支氣管肺泡灌洗液檢測(cè)在肺結(jié)核研究及臨床應(yīng)用中的進(jìn)展

彭文鋒 綜述 陳玲 審校

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563003)

支氣管肺泡灌洗液檢測(cè)在肺結(jié)核研究及臨床應(yīng)用中的進(jìn)展

彭文鋒 綜述 陳玲△審校

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563003)

支氣管肺泡灌洗； 肺結(jié)核； 檢測(cè)

支氣管肺泡灌洗術(shù)(BAL)是運(yùn)用支氣管鏡對(duì)支氣管以下肺段或亞肺段水平，反復(fù)以無菌生理鹽水灌洗、回收，獲得支氣管肺泡灌洗液(BALF)，從病原微生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞學(xué)及酶學(xué)等角度檢測(cè)分析BALF性質(zhì)，用于肺部疾病的診斷與鑒別診斷。在涂陰、無痰，標(biāo)本獲取困難而又急需抗結(jié)核治療的肺結(jié)核患者，運(yùn)用各種技術(shù)檢測(cè)BALF中結(jié)核分枝桿菌或相關(guān)成份有利于疾病的診斷與鑒別診斷，為早期抗結(jié)核治療提供病原學(xué)依據(jù)。本文就BALF在肺結(jié)核(PTB) 基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展綜述如下。

1 BALF傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌

傳統(tǒng)肺結(jié)核的診斷主要根據(jù)癥狀、體征、痰抗酸桿菌涂片鏡檢，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及胸部X線/CT影像學(xué)。對(duì)痰菌陰性及無法獲得痰標(biāo)本的可疑肺結(jié)核患者，病原學(xué)確診受到限制，因此，應(yīng)用支氣管鏡進(jìn)行BALF涂片、培養(yǎng)，結(jié)合刷檢涂片、培養(yǎng)，及鏡檢后痰涂片、培養(yǎng)可提高結(jié)核分枝桿菌檢出率。

在人免疫缺陷病毒(HIV)流行地區(qū)，BAL檢查在合并HIV感染的菌陰肺結(jié)核患者也有很好的敏感性，二次BALF結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)陽(yáng)性率高于一次[1]。支氣管鏡技術(shù)也有助于兒童肺結(jié)核的診斷與病情評(píng)估，E.Cakir[2]對(duì)167名2個(gè)月至16 歲臨床診斷肺結(jié)核兒童行纖維支氣管鏡檢查，以評(píng)估氣道受累風(fēng)險(xiǎn)及獲取標(biāo)本進(jìn)行涂片、培養(yǎng)，結(jié)果顯示BALF檢測(cè)陽(yáng)性率(48/167，28.7%)略低于胃液 (GA) (54/167，32.6%)，聯(lián)合BALF涂片及培養(yǎng)能使陽(yáng)性率提高至41.9%。雖然有學(xué)者[3]認(rèn)為疑似肺結(jié)核兒童支氣鏡檢標(biāo)本結(jié)核菌陽(yáng)性率不高，但隨著支氣鏡檢查設(shè)備的更新發(fā)展，其在復(fù)雜性肺結(jié)核的診斷方面支氣管鏡具有非常重要的價(jià)值。BAL在肺結(jié)核的診斷有很好的運(yùn)用價(jià)值，但存在發(fā)生結(jié)核分枝桿菌交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)需更高成本。有鑒于此，可運(yùn)用更為簡(jiǎn)單與安全的痰誘導(dǎo)法(SI)診斷菌陰或無痰的肺結(jié)核患者，3次SI所獲標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性率與BALF類似，此操作需在呼吸道隔離檢查室進(jìn)行以防止院內(nèi)傳播。如SI標(biāo)本量不夠，BAF仍可選擇。

