閉環(huán)式電刺激抑制癇樣棘波發(fā)放的機(jī)制研究

曹嘉悅 封洲燕 郭哲杉 胡振華 胡 娜

(浙江大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310027)

閉環(huán)式電刺激抑制癇樣棘波發(fā)放的機(jī)制研究

曹嘉悅 封洲燕*郭哲杉 胡振華 胡 娜

(浙江大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310027)

腦深部刺激(DBS)在臨床癲癇病的治療中備受關(guān)注，可能替代癲癇病灶的切除手術(shù)。但是，癲癇的發(fā)作機(jī)制多種多樣，需要針對(duì)性地設(shè)計(jì)DBS的刺激模式和參數(shù)，才能獲得較好的療效。對(duì)于γ-氨基丁酸受體的拮抗劑印防己毒素在麻醉大鼠海馬CA1區(qū)誘導(dǎo)的癇樣發(fā)放，采用短促的高頻刺激(HFS)脈沖串；并利用閉環(huán)式的刺激模式，在各個(gè)爆發(fā)式發(fā)放期間，將脈沖串施加于CA1區(qū)的傳入軸突束Schaffer側(cè)支。9只大鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，100 Hz以上的0.3 s時(shí)長HFS可以抑制Burst中60%～70%的棘波發(fā)放。而且，在HFS抑制棘波發(fā)放期間，CA1區(qū)神經(jīng)元不能響應(yīng)其傳出軸突束上施加的逆向刺激脈沖的激勵(lì)作用，表明在此期間神經(jīng)元失去了產(chǎn)生動(dòng)作電位的能力。由此可以推測(cè)，HFS抑制棘波發(fā)放的機(jī)制可能是神經(jīng)元細(xì)胞膜發(fā)生了去極化阻滯。該研究的發(fā)現(xiàn)對(duì)于開發(fā)DBS治療癲癇的閉環(huán)刺激新模式具有重要的指導(dǎo)意義。

腦深部刺激；閉環(huán)；癲癇；印防己毒素；去極化阻滯

引言

癲癇是一類常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，患病人數(shù)約占世界人口的1%；它會(huì)嚴(yán)重影響患者的日常生活，但在治療上還存在許多困難[1]。目前癲癇的常用治療手段包括藥物控制和手術(shù)切除病灶；但是，患者中約有20%～30%屬于難治性癲癇，藥物治療效果不理想。有些患者病灶在重要腦區(qū)，也不適合手術(shù)切除，否則可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后遺癥[2]。因此，迫切地需要開發(fā)新型的有效的癲癇治療手段。鑒于腦深部刺激(deep brain stimulation，DBS)在帕金森氏癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的成功應(yīng)用，它在癲癇的控制和治療中也展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[3-4]。

目前，關(guān)于DBS抑制癲癇的作用機(jī)制尚無定論，已有的假說主要認(rèn)為電脈沖刺激可能對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生抑制作用或者產(chǎn)生去極化阻滯作用[5-6]。其中，抑制作用的產(chǎn)生原因可能是神經(jīng)元興奮性突觸后電位的減小或者抑制性突觸后電位的增大。其誘因可能是刺激引起興奮性突觸傳導(dǎo)阻滯[7]，或者是刺激增強(qiáng)了抑制回路的功能[8-9]。而去極化阻滯是指神經(jīng)元過度興奮導(dǎo)致細(xì)胞膜處于持續(xù)的去極化狀態(tài)，使離子通道失活，無法產(chǎn)生動(dòng)作電位。已有研究表明，DBS所采用的高頻刺激可以引起軸突或者神經(jīng)元胞體的去極化阻滯[6,10-12]。鑒于癲癇有多種不同的發(fā)生機(jī)理，可以推測(cè)，針對(duì)不同的癇樣發(fā)放模式，可能利用DBS的不同機(jī)制來控制癇樣活動(dòng)。

臨床上，根據(jù)腦電圖的表現(xiàn)，癇樣發(fā)放可以分為發(fā)作期(ictal)和發(fā)作間期(interictal)兩大類。其中，發(fā)作期由連續(xù)的爆發(fā)式發(fā)放(burst)組成，而每個(gè)Burst又由棘波串組成。棘波是神經(jīng)元群體同步發(fā)放動(dòng)作電位的表現(xiàn)，是癲癇腦電的特征波，連續(xù)的棘波發(fā)放預(yù)示著嚴(yán)重的癲癇發(fā)作，會(huì)導(dǎo)致腦功能障礙或者肌陣攣等癥狀[13]。因此，抑制發(fā)作期的棘波發(fā)放是重要的癲癇病防治目標(biāo)。為了考察高頻脈沖電刺激是否能夠抑制發(fā)作期的癇樣發(fā)放，在麻醉大鼠海馬阿蒙氏角(cornu ammonis，CA)的CA1區(qū)，使用抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸的拮抗劑印防己毒素(picrotoxin，PTX)制作急性癲癇模型。另外，針對(duì)發(fā)作期的Burst發(fā)放設(shè)計(jì)了一種閉環(huán)式的高頻脈沖串刺激，使用小于1 s的短促刺激來控制Burst的棘波發(fā)放，考察抑制效果，并研究其中的機(jī)制。

