粘果山羊草及其祖先種的染色體原位雜交研究

黃阜峰

（湖北師范大學生命科學院，湖北黃石 435002）

粘果山羊草及其祖先種的染色體原位雜交研究

黃阜峰

（湖北師范大學生命科學院，湖北黃石 435002）

利用人工合成的（AAG）5寡集核苷作為探針，對異原多倍體－粘果山羊草Ae．kotschyi（SKUK）及其祖先種小傘Ae．umbellulata（U）和沙融山羊草Ae．sharonensis（S）的中期染色體進行了原位雜交研究。揭示出了粘果山羊草（SKUK）與其祖先種小傘（U）和沙融（S），集中成簇分布的寡集核苷序列在其基因組中的總量和分布位點有著明顯差異。SkUk基因組中集中成簇分布的AAG序列的總量和位點數量多，分布區(qū)域廣泛，每對染色體上均有2個以上的分布位點（多的可達5），分布于染色體的近著絲粒區(qū)域、長臂、短臂或端粒。而S或U基因組中集中成簇分布的AAG序列的總量和位點數量少，分布區(qū)域窄，平均每條染色體不到一個，主要分布于近著絲粒區(qū)域或短臂，部分染色體沒有。并結合已有的文獻報道，探討了AAG序列在粘果山羊草和其祖先種小傘和沙融基因組中的變異與進化的關系。

異源多倍體；粘果山羊草；SSRs；FISH；基因組變異

山羊草屬的多倍體是由少數幾個同屬的2倍體物種雜交加倍而形成的異源多倍體，它們的多倍體基因組來源的祖先種譜系基本清楚，且雜交組合多樣，種類豐富［1］。因此是研究多倍體進化的很好的材料。新近的研究表明，在多倍體形成過程中，兩個異質的基因組進入一個（僅含有兩親本之一的細胞質）核中，不再單獨進化，而是共同進化，且導致基因組的迅速改變和后生改變［2］。這些改變包括在基因組內和基因組間的染色體交換、大片段DNA的轉移［3］、基因的突變和消除［4］、基因的甲基化沉默［5］。然而對由重復序列的改變而引起的山羊草多倍體化后染色體結構的改變研究得很少。

FISH技術是研究異源多倍體的起源，以及與進化相聯系的染色體結構變化的一個有用的工具［6］。除類似于轉座子，彌散地分布整個基因組的高度重復系列不適合作為染色體的標記外，rRNA基因，個別的重復系列克隆可用于山羊草多倍體的染色體結構的改變的研究［7］。例如：rRNA基因的原位雜交表明山羊草多倍體和它的祖先種在經歷的長時間的平行進化后，在多倍體中5SRNA基因個數比期望數減少，大小發(fā)生變化，以及出現在染色體上的位置也有改變［8］。然而，利用簡單重復序列的原位雜交比較山羊草多倍體和它的祖先中的染色體結構變異及它們的平行進化關系，未見報道。

簡單重復序列（SSRs）由大約1～6核苷的短的重復單元組成。據報道，少數SSRs彌散地散布于整個基因組，是遺傳基因作圖的分子標記。而多數SSRs集聚成簇出現在染色體上，構成染色體的高度有序的結構，并具有基因組和染色體組織的特異性。其中的AAG在基因組中成簇出現的概率最大，廣泛分布于著絲?；蛉旧w中部，是應用原位雜交技術研究染色體結構的有用序列［9］［10］。

粘果山羊草是由小傘和沙融雜交而形成的異源多倍體［1］。本研究擬應用人工合成的寡聚核苷，（AAG）5這個SSR重復系列作為探針，通過原位雜交著色粘果山羊草及其祖先種小傘和沙融的染色體。選擇用AAG作為探針是因為它們在麥類基因組中含量豐富，且成簇分布，通過原位雜交能得到圖案豐富的雜交圖譜，提供大量的有關染色體結構的信息［10］。我們的目標是通過原位雜交得到三個種的FISH圖譜，識別染色體，了解AAG高度重復序列在基因組中的分布，比較粘果山羊與祖先種小傘，沙融的染色體結構的差異，進而研究基因組的進化及與SSRs的關系。

