達(dá)均較正常組大鼠顯著增加，見(jiàn)表2。

表2 大鼠肝臟中GRP78、GRP94及CHOP mRNA表達(dá)(±s)

注：與正常組比較，*P<0.05；與正常組比較，▲P<0.01。

2.4 肝臟中細(xì)胞凋亡情況 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，細(xì)胞核呈明亮黃綠色染色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。正常組大鼠肝組織中僅有少量鮮有凋亡的肝細(xì)胞；而砷中毒組大鼠肝臟中肝細(xì)胞凋亡的數(shù)目較正常組大鼠明顯增多。

3 討 論

燃煤型砷中毒和飲水型砷中毒是我國(guó)環(huán)境砷中毒的兩大主要類型。慢性砷中毒患者的主要表現(xiàn)為皮膚病變以及對(duì)各器官、系統(tǒng)的影響[6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，無(wú)機(jī)砷的甲基化是機(jī)體內(nèi)砷降解代謝的主要途徑且被攝入體內(nèi)的砷主要分布在肝臟, 而肝臟為無(wú)機(jī)砷甲基化代謝的主要器官, 因此，肝臟是砷的毒性作用的主要靶器官之一。研究[8]表明，慢性砷暴露可引起不同程度的肝損傷、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，是蛋白質(zhì)合成的主要場(chǎng)所[9]。當(dāng)各種致病因素作用于機(jī)體，引起大量錯(cuò)誤折疊蛋白或未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量聚集時(shí)，就可通過(guò)相應(yīng)的信號(hào)通路引發(fā)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[10-11]。研究[12]證實(shí)藥物性肝病、病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝等肝臟疾病的發(fā)生均與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。但關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與砷致肝損傷之間的關(guān)系目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。

本次研究發(fā)現(xiàn)，大鼠自由飲用含砷水8周后，肝細(xì)胞發(fā)生不同程度的脂肪樣變性，匯管區(qū)有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示給與200 mg/L劑量的含砷水飲用8周已經(jīng)導(dǎo)致染砷大鼠肝臟發(fā)生明顯的損傷。此外，在研究中還發(fā)現(xiàn)砷中毒大鼠肝臟中GRP78和GRP94在基因及蛋白水平的表達(dá)較正常組大鼠顯著增加，由于GRP78和GRP94是ERS的標(biāo)志性蛋白，因此它們?cè)诨蚣暗鞍姿降谋磉_(dá)上調(diào)說(shuō)明在砷致肝損傷的過(guò)程中存在肝細(xì)胞ERS反應(yīng)。ERS時(shí)可通過(guò)激活未折疊蛋白反應(yīng)保護(hù)細(xì)胞免受有害因素的損傷，恢復(fù)細(xì)胞的功能，因此，適度的ERS有利于細(xì)胞的存活；但是如果損傷過(guò)于嚴(yán)重，或細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定不能及時(shí)恢復(fù)，此時(shí)ERS則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。持續(xù)的ERS時(shí)，表達(dá)增多的GRP78 和GRP94可通過(guò)三個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白PERK、IRE-1和ATF6啟動(dòng)下游信號(hào)分子CHOP蛋白的表達(dá)。CHOP是一個(gè)特異性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，屬于CCAAT增強(qiáng)結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族成員。有研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)的ERS時(shí)CHOP表達(dá)增加可促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

本次研究發(fā)現(xiàn)，大鼠染砷8周后，肝組織中CHOP基因及蛋白的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組大鼠，結(jié)合本次研究發(fā)現(xiàn)的砷中毒組大鼠肝細(xì)胞凋亡明顯增加，因此我們推測(cè)，在砷致肝損傷過(guò)程中，持續(xù)存在的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能通過(guò)促進(jìn)CHOP基因及蛋白的表達(dá)加速肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而促進(jìn)肝損傷的發(fā)生發(fā)展。

(本文圖2見(jiàn)封三)

[1] 孫貴范．關(guān)注慢性砷暴露對(duì)健康危害的研究進(jìn)展[J]．中華地方病學(xué)雜志, 2014, 33(1): 1-2.

