蛹蟲草多糖對(duì)注射環(huán)磷酰胺小鼠抗氧化功能的影響

王 米，王宵旸，張麗芳，費(fèi)陳忠，張可煜，王春梅，楊銳樂(lè)，薛飛群

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，動(dòng)物藥學(xué)研究室，上海200241）

蛹蟲草多糖對(duì)注射環(huán)磷酰胺小鼠抗氧化功能的影響

王 米，王宵旸，張麗芳，費(fèi)陳忠，張可煜，王春梅，楊銳樂(lè)，薛飛群＊

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，動(dòng)物藥學(xué)研究室，上海200241）

摘 要：試驗(yàn)旨在闡明蛹蟲草多糖（CMP）對(duì)小鼠抗氧化活性的影響。選取90只雄性BALB／c小鼠，體重18～20g，隨機(jī)分為6組，3個(gè)CMP組（低、中、高CMP組），模型對(duì)照組（CY組）、陽(yáng)性對(duì)照組（PC組）及空白對(duì)照組（BC組）各1個(gè)。CMP組和CY組分別腹腔注射80mg／kg環(huán)磷酰胺，連續(xù)3d，然后3個(gè)CMP組分別灌胃給予17.5、35.0、70.0mg／kg體重的CMP，BC組和CY組給予生理鹽水，PC組灌胃給予70mg／kg體重的CMP，持續(xù)18d。于最后一次給藥24h后，采集小鼠內(nèi)臟，測(cè)定心臟、肝臟及腎臟勻漿液中T－AOC、MAD、CAT、SOD和GSH－Px水平。結(jié)果顯示，與CY組相比，3個(gè)CMP處理組小鼠內(nèi)臟勻漿液中的SOD和T－AOC活性均極顯著增加（P＜0.01），MDA水平極顯著降低（P＜0.01）；低劑量CMP組心臟CAT無(wú)顯著變化（P＞0.05），中、高劑量CMP組心臟CAT水平分別顯著（P＜0.05）、極顯著（P＜0.01）提高；除低劑量CMP組肝臟GSH－Px活性顯著增加（P＜0.05）外，其余CMP組內(nèi)臟GSH－Px活性均極顯著增加（P＜0.01）。本試驗(yàn)中CMP可以有效提高小鼠心臟、肝臟及腎臟的抗氧化活性，這為抗氧化新藥的研發(fā)提供了借鑒。

關(guān)鍵詞：蛹蟲草多糖；環(huán)磷酰胺；抗氧化活性；小鼠

在機(jī)體的新陳代謝過(guò)程中會(huì)持續(xù)不斷地產(chǎn)生活性氧（ROS）自由基，這些自由基通過(guò)使細(xì)胞膜上的酶和受體失活對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成重大傷害，使脂質(zhì)過(guò)氧化或形成DNA加合物，從而誘發(fā)多種疾?。?］。動(dòng)物的衰老大多是因?yàn)闄C(jī)體內(nèi)存在的自由基及其代謝產(chǎn)物積累過(guò)多，引起細(xì)胞代謝功能障礙和損傷。在正常情況下，機(jī)體具有自身的抗氧化機(jī)制，使機(jī)體內(nèi)的ROS處于動(dòng)態(tài)平衡，而一旦這種平衡被打破，就會(huì)損害機(jī)體，從而引發(fā)一系列相關(guān)疾?。?］。因此，需要找到一種抗氧化的輔助物，以降低自由基對(duì)機(jī)體造成的傷害［3］。

目前已經(jīng)用于臨床的化學(xué)合成抗氧化劑有丁基羥基茴香醚、丁羥甲苯及沒(méi)食子酸丙酯等，但這些藥物能引起肝損傷和癌變，因此，有必要尋找更有效的天然抗氧化物，保護(hù)機(jī)體免受自由基的損傷［4］。許多研究表明，多種多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可以作為潛在的新型抗氧化藥物［5］。20世紀(jì)60年代以后，人們發(fā)現(xiàn)多糖在清除機(jī)體自由基方面有良好的效果，且多糖毒副作用?。?］。近年來(lái)，人們對(duì)多糖及其復(fù)合物的抗氧化活性有了越來(lái)越深入的認(rèn)識(shí)。研究表明，從天然產(chǎn)物中分離得到的多糖類化合物具有抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用、清除自由基、抑制亞油酸氧化等抗氧化作用［7－8］，可以通過(guò)提供氫原子阻止氧化反應(yīng)鏈［9］，如刺五加多糖、黃芪多糖、蒲公英多糖、枸杞多糖和β－葡聚糖等［6，10－13］。蛹蟲草（Cordyceps militaris）隸屬于真菌界的子囊菌門、肉座菌目、麥角菌科，與冬蟲夏草同屬異種。研究表明，蛹蟲草多糖在體外具有清除羥基自由基的活性［14－15］，而對(duì)其體內(nèi)抗氧化活性研究較少。

環(huán)磷酰胺為目前廣泛應(yīng)用的烷化劑，它既可以抑制免疫細(xì)胞及骨髓的造血功能，又可引起機(jī)體的氧化應(yīng)激［16］。本試驗(yàn)擬通過(guò)小鼠注射環(huán)磷酰胺構(gòu)建氧化應(yīng)激模型，從蛹蟲草中提取多糖，研究蛹蟲草多糖對(duì)氧化應(yīng)激小鼠的作用效果，對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為開發(fā)抗氧化新藥以及臨床應(yīng)用蛹蟲草提供技術(shù)支持與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1多糖制備