1 材料

1．1 粘果Ae．kotschyi Boiss、小傘Ae．umbellulata Zhuk、沙融山羊草Ae．sharonensis種子由中國農業(yè)科學院作物資源研究所提供。

1．2 探針（AAG）5由Sigma公司合成

2 方法

2．1 制備中期染色體標本

種子25℃催芽48h，切取根尖加入0．2%的秋水仙素，4℃處理24h，卡諾氏固定液固定，酶解，火焰干燥法制備中期染色體標本。

2．2 原位雜交方法

染色體原位雜交實驗按Li等［11］的方法并略作修改，每一張片子40μL雜交液，內含50%的去離子甲酰胺（Sigma），10%的硫酸葡聚糖（Sigma），100ng／μL鮭魚精子ssDNA（Sigma），2× SSC，蓋片用22mm×22mm的蓋玻片，90℃共變性3min，放保濕皿中37℃雜交過夜。

2．3 信號檢測

染色體原位雜交信號的檢測與洗脫仍然按Li等［11］的方法。雜交后的載玻片用2×SSC在常溫洗10min，37℃洗10min，再用1×PBS常溫洗一次，然后進行檢測。地高辛標記的探針第一步反應加入羊抗地高辛抗體（anti－di－goxigenin－FITC，Roche），37℃溫育30min后再用1×PBS常溫洗3次，每次5min，第二步信號放大反應加入兔抗羊地高辛偶聯物（rabbit anti－sheep－FITC，Roche），溫育和洗脫同第一步。

2．4 圖像檢測及分析

染色體載片使用5μL／mL DAPI（4′，6－diamidino－2－phenylindole）復染，再加抗淬滅劑，用O－lympus BX60型熒光顯微鏡觀察雜交信號，Photometrics SenSys CCD1400E攝影裝置和Metamorph4．6．3軟件獲得圖像，Photoshop10．1．1軟件進行圖片處理。染色體分析，應用AAG探針雜交得到的染色體信號帶，結合rRNA基因和重復序列的原位雜交數據，識別粘果山羊草的二個基因組（SKUK）的染色體及小傘、沙融的染色體。

圖1 （AAG）5探針熒光原位雜交染色體圖，A粘果山羊草，B沙融山羊草，C小傘山羊草

3 結果與分析

3．1 原位雜交結果

利用Dig－dUTP標記的工人合成的寡聚核苷（AAG）5探針分別對粘果山羊草及其祖先種—小傘、沙融山羊草的中期染色體進行了熒光原位雜交，同時利用DAPI著色染色體，藍色為染色體，綠色的為染色體上的雜交信號。結果如（圖1）所示，三個種的基因組的幾乎所有染色體上均有雜交信號，明亮大斑點信號，主要分布在染色體的著絲粘區(qū)域，其次部分染色體的長短臂中部，也有幾個出現在染色體的端粒。這與A．Cuadrado研究禾木科植物的SSR高度重復系列，成片集中分布于染色體的著絲粒的結果基本一致［9］。也有不一致的地方，如沙融山羊草，除著絲粒大信號斑處，每條染色體的其它區(qū)域也彌散地分布著眾多的小信號斑點。

3．2 核型分析

作者應用核型分析比較了粘果山羊草及其祖先種——小傘，沙融山羊草SSR分布的特征（圖2）。

圖2 核型圖，上排左沙融山羊草（S基因組），上排右小傘山羊草（U基因組），下排左粘果山羊草（Sk基因組）下排右粘果山羊草（Uk基因組）

粘果山羊草的Sk基因組：①著絲粒部位，5對染色體的著絲粒有強烈的雜交信號（SK1，SK2，SK4，SK5，SK7），一對染色體著絲粒有較強的雜交信號（SK3），一對染色體無著絲粒信號，②染色體長短臂中部，5對染色體（SK1LR，SK2L，SK4LR，SK5LR，SK6LR）較強的信號，2對染色體具較弱的雜交信號（SK3LR，SK7L）。③端粒部位，6對染色體具（SK1L，SK2L，SK3L，SK4L，SK5L，SK6R）較強的信號。表明SSR序列主要集中分布于著絲粒，其次分布于長臂中部，也會出現在端粒。

