絨毛細(xì)胞核型分析在胚胎停育中的應(yīng)用觀察*

成志湯素環(huán)譚衛(wèi)荷佘芹陳玉鈴

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絨毛細(xì)胞核型分析在胚胎停育中的應(yīng)用觀察*

成志①湯素環(huán)①譚衛(wèi)荷①佘芹①陳玉鈴①

【摘要】目的：研究胚胎停育的原因并探討絨毛細(xì)胞核型分析在妊娠指導(dǎo)及胚胎停育中的應(yīng)用價值。方法：選取2014年1月-2015年12月本院收治的胚胎停育患者手術(shù)清宮絨毛組織標(biāo)本100例，作為研究對象。對所有無菌絨毛標(biāo)本進(jìn)行長期細(xì)胞培養(yǎng)、染色體制備與細(xì)胞核型分析，同時分析患者胚胎停育產(chǎn)生的原因，研究絨毛細(xì)胞核型在妊娠指導(dǎo)及胚胎停育中的應(yīng)用價值。結(jié)果：100例胚胎停育絨毛組織標(biāo)本經(jīng)長期細(xì)胞培養(yǎng)成功95例，培養(yǎng)成功率達(dá)95.00%，培養(yǎng)成功標(biāo)本中檢出異常核型34例，異常率為35.79%，異常核型分類中常染色體三體標(biāo)本16例（47.06%），三倍體標(biāo)本7例（20.59%），四倍體標(biāo)本3例（8.82%），嵌合體標(biāo)本3例（8.82%），性染色體單體標(biāo)本3例（8.82%），結(jié)構(gòu)異常2例（5.88%），其中常染色體三體異常檢出率明顯高于其他異常核型檢出率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；絨毛細(xì)胞核型正常標(biāo)本61例中，男性核型25例（40.98%），女性核型36例（59.02%），性別核型構(gòu)成比比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：胚胎絨毛細(xì)胞核型異常是導(dǎo)致胚胎停育的主要原因之一，并且異常核型以常染色體三體最為常見，通過分析絨毛染色體核型有助于明確患者胚胎停育的原因，可對患者下次妊娠提供合理的指導(dǎo)，具有臨床應(yīng)用及推廣價值。

【關(guān)鍵詞】絨毛細(xì)胞核型分析； 胚胎停育； 影響因素； 研究意義

①廣東省清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院 廣東 清遠(yuǎn) 511518

First-author’s address：Guangzhou Medical University Sixth Affiliated Hospital Qingyuan People’s Hospital，Qingyuan 511518，China

胚胎停育是一種臨床上較為少見的妊娠惡性結(jié)局，隨著近年來環(huán)境的惡化以及生活飲食習(xí)慣的轉(zhuǎn)變，我國胚胎停育發(fā)生率呈遞增趨勢［1］。病理生理學(xué)分析認(rèn)為胚胎停育是因多種因素如孕卵缺陷、母體不利于妊娠等復(fù)雜因素導(dǎo)致的一種妊娠早期胚胎死亡的病理性妊娠，雖然臨床上未完全明確導(dǎo)致胚胎停育的原因，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為遺傳、免疫、激素、生殖感染、內(nèi)分泌功能等因素是導(dǎo)致胚胎停育的主要原因，并且以遺傳因素最為常見，尤其是胚胎染色體異常已被廣泛認(rèn)可作為胚胎停育的主要誘發(fā)因素［2］。正常生理與遺傳性角度中，絨毛細(xì)胞作為胚胎外胚層細(xì)胞，其具有與正常胚胎組織完全相同的生物遺傳形狀，因此通過采集胚胎停育患者絨毛細(xì)胞并進(jìn)行染色體核型分析可獲取胚胎細(xì)胞的遺傳性狀，進(jìn)而直接分析遺傳因素對胚胎停育的影響［3］。本組研究采用長期細(xì)胞培養(yǎng)法，通過對100例胚胎停育絨毛細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，分析培養(yǎng)成功絨毛核型進(jìn)而研究絨毛細(xì)胞核型分析在妊娠指導(dǎo)及胚胎停育中的應(yīng)用價值?，F(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1月-2015年12月本院收治的胚胎停育患者手術(shù)清宮絨毛組織標(biāo)本100例，作為研究對象?；颊吣挲g19～41歲，平均（28.6±3.2）歲，孕周8～12周，平均（10.5±1.2）周，其中高齡妊娠13例，試管嬰兒2例，存在稽留史患者9例，雙胎妊娠4例。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者對本組研究完全知情同意，已通過本院倫理道德委員會審核；均明確為稽留流產(chǎn)；超聲檢查明確胚胎停止發(fā)育，無原始血管波動，無胚芽［4］。排除標(biāo)準(zhǔn)：精神疾病患者；性疾病患者；家族遺傳史；免疫功能異常；凝血機制障礙［5］。