2 BALF分子生物學(xué)方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌

聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)，是對(duì)特定DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法，數(shù)小時(shí)內(nèi)即可使幾個(gè)拷貝的模板序列甚至一個(gè)DNA分子擴(kuò)增107～108倍，用于BALF結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)具有特異、敏感、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。張宏英等[4]運(yùn)用集PCR和DNA探針雜交技術(shù)為一體的熒光定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)痰和BALF結(jié)核分枝桿菌，BALF具更高敏感性，而特異性相近。對(duì)于合并HIV感染的患者，運(yùn)用高敏感性的熒光定量PCR檢測(cè)BALF中結(jié)核分枝桿菌，Kibiki界定CT值為32時(shí)，敏感性達(dá)到85.7%，特異性90.9%，但對(duì)PCR陽(yáng)性， BALF培養(yǎng)陰性的患者隨訪18個(gè)月未發(fā)現(xiàn)進(jìn)展為活動(dòng)性肺結(jié)核，說明PCR陽(yáng)性結(jié)果對(duì)病情判斷存在一定局限性。上述各項(xiàng)研究結(jié)果之間敏感性、特異性的差異可能與研究對(duì)象的選擇、PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)處理方法不同有關(guān)，但都認(rèn)為在菌陰或無痰的肺結(jié)核患者，PCR檢測(cè)BALF中結(jié)核分枝桿菌DNA高效可靠。同時(shí)，PCR的高靈敏也容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，應(yīng)重視標(biāo)本前期采集與處理，避免污染。2010年12月WHO批準(zhǔn)基于PCR原理的Xpert?MTB/RIF技術(shù)用于結(jié)核分枝桿菌的快速檢測(cè)，統(tǒng)一的操作程序與檢測(cè)設(shè)備減少了各實(shí)驗(yàn)室之間的誤差。H.Y.Lee[5]以最終培養(yǎng)結(jié)果為參照，Xpert?MTB/RIF用于支氣管沖洗液及BALF結(jié)核分枝桿菌早期檢測(cè)有非常高的準(zhǔn)確性，敏感性與特異性顯著高于痰涂片。P.Le Palud[6]研究指出Xpert?MTB/RIF陽(yáng)性率與BALF等氣道標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果相近，在結(jié)核病低負(fù)擔(dān)國(guó)家用于肺結(jié)核的早期診斷是有益的。G.Theron[7]納入160例無痰或涂陰疑似肺結(jié)核患者，BALF標(biāo)本用于Xpert?MTB/RIF檢測(cè)及培養(yǎng)，Xpert?MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果可靠，重復(fù)性好，不受BALF離心沉淀、合并HIV感染影響，是否耐利福平也避免了經(jīng)驗(yàn)性治療，有利于制定合理的抗結(jié)核治療處方方案。Xpert?MTB/RIF檢測(cè)兒童BALF也有很高的敏感性與特異性[8]，<3歲未接種過BCG且與肺結(jié)核患者有接觸史兒童，BALF Xpert?MTB/RIF陽(yáng)性率明顯升高，應(yīng)引起重視[9]。