上述研究結(jié)果對(duì)于開發(fā)DBS治療癲癇的新刺激模式、深入揭示DBS的作用機(jī)制以及促進(jìn)其臨床應(yīng)用等，都具有重要的意義。

1 方法

1.1 動(dòng)物手術(shù)、信號(hào)記錄和電刺激的實(shí)施

成年雄性Sprague-Dawley大鼠9只(300～400 g，購于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，使用1.25 g/kg烏拉坦腹腔注射麻醉后，固定于大鼠腦立體定位儀上。切開鼻端皮膚，在鼻骨上鉆兩個(gè)小孔，將參考電極和接地電極通過兩個(gè)不銹鋼螺釘分別固定于鼻骨。切開頭部皮膚，除去部分顱骨，將記錄電極植入到海馬CA1區(qū)，定位為前囟后3.5 mm，旁開2.6 mm，大腦皮層表面向下2.0～2.3 mm(如圖 1所示)。所使用的記錄電極為16通道的微電極陣列(NeuroNexus Technologies)。植入時(shí)，逐漸推進(jìn)記錄電極，直到記錄到海馬CA1區(qū)發(fā)放的神經(jīng)元單元鋒電位為止。然后，將2根刺激電極植入到同側(cè)海馬CA1區(qū)。其中一根植入到CA1區(qū)的Schaffer側(cè)支(即錐體細(xì)胞的傳入通路)，定位為前囟后2.8～3.0 mm，旁開2.0 mm，深度約2.8 mm，用于順向(orthodromic，也稱正向)興奮CA1區(qū)錐體細(xì)胞。另一根則植入到海馬白質(zhì)(alveus，即錐體細(xì)胞的傳出通路)，定位為前囟后4.8 mm，旁開2.7 mm，深度2.0～2.3 mm，用于逆向(antidromic，也稱反向)興奮CA1區(qū)錐體細(xì)胞。使用的刺激電極為美國FHC公司生產(chǎn)的雙極同心電極(FHC Inc. USA)。根據(jù)兩根刺激電極上施加的脈沖刺激在CA1區(qū)不同深度誘發(fā)的突觸電位和群峰電位的波形，微調(diào)刺激電極和記錄電極的植入深度，直到最終達(dá)到正確的位置[14]。

圖1 記錄電極和刺激電極在海馬CA1區(qū)的植入位置Fig.1 Schematic diagram of the placements of the recording electrode and the stimulation electrodes

記錄電極采集到的神經(jīng)電信號(hào)首先通過3600型16通道放大器(A-M Systems Inc.)放大100倍(頻率范圍設(shè)為0.3～5 000 Hz)；再通過PowerLab采集系統(tǒng)(AD Instruments Inc.)以20 kHz的采樣頻率進(jìn)行采樣；之后將記錄數(shù)據(jù)存入硬盤，用于離線分析。下面將此記錄信號(hào)稱為局部場(chǎng)電位(local field potential，LFP)。電刺激采用脈寬為0.1 ms的雙相恒流脈沖，由2100型脈沖刺激器(A-M Systems Inc.)產(chǎn)生[15]。

如圖2所示，施加足夠強(qiáng)度的單個(gè)脈沖刺激時(shí)，可以誘發(fā)CA1區(qū)神經(jīng)元群體產(chǎn)生群峰電位(population spike，PS)，是負(fù)相波。其中，順向刺激施加于傳入神經(jīng)纖維，經(jīng)過單突觸的傳導(dǎo)興奮CA1區(qū)錐體細(xì)胞，誘發(fā)順向群峰電位(orthodromically-evoked population spike，OPS)；而逆向刺激直接興奮錐體細(xì)胞的軸突(即傳出神經(jīng)纖維)，沿軸突反向傳導(dǎo)至胞體，誘發(fā)逆向群峰電位(antidromically-evoked population spike，APS)[16-17]。PS的大小用其下降相的幅值來表示，它反映被興奮神經(jīng)元的數(shù)量以及它們產(chǎn)生動(dòng)作電位的同步性[18]。本研究采用的脈沖刺激強(qiáng)度設(shè)為能夠誘發(fā)出最大PS幅值的75%的電流值，為0.3～0.5 mA。高頻串刺激中脈沖的頻率采用20、50、100、200、400 Hz，持續(xù)時(shí)間均為0.3 s。

圖2 強(qiáng)度為0.3 mA的單個(gè)脈沖刺激在CA1區(qū)誘發(fā)的群峰電位波形(圖中下方分別用向下和向上箭頭表示順向和逆向刺激偽跡)。(a)順向刺激誘發(fā)的OPS；(b) 逆向刺激誘發(fā)的APS及其幅值測(cè)量方法Fig.2 The waveforms of population spikes evoked by single pulse stimuli with an intensity of 0.3 mA in the CA1 region (The up and down arrows below the waveforms denote the artifacts of orthodromic-stimulation and antidromic-stimulation, respectively). (a) OPS waveform evoked by orthodromic-stimulation；(b) APS waveform evoked by antidromic-stimulation and the measurement of APS amplitude