1.2研究方法 所有患者均因稽留流產(chǎn)手術(shù)清宮，術(shù)中無菌采集絨毛組織5～15 mg。采用長期絨毛細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)100例絨毛細(xì)胞標(biāo)本，采用改良組織培養(yǎng)法與消化培養(yǎng)法共同培養(yǎng)。（1）改良組織培養(yǎng)法：首先將絨毛組織取出后放置于無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿中，采用注射器抽取5 mL生理鹽水沖洗絨毛并將絨毛粘連的血凝塊及其他雜志徹底清除，采用無菌眼科剪修剪絨毛支，以分芽多，末端粗鈍呈仙人掌狀或鹿角狀的絨毛為最佳，后采用無菌手術(shù)刀片切碎絨毛組織，切碎后組織塊大小以能被5 mL注射器吸取為宜，5 mL GIBC羊水培養(yǎng)液注入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，采用巴斯德吸管吸取含有細(xì)小絨毛組織碎塊的培養(yǎng)液移入培養(yǎng)瓶中，每次培養(yǎng)2瓶，將處理后的絨毛組織培養(yǎng)瓶置5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后觀察是否存在絨毛組織細(xì)胞在培養(yǎng)瓶的底部發(fā)生貼壁生長，當(dāng)發(fā)現(xiàn)存在有梭形和圓形細(xì)胞時，可更換絨毛細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。（2）消化培養(yǎng)法：將絨毛組織從試管中取出，置放于無菌培養(yǎng)皿中，用注射器抽取5 mL生理鹽水，洗滌絨毛，去除肉眼可見的血液凝塊和雜質(zhì)，用無菌剪刀剪下絨毛枝，一般以分芽多，末端粗鈍呈仙人掌狀或鹿角狀的絨毛為最佳，用無菌剪刀把絨毛組織剪碎，加入生理鹽水5 mL，用巴斯德吸管吸取含有細(xì)小絨毛組織碎塊的生理鹽水放入15 mL無菌離心管中，1800轉(zhuǎn)離心10 min，吸去上清，加入1 mL膠原酶和1 mL胰酶，吹打60～80次，放入培養(yǎng)箱中消化10 min左右，取出加入1 mL小牛血清，吹打均勻，終止消化，1800轉(zhuǎn)離心10 min鐘，棄上清，加入10 mL GIBCO羊水培養(yǎng)液，接種于兩個細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)7 d，觀察有梭形和圓形細(xì)胞時，換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。（3）培養(yǎng)瓶內(nèi)換液后見絨毛細(xì)胞上皮樣或成纖維樣細(xì)胞生長良好，出現(xiàn)的圓形細(xì)胞數(shù)量較多就可以收獲細(xì)胞。收獲細(xì)胞前需向培養(yǎng)瓶中加如秋水仙素3滴，并放置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h，取出培養(yǎng)瓶并把培養(yǎng)液倒入離心管中，在每個培養(yǎng)瓶中加入2 mL 37℃預(yù)溫EDTA-胰酶，置于37 ℃水浴箱中6～8 min，加入原保留的培養(yǎng)液終止消化，將離心管進(jìn)行高速離心處理，抽取并移除離心管中上清液，向離心管匯總加入4 mL已預(yù)溫到37 ℃的低滲液，置于水浴箱中低滲處理10 min，加入1 mL 3∶1的甲醇與冰醋酸固定液預(yù)固定1次，離心后棄上清再固定兩次，在冰片上滴片，75 ℃烤片3 h，胰酶顯帶，Gimsa染色，鏡下觀察并計數(shù)20個分裂相，配對分析5個核型，發(fā)現(xiàn)嵌合則加大計數(shù)量至100個細(xì)胞。