粘果山羊草的Uk基因組：①著絲粒部位，4對染色體有強烈的信號（UK2，UK3，UK4，UK5），1對染色體較強的信號（UK7），2對染色體較弱的信號，②染色體長短臂中部，3對染色體具有強烈信號（UK3R，UK4LR，UK5LR），4對具有較強或弱的信號（UK1L，UK2LR，UK6L，UK7L）。③端粒部位，5對染色體具端粒信號都較弱（UK1L，UK2LR，UK3L，UK5L，UK6L，UK7LR）。表明所有染色體的著絲粒，中部，端粒部位，都具有成片集中分布的SSR序列，但集中程度，拷貝數量有所不同。

沙融山羊草的S基因組：①著絲粒部位，1對染色體具明亮信號（S2），3對染色體具有較弱信號（S1，S3，S6），其它未見信號。②染色體長短臂中部，僅4對染色體見到較弱的信號（S1R，S2LR，S4LR，S7R）。③端粒部位，未見端粒信號。表明在整個S基因組有成片集中分布的SSRs序列，但數量較少，位點也少。

小傘山羊草的U基因組：①著絲粒部位，3對染色體具有較強信號（U2，U4，U5），4對染色體具有較弱信號（U1，U3，U6，U7），②染色體長短臂中部，2對染色體具有較強信號（U3L，U5R），③端粒部位，2對染色體具有較強信號（U3L，U4L）。表明U基因組，具有較豐富的SSRs序列，出現的位點也較多。

4 討論

植物基因組中存在著大量的豐富的AAG基序的簡單重復序列，關于這一點是沒有疑問的。然而關于三核苷基序的簡單重復序列在基因組中的分布存在著分歧。據已測序的物種的序列對比和其它物種的EST數據，三核苷基序的簡單重復序列以200－300bp的長度主要隨機地散布于基因組的編碼區(qū)。然而，從我們研究的三個山羊草物種小傘、沙融、粘果的染色體的FISH結果來看，三個山羊草物種的染色體上有著豐富的，大量的、多態(tài)的、大的信號斑。而植物FISH技術要求目標片段的長度在10kb左右［12］，才會有可探測到的雜交信號。據此推斷這些區(qū)域中有大量的長的串連重復的AAG序列，或者染色體的三維結構上集中排列了大量的AAG序列。揭示了一些長的、大的AGG重復序列非隨機地分布于特定區(qū)域，表現出基因組的特異性。這個結果與研究大麥、小麥得到的結果是一致的［10］，而與EST的結果相反。

小傘、沙融的AAG原位雜交信號主要分布于近著絲粒區(qū)域，粘果的原位雜交信號分布于近著絲粒／著絲?；蜷L短臂中間，或近端粒／端粒。與小傘、沙融、粘果山羊草染色體的C－帶或N－帶的分布區(qū)域部分重疊［13］，揭示AAG與異染色質有關。

粘果山羊草是由小傘和沙融山羊草雜交后多倍化而形成的一個異源四倍體物種。FISH結果表明S、U基因組和SkUk基因組的雜交信號的大小、數量及在染色體上的分布圖案存在著廣泛的差異，揭示出粘果山羊草與它的祖先種小傘和沙融、山羊草基因組的進化是不同步的。