1.2 動(dòng)物癲癇模型

在本研究中，使用抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸的拮抗劑印防己毒素(Picrotoxin，PTX)，在大鼠海馬CA1區(qū)制作急性癲癇模型，PTX的濃度為4 mM。使用50 μL的微量注射器(上海高鴿工貿(mào)有限公司)，通過植入海馬CA1區(qū)(前囟后3.5 mm，旁開2.0 mm，深度約2.0 mm)的7號(hào)穿刺針管，將PTX溶液緩慢推入。大約每5 min注射0.5 μL，同時(shí)觀察局部場(chǎng)電位(LFP)的變化，直到出現(xiàn)穩(wěn)定的癇樣棘波發(fā)放為止。每只大鼠PTX的注射總量為3～5 μL。

1.3 癇樣棘波強(qiáng)度的評(píng)價(jià)指標(biāo)

圖3 Burst中棘波發(fā)放強(qiáng)度評(píng)價(jià)指標(biāo)SSA的算法Fig.3 The definition of measurement (SSA) of spike intensity in a burst

海馬CA1區(qū)呈現(xiàn)癇樣發(fā)放時(shí)，胞體層的LFP中會(huì)出現(xiàn)許多大幅值的負(fù)相棘波[13]。棘波是神經(jīng)元群體異常同步發(fā)放的動(dòng)作電位的整合電位，其本質(zhì)與圖3所示的正常海馬組織中脈沖刺激誘發(fā)的PS波類似(下文中PS與棘波作為同義詞使用)。不過，癇樣發(fā)放時(shí)，LFP中的棘波會(huì)呈現(xiàn)為爆發(fā)的簇狀，被稱為Burst。在一定的時(shí)間長度內(nèi)Burst中包含的棘波個(gè)數(shù)越多、幅值越大，反映癇樣發(fā)放越強(qiáng)烈[13]。因此，為了評(píng)價(jià)腦電中癇樣發(fā)放的強(qiáng)度，使用棘波幅值之和(sum of spike amplitudes，SSA)作為衡量各個(gè)Burst發(fā)放強(qiáng)度的指標(biāo)(參見圖3，圖中用PS表示棘波，棘波的幅值為波谷與其之前的波峰之間差值的絕對(duì)值)。SSA用MATLAB程序計(jì)算，算法參考文獻(xiàn)[19]，步驟簡述如下：求CA1區(qū)胞體層LFP的一階差分信號(hào)，并利用閾值法來識(shí)別Burst中的棘波極值點(diǎn)的時(shí)間，閾值設(shè)定為LFP一階差分信號(hào)的幅值平均值+標(biāo)準(zhǔn)差；在LFP原始信號(hào)中計(jì)算每個(gè)棘波的幅值(即棘波的波谷與波谷之前的波峰之間的電位差)，再求得Burst中所有棘波的幅值之和，即為SSA的數(shù)值。

為了評(píng)價(jià)電刺激對(duì)于Burst中棘波發(fā)放的作用效果，研究中進(jìn)一步計(jì)算刺激作用下Burst的SSA值與無刺激的對(duì)照期Burst的SSA值之比(ratio of SSA，RSSA)。若RSSA>1，則刺激增強(qiáng)了棘波發(fā)放；若RSSA<1時(shí)，則刺激抑制了棘波發(fā)放。

1.4 閉環(huán)式電刺激系統(tǒng)

基于LabVIEW和美國NI公司生產(chǎn)的USB6251多功能信號(hào)采集卡來實(shí)現(xiàn)閉環(huán)式電刺激[20]。該系統(tǒng)程序可以自動(dòng)檢測(cè)癇樣棘波，且檢測(cè)功能可以隨時(shí)開啟和關(guān)閉。開啟時(shí)，程序使用閾值法自動(dòng)檢測(cè)LFP中出現(xiàn)的Burst中的首個(gè)棘波。檢測(cè)到棘波之后，程序隨即輸出控制信號(hào)，觸發(fā)2100刺激器產(chǎn)生雙相恒流脈沖組成的串刺激，從而實(shí)現(xiàn)閉環(huán)式刺激，作用于被檢測(cè)到的Burst中的后續(xù)棘波發(fā)放。與此同時(shí)，棘波檢測(cè)功能中斷，直到脈沖串刺激結(jié)束為止，串刺激的頻率和持續(xù)時(shí)間可以根據(jù)需要設(shè)置。

下文中用簡稱“閉環(huán)刺激”來表示該閉環(huán)系統(tǒng)的癇樣棘波自動(dòng)檢測(cè)功能以及隨即的刺激輸出功能。

2 結(jié)果

2.1 海馬CA1區(qū)癇樣模型的建立

在大鼠海馬CA1區(qū)局部注射PTX來建立急性癲癇模型，如圖4所示為CA1區(qū)胞體層記錄的LFP的變化過程。在施加PTX之前，LFP幅值很小，不包含任何癇樣棘波；施加PTX之后約10 min時(shí)，LFP中出現(xiàn)發(fā)作間期癇樣發(fā)放(即interictal癇樣波)；施加PTX之后約20 min時(shí)，LFP中出現(xiàn)發(fā)作期癇樣發(fā)放(即ictal癇樣波)，它由許多Burst組成，而每個(gè)Burst則由大幅值的棘波發(fā)放簇組成；此后，LFP交替呈現(xiàn)發(fā)作間期和發(fā)作期，每個(gè)時(shí)期持續(xù)時(shí)間為10～60 s。利用發(fā)作期的Burst，考察高頻脈沖刺激對(duì)于棘波的抑制作用。