1.3觀察指標(biāo) 記錄培養(yǎng)成功標(biāo)本數(shù)，并統(tǒng)計分析培養(yǎng)成功標(biāo)本的絨毛細(xì)胞核型，根據(jù)是否異常進(jìn)行分組，異常核型分析染色體異常類型，正常核型分析胚胎性別，采用統(tǒng)計學(xué)處理分析胚胎停育常見絨毛細(xì)胞異常核型及正常核型性別差異。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用 X2檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1絨毛細(xì)胞長期培養(yǎng)結(jié)果 100例胚胎停育絨毛組織標(biāo)本經(jīng)長期細(xì)胞培養(yǎng)成功95例，培養(yǎng)成功率達(dá)95.00%，培養(yǎng)成功標(biāo)本中檢出異常核型34例，異常率為35.79%，檢出正常核型61例，正常率為64.21%。

2.2絨毛細(xì)胞異常核型類型分析 對絨毛細(xì)胞異常核型檢出的34例標(biāo)本進(jìn)行染色體異常類型分析可知，常染色體三體異常檢出率為47.06%（16/34），明顯高于三倍體的20.59%（7/34）、四倍體8.82% （3/34）、嵌合體8.82%（3/34）、性染色體單體8.82% （3/34）及結(jié)構(gòu)異常5.88%（2/34）等類型檢出率，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3絨毛細(xì)胞正常核型性別分析 分析絨毛細(xì)胞正常核型檢出的61例性別構(gòu)成情況可知，絨毛細(xì)胞正常核型女性核型構(gòu)成比為59.02%（36/61），明顯高于男性核型的40.98%（25/61），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（X2=3.169，P=0.032）。

3　討論

胚胎停育是一種妊娠早期胚胎死亡的病理性妊娠，常作為一種惡性的女性妊娠結(jié)局被臨床所重視［6］。目前臨床通過實驗研究認(rèn)為導(dǎo)致胚胎停育的主要因素為遺傳因素、免疫因素、環(huán)境因素與內(nèi)分泌因素，其中遺傳因素是導(dǎo)致胚胎停育的主要因素，有關(guān)調(diào)查結(jié)果顯示胚胎停育中50%～60%的患者因胎兒染色體異常所致，而有研究表明因遺傳因素導(dǎo)致的胚胎停育不僅影響本次妊娠結(jié)局，同時可對患者下次或以后的妊娠均產(chǎn)生不同程度的影響，因此明確胚胎停育的原因及有效的干預(yù)對指導(dǎo)下次合理妊娠具有重要意義［7］。

本組研究結(jié)果顯示，95例培養(yǎng)成功的絨毛細(xì)胞標(biāo)本中有34例標(biāo)本檢出絨毛細(xì)胞核型異常，檢出異常率達(dá)35.79%，同時對于核型異常類型的分析結(jié)果顯示，常染色體三體異常檢出率明顯高于三倍體、四倍體、嵌合體、性染色體單體、結(jié)構(gòu)異常檢出率；而在核型正常的61例絨毛細(xì)胞標(biāo)本中，女性核型標(biāo)本構(gòu)成比明顯高于男性核型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。本組研究結(jié)果表明絨毛細(xì)胞核型異常是導(dǎo)致胚胎停育的主要原因，并且異常核型中以常染色體三體異常最為常見，而在正常核型胚胎性別分析中女性胎兒較男性胎兒更易發(fā)生胚胎停育。

通過實驗回顧分析可知，絨毛組織是人類受精卵正常發(fā)育過程中的胎盤附屬物，其與正常胚胎具有高度相同的生物遺傳性，即絨毛組織的染色體結(jié)構(gòu)與胎兒的染色體結(jié)構(gòu)、生物遺傳特性等基本一致，并且絨毛組織具有較強的細(xì)胞分裂能力，通過手術(shù)采集絨毛細(xì)胞后可通過相應(yīng)的體外培養(yǎng)手段獲取足夠的處于分裂中期的絨毛細(xì)胞，進(jìn)而通過分析培養(yǎng)后的絨毛細(xì)胞進(jìn)行胚胎遺傳學(xué)研究［8］。