比較S、U和SK、UK基因組的雜交圖案可以看出，S基因組除2S染色體有一個明亮的著絲粒信號斑外，其它染色體有一個較暗、較小的（或偶有兩信號）分布染色的近著絲粒／著絲?；蚨瘫凵?。然而SK基因組，每條染色體都有多條（最多達5條）明亮的信號，分布于近著絲粒／著絲?；蜷L短臂中間，或近端粒／端粒。這一結果揭示了粘果山羊草（SK和Uk）基因組的成簇的串聯的長的AAG相對于祖先種－沙融山羊草U基因組和小傘的U基因組的分布區(qū)域擴大，出現了眾多新的分布位點。暗示SK和UK基因組都被大量的修改，這與SK的18－26srDNA的研究結果相一致，而與Uk的結果相反［13］。

同樣，比較粘果山羊草和它的祖先種小傘和沙融的雜交信號的數量和信號斑點的大小，發(fā)現，粘果山羊草的S基因組的大的雜交信號明顯比沙融的S基因組要多。多數斑點也較大，這揭示了粘果山羊草基因組（SkUk）集中成簇連綿分布的三核苷基序的SSR的數量比其祖先種小傘U和沙融S明顯要多很多。這似乎指向異源多倍體經歷了雜交加倍初期的基因組的劇烈變化和后生變化，三核苷基序的SSR在基因組中被大量的擴增。

我們還能發(fā)現一個有意思的現象就是用AAG探針與沙融山羊草與中期染色體雜交，發(fā)現除觀察到少數幾個大的信號斑外，還觀察到了為數眾多的小的且清晰可見的信號斑點，散布于所有染色體的長、短臂上，而在S基因組中沒有觀察到。揭示出存在于S基因組的較小的成簇分布的AAG序列在SK基因中消失了。

新近研究人工合成的沙融×小傘的結果證實，多倍體的基因組是非加性的，存在著DNA序列轉移，消除和COPY數量的變化，同時研究者也發(fā)現那些人工合成的異源多倍體在基因組組成上與自然生成的異源多倍體較為相似，而發(fā)生基因組整合的方向也是一致的［4］。我們的研究結果也佐證了這一觀點，粘果山羊草（SK、UK）的信號斑點大，且較明亮，以及AAG與沙融雜交的彌散分布于整個基因組的小的信號斑點，在Sk基因組的雜交中消失。揭示出自然形成的異源多倍體的一些DNA序列消除。而且在SK、UK中大的雜交信號斑點的數量增多，位置的多態(tài)性增加，同樣揭示了序列的轉移和擴增。

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FISH study of chromosome for Ae．kotschyi and its ancestral species HUANG Fu－feng

（College of Life Sciences，Hubei Normal University，Huangshi 435002，China）

In this paper，the use of a synthetic oligonucleotides of the（AAG）5Set nucleoside as probes for allopolyploid－Ae．kotschyi（SKUK）and its ancestral species－Ae．umbellulata rundlet（U）and Ae．sharonensis sand melt goat grass（S）of metaphase chromosomes in situ hybridization studies．Reveals Ae．kotschyi（SKUK）and its ancestral species umbrella（U）and sand melt（S），focused on two oligonucleotide sets nucleotide sequences clustered distribution of the total amount and distribution sites in its genome in a significant difference．SkUkgenome more concentrated in clusters and the total number of sites distributed AAG sequences，widely distributed areas，each chromosome pair has two more distribution sites，（and more up to 5），located in chromosome near the centromere region，long arm，short arm or telomeres．While the total number of sites and S or U genome centralized cluster distribution AAG sequences less narrow distribution area，an average of less than one per chromosome，（not part of the chromosome），mainly in the area near the centromere or short arm．And combined with the existing literature on the relationship between the evolution of the genome sequence of SSR were discussed．

allopolyploid；Ae．kotschyi；SSRs；FISH；genome evolution

Q－343

A

1009－2714（2016）04－0006－05

10．3969／j．issn．1009－2714．2016．04．002

2016—04—20

黃阜峰（1962— ），男，副教授，主要研究方向為細胞遺傳學．