圖4 大鼠海馬CA1區(qū)PTX癲癇模型的建立。(a)施加PTX之前的LFP無癇樣波；(b)施加PTX后10 min時(shí)LFP中出現(xiàn)發(fā)作間期癇樣波；(c)施加PTX后20 min時(shí)LFP中出現(xiàn)發(fā)作期癇樣波，由一連串的Burst組成Fig.4 Epileptiform activity induced by PTX in the hippocampal CA1 region. (a) Control LFP before the application of PTX；(b) Interictal activity appeared in LFP after 10 min application of PTX; (c) Ictal activity, i.e., continuous bursts, appeared in LFP after 20 min application of PTX.

2.2 閉環(huán)電刺激抑制癇樣棘波

利用閉環(huán)刺激，于Burst癇樣發(fā)放期間，在CA1區(qū)傳入神經(jīng)通路的軸突纖維上施加順向高頻刺激(orthodromic high-frequency stimulation，OHFS)。為了定量評(píng)價(jià)刺激作用下的Burst與無刺激時(shí)的Burst之間的區(qū)別，間歇地開啟閉環(huán)刺激功能，以便在刺激發(fā)生之前先記錄一段Burst作為對(duì)照，然后再開啟閉環(huán)刺激。如圖5(a)所示，閉環(huán)刺激開啟時(shí)，一旦系統(tǒng)檢測(cè)到Burst的首個(gè)棘波，隨即發(fā)出刺激頻率為100 Hz，持續(xù)時(shí)間為0.3 s的OHFS。刺激發(fā)生時(shí)刻距離Burst起始點(diǎn)的延時(shí)為0.05～0.5 s。應(yīng)用線性插值法去除刺激偽跡之后[21]，從圖5(a)的LFP信號(hào)放大波形可見，OHFS明顯抑制了Burst中的后續(xù)棘波發(fā)放。在圖中去除偽跡的信號(hào)上，用灰色陰影表示OHFS刺激期。在9只大鼠實(shí)驗(yàn)中分別采集約10組受刺激Burst和其前面緊鄰的對(duì)照Burst的配對(duì)LFP信號(hào)，計(jì)算它們的棘波幅值之和SSA(算法參見圖3)，并求各次實(shí)驗(yàn)的SSA均值。如圖5(b)所示，受刺激Burst的SSA均值為(9.4±6.7)mV，顯著小于對(duì)照Burst的SSA均值(35.3±28.1)mV(Pairedt-test，P<0.01，n=9)。Burst中約70%的棘波被刺激抑制(沒有被抑制的部分主要是Burst起始處尚未施加OHFS時(shí)的棘波)，這表明高頻順向刺激對(duì)于CA1區(qū)的癇樣Burst發(fā)放具有較好的抑制效果。

圖5 閉環(huán)刺激抑制Burst的癇樣棘波。(a) 100 Hz的0.3 s時(shí)長高頻OHFS刺激串抑制Burst中的棘波。從上至下的4行信號(hào)分別為：閉環(huán)刺激的開啟時(shí)序，原始LFP信號(hào)，去刺激偽跡之后的LFP信號(hào)，對(duì)照Burst和受刺激Burst的放大圖。(b)對(duì)照Burst和受刺激Burst的棘波幅值之和(SSA)均值的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(**P<0.01， 配對(duì)t檢驗(yàn)， n =9為實(shí)驗(yàn)大鼠個(gè)數(shù))Fig.5 Suppression of epileptic spikes in bursts by closed-loop stimulation. (a) 100 Hz OHFS trains with a 0.3 s duration suppressing spikes in bursts. From top to bottom: timing of closed-loop stimulation, original LFP recording, LFP signal after stimulation artifact removal, expanded waveforms of a control burst and a stimulated burst; (b) Comparison of the average SSA between control bursts and stimulated bursts(**P < 0.01, paired t test, n=9)

為了進(jìn)一步分析OHFS的刺激頻率對(duì)于棘波發(fā)放的影響，實(shí)驗(yàn)中利用閉環(huán)刺激對(duì)于自動(dòng)識(shí)別的Burst分別施加20、50、100、200、400 Hz的OHFS，持續(xù)時(shí)間均為0.3 s。如圖6(a)所示，當(dāng)刺激頻率比較低時(shí)(20和50 Hz)，OHFS刺激不能抑制Burst中的棘波，反而會(huì)誘發(fā)更多的棘波。但是，當(dāng)刺激頻率增高至100 Hz以上時(shí)，刺激期間棘波的個(gè)數(shù)減少，且幅值明顯減小。如圖6(b)所示，受刺激Burst與其前面緊鄰的對(duì)照Burst的SSA之比RSSA的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：20和50 Hz的OHFS刺激時(shí)RSSA >1，分別為2.2±1.4(n=4)和1.6±0.4(n=5)，表明刺激使得Burst的棘波發(fā)放增強(qiáng)；而100、200、400 Hz刺激時(shí)RSSA <1，分別為0.29±0.12(n=9)、0.42±0.39(n=7)和0.38±0.39(n=8)，表明刺激抑制了Burst中的60%～70%棘波發(fā)放。