在本組研究中采用的是長期絨毛細(xì)胞培養(yǎng)法，目前臨床上對于絨毛細(xì)胞染色體等遺傳學(xué)分析常用的細(xì)胞培養(yǎng)法有直接培養(yǎng)法與長期培養(yǎng)法，傳統(tǒng)的直接培養(yǎng)法具有方便、快捷、便宜、易操作的應(yīng)用特點，對于培養(yǎng)條件及實驗室水平的要求并不高，適用于基層醫(yī)院推廣應(yīng)用，但直接絨毛細(xì)胞培養(yǎng)法無法直接獲取中期絨毛細(xì)胞染色體分裂象，同時絨毛細(xì)胞培養(yǎng)成功率較低［9］。而長期細(xì)胞培養(yǎng)法是一種培養(yǎng)時間較長、培養(yǎng)過程較為復(fù)雜的絨毛細(xì)胞培養(yǎng)法，主要通過組織塊培養(yǎng)與消化培養(yǎng)法獲取中期絨毛細(xì)胞染色體分裂相，但長期絨毛細(xì)胞培養(yǎng)法對實驗室條件、儀器要求較為嚴(yán)格，培養(yǎng)條件苛刻，操作步驟較為復(fù)雜，培養(yǎng)周期較長且培養(yǎng)費用較為昂貴，但由于其可獲取中期絨毛細(xì)胞及較高的成功率而被臨床所重視［10-11］。目前國外常規(guī)產(chǎn)前診斷技術(shù)已經(jīng)包括絨毛細(xì)胞染色體的長期培養(yǎng)，但在我國僅有部分儀器較為先進(jìn)、實力較強的產(chǎn)前診斷中心才可進(jìn)行絨毛細(xì)胞的長期培養(yǎng)將其作為常規(guī)的產(chǎn)前診斷技術(shù)，而一般的醫(yī)院對產(chǎn)婦進(jìn)行產(chǎn)前檢查主要依賴于對絨毛細(xì)胞的直接分析或采用直接法進(jìn)行培養(yǎng)［12］。

研究結(jié)果顯示，絨毛細(xì)胞染色體的長期培養(yǎng)及染色體性狀分析，對于胚胎停育標(biāo)本絨毛細(xì)胞遺傳物質(zhì)，即染色體核型的鑒別與診斷中具有較高的臨床應(yīng)用價值。在本組研究中的100例胚胎停育絨毛細(xì)胞標(biāo)本中，采用長期培養(yǎng)法成功培養(yǎng)95例，培養(yǎng)成功率達(dá)95.00%，表明采用長期培養(yǎng)法，包括改良組織塊培養(yǎng)法以及消化培養(yǎng)法，能夠建立一種培養(yǎng)結(jié)果更為穩(wěn)定，培養(yǎng)成功率更高，操作更為簡便的絨毛組織細(xì)胞染色體檢查方法，能夠縮短長期培養(yǎng)法的培養(yǎng)周期，并且保障絨毛細(xì)胞中期分裂相的培養(yǎng)成功率，可為臨床診治提供可靠的實驗依據(jù)，以便對類似患者妊娠進(jìn)行遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷和及時適當(dāng)處理［13］。而對于絨毛細(xì)胞異常核型構(gòu)成分析結(jié)果顯示，絨毛細(xì)胞常染色體三體異常核型最為常見，通過實驗回顧分析認(rèn)為，在正常遺傳物質(zhì)染色體異常中，主要的表現(xiàn)形式為移位、倒置、斷裂等結(jié)構(gòu)異常以及單倍體、三倍體及多倍體等數(shù)目的異常，而在胚胎停育中染色體數(shù)目異常是主要的絨毛細(xì)胞異常核型類型，其中又以常染色體三體異常最為常見，分析其原因認(rèn)為正常胚胎在性細(xì)胞成熟的過程中，以及受精卵的早期卵裂過程中，由于多種遺傳因素導(dǎo)致胚胎染色體未發(fā)生正常的分離，進(jìn)而導(dǎo)致染色體數(shù)目的異常，而染色體增多一條或增多兩條等等便可導(dǎo)致染色體三體、三倍體、四倍體等數(shù)目異常的發(fā)生［14-15］。而對于正常絨毛細(xì)胞核型胚胎停育標(biāo)本中，性別比例的差異表明女性胚胎更易發(fā)生胚胎停育，這可能與性染色體的遺傳性狀有關(guān)，同時有學(xué)者認(rèn)為，正常絨毛細(xì)胞核型表明胚胎遺傳性狀的正常，可初步排除遺傳因素對胚胎停育的影響，因此對于絨毛細(xì)胞核型正常的胚胎停育患者應(yīng)積極查找其他因素，通過對患者進(jìn)行多方面的檢查明確是否因內(nèi)分泌、環(huán)境、免疫等方面的影響因素導(dǎo)致胚胎停育，進(jìn)而在下次或以后的妊娠中避免這些影響因素［16］。