[2] 祝筱梅, 劉秀華. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與缺血再灌注損傷及其防護(hù)[J]. 國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志, 2006, 26(2) : 177-181.

[3] Adachi T, Kaminaga T, Yasuda H, et al. The involvement of endoplasmic reticulum?stress in bile acid-induced hepatocellular injury[J]. J Clin Biochem Nutr， 2014, 54(2):129-135.

[4] 卓德祥, 唐朝樞, 李載權(quán). 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)基因表達(dá)調(diào)控的多樣性[J]. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志, 2006, 3(1):32-35.

[5] 杜錫潮, 韓冰, 謝汝佳, 等. 肝纖維化大鼠肝臟中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子CHOP和TRB3的表達(dá)變化[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2013, 29(5):906-912.

[6] 黃曉欣, 張愛(ài)華, 楊大平, 等．燃煤型砷中毒患者臨床特征、多系統(tǒng)損害及其意義[J]．中國(guó)地方病學(xué)雜志, 2002, 21(6)：490-493.

[7] 曹立, 郭小娟．慢性砷暴露與砷毒性的研究新進(jìn)展[J]．醫(yī)學(xué)綜述, 2014, 20(17)：3161-3163.

[8] 李媛媛, 高彥輝, 趙麗軍, 等．砷暴露致大鼠肝臟損傷的病理形態(tài)學(xué)研究[J]．中國(guó)地方病學(xué)雜志, 2011, 30(10)：68.

[9] Jiang ZQ, Yao ZH, Deng ZT, et al. Study on antagonistic effect of liangxue huayu recipe on endoplasmic reticulum stress-induced L02 hepatocyte apoptosis and its mechanism[J]. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi， 2013, 38(20): 3544.

[10] 溫靜靜, 謝汝佳, 韓冰, 等. 肝纖維化大鼠肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)及GRP78表達(dá)的研究[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2011, 27(11):2210-2213.

[11] 謝加力, 李俊, 黃艷, 等. 大鼠肝纖維化進(jìn)程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的動(dòng)態(tài)變化研究[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 47(9): 1028-1032.

[12] 王洪巖, 劉曉珺, 杜雅菊, 等. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝臟疾病研究進(jìn)展[J]. 世界華人消化雜志, 2012, 20(6): 451-459.

Change of mRNA and protein levels of GRP78, GRP 94 and CHOP in the process of sodium arsenite-induced liver injury

LiJianxun1,LiYan2,HeYang3,HanBing4△.

1.SanatoriumforRetiredCadresofArmedPoliceCorpsofGuizhouProvince,Guiyang550002; 2.GuiyangPublicHealthCenter，Guiyang550002; 3.TheFirstPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang550002; 4.DepartmentofPathophysiology,GuizhouUniversityofMedicalScience,Guiyang550025,China.

Objective To measure the change of mRNA and protein levels of GRP78, GRP 94 and CHOP in the process of sodium arsenite-induced liver injury and further to explore their possible roles in liver damage. Methods 20 Wistar rats were randomly divided into normal control group and arsenic poisoning model group, 10 in each group. For the next 8 weeks, the rats in model group were fed with tap water containing 200mg/L NaAsO2for the establishment of arsenic poisoning model, while the rats in control group were fed with tap water. mRNA and protein levels of GRP78, GRP 94 and CHOP were detected by real-time PCR and immunohistochemical techniques, respectively. Meanwhile, cell apoptosis in liver was detected by TUNEL. Results Compared with normal control group, both mRNA and protein levels of GRP78, GRP 94 and CHOP in rats of arsenic poisoning model group increased significantly (P<0.05). Besides, the apoptosis of hepatocytes in arsenic poisoning model group was elevated (P<0.05). Conclusion The up-regulating of mRNA and protein levels of GRP78, GRP 94 and CHOP might play important roles in the process of sodium arsenite-induced liver injury.

Arsenic poisoning； Liver injury； GRP78； GRP 94； CHOP

國(guó)家自然科學(xué)基金資助(編號(hào)：81100284)

R363

A

1000-744X(2016)01-0003-03

2015-09-18)

△通信作者，E-mail：hanbing791203@163.com