圖6 不同脈沖刺激頻率對(duì)于Burst棘波發(fā)放的影響。(a)脈沖頻率為20、50、100、200、400 Hz的0.3 s時(shí)長OHFS閉環(huán)刺激的LFP信號(hào)示例，緊鄰受刺激Burst前面的一個(gè)無刺激Burst作為對(duì)照。(b)不同脈沖頻率下受刺激Burst與對(duì)照Burst的RSSA統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(One-way ANOVA，F(xiàn) =9，P<0.001；**P<0.01，Post hoc Bonferroni test；圖中n為實(shí)驗(yàn)大鼠個(gè)數(shù))Fig.6 Comparison of the effect of stimulation with different frequencies to the spike firing in bursts. (a) Examples of LFP signals with 0.3 s closed-loop stimulation of OHFS of different frequencies: 20, 50, 100, 200 and 400 Hz. The bursts immediately before stimulations were used as controls. (b) Comparison of RSSA among different stimulation frequencies (One-way ANOVA: F=9，P<0.001. **P<0.01, Bonferroni Post Hoc tests. n is the number of rats)

2.3 高頻脈沖短刺激串抑制癇樣發(fā)放的可能機(jī)制——去極化阻滯

筆者推測(cè)，去極化阻滯可能是高頻脈沖刺激抑制Burst棘波的機(jī)制。前人的研究表明，HFS可以導(dǎo)致神經(jīng)元的過度興奮而使細(xì)胞膜上的離子通道失活，無法繼續(xù)產(chǎn)生動(dòng)作電位，也就是去極化阻滯[22]。利用逆向刺激可以測(cè)試神經(jīng)元是否處于這種去極化阻滯狀態(tài)。逆向刺激通過激活神經(jīng)元的軸突纖維束，能夠?qū)⑴d奮反向傳導(dǎo)至胞體，直接興奮錐體神經(jīng)元[7,23]。如果神經(jīng)元處于去極化阻滯狀態(tài)；那么，逆向刺激就不能誘發(fā)其產(chǎn)生動(dòng)作電位，LFP信號(hào)中也就不出現(xiàn)群峰電位APS[11-12]。

如圖7所示，PTX誘導(dǎo)的自發(fā)癇樣Burst有如下特點(diǎn)：緊隨起始的一串PS波發(fā)放之后，有一段100 ms左右的無PS時(shí)期，然后再出現(xiàn)大幅值PS波，直至Burst結(jié)束為止(見圖7(a))。如果在Burst期間每隔0.1 s插入一個(gè)逆向刺激測(cè)試脈沖；那么，在距離Burst起始約15和115 ms時(shí)的逆向刺激不能誘發(fā)APS，而約215 ms之后的相同刺激就能夠誘發(fā)APS多波，緊隨其后會(huì)出現(xiàn)波峰向上的小尖波。(見圖7(b))。這表明在Burst的起始棘波串之后，有一段時(shí)期神經(jīng)元喪失了可興奮能力，其原因可能是起始棘波的強(qiáng)烈發(fā)放導(dǎo)致了神經(jīng)元的去極化阻滯。但是，這種去極化阻滯的持續(xù)時(shí)間很短(<200 ms)。之后神經(jīng)元又恢復(fù)可興奮能力。

圖7 利用逆向刺激來測(cè)試Burst期間以及OHFS作用期間神經(jīng)元可興奮性的變化。(a) PTX誘發(fā)的癇樣Burst；(b)在Burst期間插入逆向刺激測(cè)試脈沖；(c)在Burst期間施加100 Hz時(shí)長為0.3 s的OHFS，同時(shí)每0.1 s插入一個(gè)逆向刺激測(cè)試脈沖；(d)3個(gè)時(shí)期(無Burst時(shí)、Burst期施加OHFS時(shí)及其之后)逆向測(cè)試刺激誘發(fā)的APS幅值均值比較(One-way ANOVA，F(xiàn) =8.4，P<0.01；**P < 0.01，Post hoc Bonferroni test，n=4)Fig.7 Test the changes of neuronal excitability during bursts and OHFS trains by antidromic-stimulation. (a) The characteristics of PTX-induced bursts；(b) Antidromic test pulses are applied during a burst；(c) A 100 Hz OHFS train with 0.3 s duration is applied during a burst together with antidromic test pulses once per 0.1 s; (d) Comparison of APS amplitudes among three periods: normal LFP without epileptic bursts, during OHFS trains applied within bursts and after OHFS trains (One-way ANOVA: F=8.4，P<0.01；**P<0.01, Bonferroni Post Hoc tests, n=4)