本組研究也直接表明，產(chǎn)前檢查中行絨毛細(xì)胞培養(yǎng)及遺傳學(xué)細(xì)胞核型分析對保證妊娠安全的重要作用，通過絨毛細(xì)胞培養(yǎng)及絨毛細(xì)胞核型分析可判斷胚胎染色體是否發(fā)生異常，對于發(fā)生異常的絨毛細(xì)胞核型，進(jìn)一步分析其絨毛細(xì)胞核型異常類型，重點警惕絨毛細(xì)胞染色體數(shù)目異常，尤其是常染色體三體異常絨毛細(xì)胞，其胚胎停育發(fā)生率較高，應(yīng)及時給予患者干預(yù)或終止妊娠，以免發(fā)生惡性妊娠結(jié)局并且對下一次妊娠需接受產(chǎn)前診斷明確胚胎是否存在染色體異常。對于已發(fā)生胚胎停育的患者，若檢出絨毛細(xì)胞異常核型應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的患者遺傳學(xué)分析，明確導(dǎo)致絨毛細(xì)胞核型即胚胎核型異常的原因，及時治療干預(yù)，避免再次妊娠時患者發(fā)生胚胎停育；正常絨毛細(xì)胞胚胎停育的患者則需通過免疫因素、內(nèi)分泌因素、環(huán)境因素等進(jìn)行多方面分析，明確導(dǎo)致胚胎停育的非遺傳影響因素，進(jìn)而通過針對性干預(yù)措施降低再次妊娠的胚胎停育發(fā)生率［17-20］。

綜上所述，胚胎絨毛細(xì)胞核型異常是導(dǎo)致胚胎停育的主要原因之一，并且異常核型以常染色體三體最為常見，通過分析絨毛染色體核型有助于明確患者胚胎停育的原因，可對患者下次妊娠提供合理的指導(dǎo)，具有臨床應(yīng)用及推廣價值。

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Application Observation of Hair Cells Karyotype Analysis in the Embryo Damage

CHENG Zhi，TANG Su-huan，TAN Wei-he，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（11）：129-132

【Abstract】Objective：To study the reasons of embryo damage and discuss the application value of hair cells karyotype in the embryo damage and pregnancy guidance.Method：From January 2014 to December 2015，100 cases of embryo damage patients’ curettage villi tissue samples，which admitted in our hospital were selected as the research objects.All sterile villi samples were given the long-term cell culture，chromosome preparation and karyotype analysis.The cause of patients with embryo damage was analyzed at the same time.The application value of hair cells karyotype analysis in the embryo damage and pregnancy guidance was analyzed.Result：A total of 100 cases of embryonic damage villi tissue samples by cell culture for a long time，95 cases of success，the success rate was 95.00%.Development successful specimens’ detected abnormal karyotype in 34 cases，the abnormal rate was 35.79%，in the abnormal karyotype classification，triplox specimens 16 cases （47.06%），triploid specimens 7 cases （20.59%），tetraploid specimens 3 cases （8.82%），chimeric specimens 3 cases （8.82%），sex chromosome single specimens 3 cases （8.82%），abnormal structure 2 cases （5.88%）.Abnormal autosomal triplox detection rate was much higher than other abnormal karyotype detection rate，the difference was significant statistically significant （P＜0.05）.For the 61 cases hair cells karyotype normal specimens，the male karyotype 25 cases （40.98%），female karyotype 36 cases （59.02%），sex karyotype composition had more significant differences，the difference was significant statistically significant （P＜0.05）.Conclusion：Embryo villus cell abnormal karyotype is one of the main cause of the embryonic damage，and abnormal karyotype autosomal triplox is the most common，through the analysis of hair cells karyotype will help to clear the reason of embryonic damage patients，which can provide reasonable guidance on the next pregnancy patients and has clinical application and popularization value.

【Key words】Hair cells karyotype analysis； Embryo damage； Influencing factors； Research significance

*基金項目：清遠(yuǎn)市科技計劃項目（00161751320722022）

通信作者：成志

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.037

收稿日期：（2016-01-10） （本文編輯：蔡元元）