3 BALF中結(jié)核抗原、抗體、免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的檢測(cè)與分析

結(jié)核病涉及全身各個(gè)器官組織，如肺結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性腦膜炎、骨結(jié)核、淋巴結(jié)結(jié)核等，主要引起局部病變。目前，大多數(shù)結(jié)核病免疫學(xué)診斷方法主要檢測(cè)與分析人外周血結(jié)核抗原、抗體、細(xì)胞成份及細(xì)胞因子，特異性差、敏感性低、干擾因素較多，而對(duì)局部病灶上述成份的研究相對(duì)較少。應(yīng)用免疫學(xué)方法檢測(cè)BALF中抗原、抗體等可能有助于發(fā)現(xiàn)更具敏感性與特異性的生物標(biāo)志物用于診斷菌陰肺結(jié)核、評(píng)估疾病的嚴(yán)重程度、預(yù)后等。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA) 采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定，是常用的一種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)，目前多用此法檢測(cè)BALF中結(jié)核分枝桿菌各種相關(guān)的抗原抗體和細(xì)胞因子。魏娟[10]對(duì)包括BALF在內(nèi)的非血體液標(biāo)本IGRA檢測(cè)價(jià)值進(jìn)行了總結(jié)，C.Jafari[11]認(rèn)為BALMC ELISpot對(duì)涂陰活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷優(yōu)于PBMC ELISpot，前者不受既往感染結(jié)核分枝桿菌的影響，H.Li[12]也得出相似結(jié)論。而在合并HIV/AIDS進(jìn)展期的涂陰肺結(jié)核患者，BALMC ELISpot特異性較差(48%, 95% CI 32%～64%)，IGRA結(jié)果不確定性高于PBMC ELISpot (34% VS. 14%, difference 20%, 95% CI 7%～33%, p 0.002)，A.Cattamanchi[13]不建議在HIV/AIDS流行的結(jié)核病高負(fù)擔(dān)地區(qū)運(yùn)用BALMC ELISpot診斷涂陰肺結(jié)核，BALMC ELISpot結(jié)果在此類患者的不確定性及低特異性原因尚需進(jìn)一步研究。針對(duì)BALF中各種免疫細(xì)胞研究主要集中于T淋巴細(xì)胞數(shù)量、亞型，也有B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞相關(guān)研究。BALF中Th1淋巴細(xì)胞激活和肺泡巨噬細(xì)胞分泌IFN-γ共同引起結(jié)核病變部位的細(xì)胞免疫反應(yīng)，R.F.Silver用支氣管鏡給受試者灌注0.5個(gè)單位PPD，48 h后獲取BALF，PPD陽(yáng)性者BALF中CD4+T細(xì)胞和分泌IFN-γ的炎癥細(xì)胞數(shù)比例增加，而PPD陰性者未見炎癥反應(yīng)，這種激發(fā)模型有助于明確局部抗結(jié)核的免疫炎癥反應(yīng)機(jī)制。非HIV感染的慢性復(fù)發(fā)性肺結(jié)核患者BALF中CD8+T細(xì)胞增加，CD4/CD8比值下降，認(rèn)為T淋巴細(xì)胞亞群比例失衡在機(jī)體防御結(jié)核分枝桿菌感染方面起主要作用。ALF中各免疫細(xì)胞最終是通過分泌各種炎癥細(xì)胞因子起作用的，肺泡巨噬細(xì)胞的激活并分泌IL-1β，IL-6和TNF-α參與了結(jié)核結(jié)節(jié)形成與局部感染的控制，E.Küpeli[14]認(rèn)為BALF中TNF-α水平在鑒別健康者與涂陰肺結(jié)核是一項(xiàng)非常有用的指標(biāo)，活動(dòng)性肺結(jié)核BALF淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞升高同時(shí)伴IL-8, MCP-1明顯升高，恢復(fù)期肺結(jié)核MCP-1較健康對(duì)照組下降、未檢測(cè)到IL-8，據(jù)此K.Kurashima[15]指出宿主在對(duì)抗結(jié)核感染不同階段有不同細(xì)胞因子參與，而唐神結(jié)等[16]認(rèn)為TNF-α、sTNF-R I、IL-1β和IL-1受體水平的檢測(cè)可作為了解疾病活動(dòng)性、判斷病情及預(yù)后、監(jiān)測(cè)抗結(jié)核療效的參考。在非空洞型AIDS肺結(jié)核患者IP-10和 IL-7水平高于空洞型，這些因子在空洞型患者BALF的下調(diào)可能導(dǎo)致了AIDS患者結(jié)核病情的進(jìn)展，而IL-4 和 IL-12p40上調(diào)促進(jìn)了病情的惡化[17]。新近又發(fā)現(xiàn)由肺結(jié)核誘發(fā)的ARDS患者BALF中CXCL8(IL-8)水平顯著升高，開發(fā)CXCL8抑制劑或阻斷劑可能有助于這類患者的臨床治療[18]。

兒童肺結(jié)核患者BALF中細(xì)胞因子的研究較少，E.M.Auber-Pivert[19]通過測(cè)定BALF各類細(xì)胞分泌的6種炎癥因子(IFN-γ、IL-12, TNF-α, IL-10, IL-4, TGF-β1)mRNAs表達(dá)水平以評(píng)估病情進(jìn)展和病理機(jī)制，指出兒童肺結(jié)核發(fā)病可能與Th1型免疫應(yīng)答反應(yīng)減弱相關(guān)。E.Cakir[20]等最近一項(xiàng)研究則認(rèn)為肺結(jié)核兒童BALF中人抗菌肽(LL-37/hCAP-18)和人β防御素(hBD)可能在抵抗結(jié)核分枝桿菌感染的固有免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用

4 BALF中酶的檢測(cè)與分析

腺苷脫氨酶ADA已常規(guī)作為一項(xiàng)診斷結(jié)核性胸膜炎的參考指標(biāo)，而BALF中ADA測(cè)定與分析研究不多。M.Kubota[21]納入64例研究對(duì)像，6例粟粒性肺結(jié)核、21例結(jié)節(jié)病、15例特發(fā)性肺纖維化、15例其它肺部疾病和7例健康對(duì)照。粟粒性肺結(jié)核組BALF中ADA平均值為5.02+/-3.75 IU/L，明顯高于其它各組，ADA 2.0 IU/L作為臨界值用于早期診斷粟粒性肺結(jié)核具很好的敏感性，檢測(cè)BALF-ADA有助于涂陰肺結(jié)核的診斷及與其它肺部疾病鑒別。而O.Kayacan[22]則指出單獨(dú)測(cè)定BALF-ADA在肺結(jié)核與其它肺部疾病鑒別診斷方面參考價(jià)值有限，需結(jié)合其它指標(biāo)。活動(dòng)性肺結(jié)核患者BALF中其它酶的檢測(cè)也有相關(guān)研究，但特異性與敏感性尚需進(jìn)一步研究。

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△通信作者，E-mail：lingjuncd@163.com