在Burst期間施加OHFS時(shí)，Burst中的棘波被抑制，此時(shí)，插入逆向刺激測(cè)試脈沖，則不能誘發(fā)APS。直至OHFS結(jié)束之后，逆向刺激又可以誘發(fā)APS，且呈現(xiàn)為多波(見圖7(c))。將無Burst時(shí)(對(duì)照)、Burst期施加OHFS時(shí)及其之后，這3個(gè)時(shí)期的逆向測(cè)試刺激誘發(fā)的APS幅值均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較(見圖7(d))?？梢?，OHFS抑制Burst的棘波時(shí)APS的幅值僅為(0.25±0.38)mV，顯著小于對(duì)照的(6.16±2.36)mV和OHFS之后的(6.40±2.71)mV。這表明，OHFS可以促使神經(jīng)元的細(xì)胞膜進(jìn)入去極化阻滯狀態(tài)。此外，Burst期間施加OHFS時(shí)，LFP中不再有棘波，但會(huì)出現(xiàn)向上的正相小尖波。這種小尖波在緊隨Burst所包含的棘波發(fā)放之后也會(huì)出現(xiàn)(見圖7中(a)和(b))，這可能是細(xì)胞膜處于去極化狀態(tài)時(shí)的膜電位波動(dòng)引起的。

3 討論

本研究利用閉環(huán)刺激研究了大鼠癲癇模型中高頻脈沖刺激抑制癇樣棘波的效果和機(jī)制。結(jié)果表明，100 Hz以上的高頻串脈沖刺激能夠有效地抑制Burst中持續(xù)的棘波發(fā)放；而且，這種棘波發(fā)放的中止可能是由于神經(jīng)元細(xì)胞膜發(fā)生去極化阻滯而導(dǎo)致的。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，DBS中的高頻脈沖刺激串能夠顯著縮短腦電癇樣發(fā)作的持續(xù)時(shí)間，降低發(fā)作強(qiáng)度；并且起效迅速，適合閉環(huán)的刺激模式[7,23]。但是，這種DBS抑制癇樣發(fā)作的機(jī)制目前尚無定論。首先，常見的一種理論認(rèn)為，DBS的高頻刺激可以增加抑制性(特別是γ-氨基丁酸GABA能的)神經(jīng)元的活動(dòng)，從而增強(qiáng)主神經(jīng)元所受到的抑制性突觸的作用，由此抑制主神經(jīng)元過度的動(dòng)作電位發(fā)放[7-9]。其次，持續(xù)的高頻脈沖刺激還可能導(dǎo)致突觸神經(jīng)遞質(zhì)的耗竭或者軸突的傳導(dǎo)阻滯，從而阻止癇樣棘波的傳播和擴(kuò)散[10-11]。最后，高頻脈沖刺激還可能使神經(jīng)元持續(xù)處于去極化狀態(tài)，使細(xì)胞膜離子通道失活，發(fā)生去極化阻滯，從而喪失產(chǎn)生動(dòng)作電位的能力[12]。

上述前2種機(jī)制不太可能是本研究中閉環(huán)刺激抑制癇樣棘波的機(jī)制。首先，本研究采用抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABAA)的拮抗劑PTX在海馬區(qū)建立的癲癇模型來研究刺激的作用，而且，刺激施加于所記錄CA1區(qū)的傳入神經(jīng)纖維Schaffer側(cè)支的軸突上。GABAA是海馬區(qū)神經(jīng)回路的抑制性突觸的主要神經(jīng)遞質(zhì)[17]。由于PTX已經(jīng)阻止這類抑制性突觸的作用，因此，此時(shí)施加的高頻刺激不太可能再通過抑制性突觸來發(fā)揮作用。其次，本研究使用持續(xù)時(shí)間僅為0.3 s的短促的串刺激，這么短的時(shí)間不足以導(dǎo)致被刺激軸突的傳導(dǎo)阻滯。因?yàn)橐延袌?bào)道表明：高頻刺激引起的軸突傳導(dǎo)阻滯發(fā)生于刺激持續(xù)數(shù)秒之后；而且在高頻刺激的起始1 s時(shí)間之內(nèi)不僅無抑制作用，還具有明顯的興奮作用，可以誘發(fā)正常海馬區(qū)產(chǎn)生癇樣棘波[10-11,15]。實(shí)際上，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中測(cè)試過0.1 ～1 s不同時(shí)長的刺激。過于短的刺激由于作用時(shí)間太短，抑制的棘波較少；而過于長的刺激則在刺激的后期反而會(huì)誘發(fā)棘波。因此，0.3 s左右時(shí)長的短刺激效果比較好。根據(jù)這些分析，我們認(rèn)為，短刺激抑制PTX誘導(dǎo)的棘波的機(jī)制可能是雙重興奮作用引起的去極化阻滯，具體分析如下所述。

首先，PTX的作用導(dǎo)致GABAA能抑制性突觸功能的喪失，使得CA1區(qū)主神經(jīng)元(即錐體神經(jīng)元)的興奮性增強(qiáng)；其次，傳入通道Schaffer側(cè)支上短促的高頻刺激進(jìn)一步增加CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的興奮性。這樣，過度的興奮作用可以使神經(jīng)元持續(xù)處于去極化狀態(tài)，導(dǎo)致去極化阻滯。本研究利用逆向刺激證實(shí)了高頻刺激抑制癇樣棘波時(shí)，神經(jīng)元已喪失產(chǎn)生動(dòng)作電位的能力，這是去極化阻滯的證據(jù)之一；另一個(gè)證據(jù)是，當(dāng)刺激頻率為較低的20和50 Hz時(shí)，刺激反而增強(qiáng)了棘波的發(fā)放(見圖6)。這可能是由于刺激脈沖之間的間歇期較長(50和20 ms)，神經(jīng)元細(xì)胞膜獲得了充足的復(fù)極化時(shí)間，及時(shí)擺脫了去極化狀態(tài)，從而能夠在后續(xù)刺激的激勵(lì)下繼續(xù)產(chǎn)生動(dòng)作電位。當(dāng)刺激頻率高于100 Hz時(shí)，神經(jīng)元可以持續(xù)保持去極化狀態(tài)，從而抑制了后續(xù)動(dòng)作電位的產(chǎn)生。

實(shí)際上，前人的實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)結(jié)果也表明，短刺激能夠抑制癲癇活動(dòng)[24-25]。但是，其中的機(jī)制尚不明了。本研究提供了一種可能的機(jī)制——去極化阻滯。事實(shí)上，針對(duì)不同的癇樣發(fā)生機(jī)理，需要采用不同的DBS刺激方式和參數(shù)，才能夠獲得較好的作用效果。本研究的方法需要利用閉環(huán)刺激模式，在Burst的癇樣發(fā)放期間施加短刺激，才能通過去極化阻滯這種機(jī)制來抑制癇樣棘波的持續(xù)發(fā)展。但是，在其他非癇樣發(fā)放時(shí)期，短刺激甚至可以誘發(fā)強(qiáng)烈的后放電(after-discharge)，反而是一種誘發(fā)癲癇的手段[24,26]。因此，了解不同DBS刺激模式的作用機(jī)制具有重要意義，可以指導(dǎo)臨床應(yīng)用。此外，本研究的短刺激模式雖然不能長時(shí)間抑制癇樣的發(fā)生，但可以中止各個(gè)Burst中棘波的持續(xù)產(chǎn)生，可能將癇樣發(fā)放的形式從發(fā)作期轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)作間期，從而減輕癲癇的發(fā)作強(qiáng)度。

4 結(jié)論

本研究利用γ-氨基丁酸拮抗劑制作的大鼠癲癇模型，驗(yàn)證了閉環(huán)式的高頻短脈沖刺激串可以抑制癇樣棘波的發(fā)放，其機(jī)制可能是刺激的興奮性激勵(lì)導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞膜發(fā)生去極化阻滯，該研究結(jié)果對(duì)于腦深部刺激在臨床癲癇等疾病治療中的應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。

[1] Hauser WA, Beghi E. First seizure definitions and worldwide incidence and mortality [J]. Epilepsia, 2008, 49(Supplement 1): 8-12.

[2] Eadie MJ. Shortcomings in the current treatment of epilepsy [J]. Expert Review of Neurotherapeutics, 2012, 12(12): 1419-1427.

[3] Laxpati NG, Kasoff WS, Gross RE. Deep brain stimulation for the treatment of epilepsy: circuits, targets, and trials [J]. Journal of the American Society for Experimental Neurotherapeutics, 2014, 11(3): 508-526.

[4] Morrell M. Brain stimulation for epilepsy: can scheduled or responsive neurostimulation stop seizures [J]. Current Opinion in Neurology, 2006, 5(2): 164-168.

[5] Montgomery EB Jr, Gale JT. Mechanisms of action of deep brain stimulation (DBS) [J]. Neuroscience & Biobehavioral Reviews, 2008, 32(3): 388-407.

[6] Mcintyre CC, Grill WM. Selective microstimulation of central nervous system neurons [J]. Annals of Biomedical Engineering, 2000, 28(3): 219-233.

[7] Schiller Y, Bankirer Y. Cellular mechanisms underlying antiepileptic effects of low- and high-frequency electrical stimulation in acute epilepsy in neocortical brain slices in vitro [J]. Journal of Neurophysiology, 2007, 97(3): 1887-1902.

[8] Dostrovsky JO, Levy R, Wu JP, et al. Microstimulation-induced inhibition of neuronal firing in human globus pallidus [J]. Journal of Neurophysiology, 2000, 84(1): 570-574.

[9] Chiken, S, Nambu A. High-frequency pallidal stimulation disrupts information flow through the pallidum by gabaergic inhibition [J]. Journal of Neuroscience, 2013, 33(6): 2268-2280.

[10] Jensen AL, Durand DM. High frequency stimulation can block axonal conduction [J]. Experimental Neurology, 2009, 220(1):57-70.

[11] Feng Zhouyan, Zheng Xiaojing, Yu Ying, et al. Functional disconnection of axonal fibers generated by high frequency stimulation in the hippocampal ca1 region in-vivo [J]. Brain Research, 2013, 1509(7): 32-42.

[12] Bikson M, Lian J, Hahn PJ, et al. Suppression of epileptiform activity by high frequency sinusoidal fields in rat hippocampal slices [J]. The Journal of Physiology, 2001, 531(1): 181-191.

[13] 大熊輝雄. 腦電圖判讀Step by Step (第4版) [M]. 北京：科學(xué)出版社, 2009：13-51, 70-80.

[14] 封洲燕, 光磊, 鄭曉靜, 等. 應(yīng)用線性硅電極陣列檢測(cè)海馬場(chǎng)電位和單細(xì)胞動(dòng)作電位[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2007, 34(4): 401-407.

[15] 封洲燕, 余穎, 曹嘉悅, 等. 大鼠海馬神經(jīng)元群體對(duì)于高頻電刺激的響應(yīng)[J]. 中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào), 2014, 33(2): 186-193.

[16] 封洲燕, 邢昊昱, 田聰, 等. 大鼠海馬CA1區(qū)前饋抑制和反饋抑制的作用特性[J]. 航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程, 2011, 24(3): 167-172.

[17] Andersen P, Morris R, Amaral D, et al, eds. The Hippocampus Book [M]. Oxford: Oxford University Press, 2007.

[18] Theoret Y, Brown A, Fleming SP, et al. Hippocampal field potential: a microcomputer aided comparison of amplitude and integral.[J]. Brain Research Bulletin, 1984, 12(5): 589-595.

[19] 光磊, 封洲燕. 神經(jīng)細(xì)胞群峰電位的自動(dòng)定量分析[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(工學(xué)版), 2008, 42(9): 1641-1647.

[20] 封洲燕, 陳丹, 肖乾江. 一種閉環(huán)式神經(jīng)電刺激系統(tǒng)的設(shè)計(jì)[J]. 儀器儀表學(xué)報(bào), 2012, 33(2): 279-285.

[21] 封洲燕, 肖乾江, 胡振華. 電刺激期間神經(jīng)細(xì)胞單元鋒電位的檢測(cè)[J]. 中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào), 2013, 32(4): 403-410.

[22] Beurrier C, Bioulac B, Audin J, et al. High-frequency stimulation produces a transient blockade of voltage-gated currents in subthalamic neurons[J]. Journal of Neurophysiology, 2001, 85(4): 1351-1356.

[23] McIntyre CC, Grill WM, Sherman DL, et al. Cellular effects of deep brain stimulation: model-based analysis of activation and inhibition[J]. Journal of Neurophysiology, 2004, 91(4): 1457-1469.

[24] Lesser RP, Kim SH, Beyderman L, et al. Brief bursts of pulse stimulation terminate afterdischarges caused by cortical stimulation[J]. Neurology, 1999, 53(9): 2073-2081.

[25] Sun FT, Morrell MJ. Closed-loop neurostimulation: the clinical experience[J]. Neurotherapeutics, 2014, 11(3): 553-563.

[26] Motamedi GK, Lesser RP, Miglioretti DL, et al. Optimizing parameters for terminating cortical afterdischarges with pulse stimulation[J]. Epilepsia, 2002, 43(8): 836-846.

Mechanism of Suppression of Epileptiform Burst by Closed-Loop Electrical Stimulation

Cao Jiayue Feng Zhouyan*Guo Zheshan Hu Zhenhua Hu Na

(CollegeofBiomedicalEngineeringandInstrumentationScience,KeyLabforBiomedicalEngineeringofEducationMinistry,ZhejiangUniversity,Hangzhou, 310027,China)

Deep brain stimulation (DBS) is an attractive alternative strategy to surgical excision of the seizure focuses for epilepsy treatments in clinic. However, epilepsy can be generated by various mechanisms, and this highlights a need in designing pertinent DBS patterns with customized parameters for the effective therapy. In the present study, high-frequency stimulation (HFS) pulse trains with short durations were used against the epileptic form activity induced by picrotoxin, an antagonist of GABAergic receptors, in the hippocampal CA1 region of anaesthetized rats. In a closed-loop manner, the HFS train was applied during each period of epileptic form bursts to the afferent axon tracts (i.e. the Schaffer collaterals) of CA1 region. The experiment results from 9 rats show that HFS trains with a frequency over 100 Hz and duration of 0.3 s during bursts suppressed 60-70% of the spikes in the bursts. Meanwhile, during the periods of HFS against bursts, the neurons of CA1 region failed to respond to the excitation of antidromic stimulation applied to the efferent axon tracts (i.e. the alveus), indicating that the neurons temporarily lost their ability to generate action potentials. Therefore, presumably, the mechanism of spike suppression by HFS might be a depolarization block generated within neuronal membranes. The finding of the study provides important insight into the development of novel closed-loop stimulation patterns of DBS in treating epilepsy.

deep brain stimulation; closed-loop; epilepsy; picrotoxin; depolarization block

10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 01.010

2015-08-21， 錄用日期:2015-11-12

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2011CB504400).

R338, R318

A

0258-8021(2016) 01-0079-09

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: fengzhouyan@139.com