將蛹蟲草使用10倍質(zhì)量蒸餾水、100℃水浴2h提取多糖，收集提取液；藥渣再用5倍質(zhì)量蒸餾水100℃水浴提取2次，每次2h，合并提取液，過(guò)濾，離心，去蛋白。然后真空旋轉(zhuǎn)濃縮，濃縮至固型物含量為25%～30%后，加3倍體積95%乙醇，邊加邊攪拌，靜置24h，傾去上層液體。下層沉淀離心，凍干，得蛹蟲草多糖（CMP）［17］。用生理鹽水將蛹蟲草多糖配成17.5、35.0及70.0mg／mL溶液，4℃保存。

1.2主要試劑

總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxidase dismutase，SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）分析試劑盒均購(gòu)自江蘇省南京建成生物工程有限公司；環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CY）購(gòu)自江蘇恒瑞藥物有限公司；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G－250及纖維素袋均購(gòu)自Sigma公司。所有的化學(xué)試劑均為分析純。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

雄性BALB／c小鼠（8周齡，18～20g），購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠自由采食和飲水，溫度控制在（22±1）℃，采用12h循環(huán)光照。小鼠隨機(jī)分為6組，每組15只。所有動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7d。兩組健康的小鼠分別作為空白對(duì)照組（BC組）和陽(yáng)性對(duì)照組（PC組），分別灌胃生理鹽水和70mg／kg體重CMP，持續(xù)18d。第1～3天，其余4組小鼠每天通過(guò)腹腔注射80mg／kg CY。從第4～18天，模型對(duì)照組（CY組）小鼠灌胃生理鹽水；3個(gè)CMP組分別灌胃17.5、35.0、70.0mg／kg體重CMP。

1.4抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

在預(yù)冷的等滲生理鹽水中制備小鼠心臟、肝臟和腎臟的組織勻漿液樣品，將其制成0.1g／mL濕重的溶液。該樣品在4℃、2 000r／min離心10min，上清液用于測(cè)定蛋白、T－AOC、MAD、CAT、SOD和GSH－Px水平。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 15.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以O(shè)ne－Way ANOVA及Ducan’s進(jìn)行方差分析及多重比較，以P＜0.05、P＜0.01作為差異顯著、極顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1小鼠心臟、肝臟和腎臟中SOD活性

由表1可知，與BC組相比，CY處理極顯著降低小鼠心臟、肝臟和腎臟的SOD活性（P＜0.01）；與CY組相比，所有CMP處理組均極顯著增加了小鼠心臟、肝臟及腎臟的SOD活性（P＜0.01）。隨著CMP劑量的增加，小鼠肝臟、腎臟的SOD活性亦極顯著增加（P＜0.01）。

表1　蛹蟲草多糖對(duì)各處理小鼠心臟、肝臟和腎臟中SOD活性的影響（U／mg protein）Table 1 Effect of CMP on the SOD activities in heart，liver and kidney of mice in different treatments

2.2小鼠心臟、肝臟和腎臟中CAT活性

由表2可知，與BC組相比，CY處理極顯著降低了小鼠心臟、肝臟和腎臟的CAT活性（P＜0.01）；與CY組相比，3個(gè)CMP處理組極顯著增加了小鼠肝臟和腎臟的CAT活性（P＜0.01），低劑量CMP處理小鼠心臟CAT活性無(wú)顯著變化（P＞0.05），中、高劑量CMP處理小鼠心臟CAT活性分別顯著（P＜0.05）、極顯著（P＜0.01）升高。

表2　蛹蟲草多糖對(duì)各處理小鼠心臟、肝臟和腎臟中CAT活性的影響（U／mg protein）Table 2 Effect of CMP on the CAT activities in heart，liver and kidney of mice in different treatments

2.3小鼠心臟、肝臟和腎臟中GSH－Px活性

由表3可知，與BC組相比，CY處理極顯著降低了小鼠心臟、肝臟和腎臟的GSH－Px活性（P＜ 0.01）；與CY組相比，低劑量CMP顯著增加了肝臟GSH－Px活性（P＜0.05），其他各CMP處理小鼠的內(nèi)臟GSH－Px活性均極顯著升高（P＜0.01）。

表3　蛹蟲草多糖對(duì)各處理小鼠心臟、肝臟和腎臟中GSH－Px活性的影響（U／mg protein）Table 3 Effect of CMP on the GSH－Px activities in heart，liver and kidney of mice in different treatments

2.4小鼠心臟、肝臟和腎臟中T－AOC活性

由表4可知，與BC組相比，CY處理極顯著降低了小鼠心臟、肝臟和腎臟的T－AOC活性（P＜ 0.01）；與CY組相比，所有CMP處理的小鼠內(nèi)臟T－AOC活性均極顯著增加（P＜0.01）。

表4　蛹蟲草多糖對(duì)各處理小鼠心臟、肝臟和腎臟中T－AOC活性的影響（U／mg protein）Table 4 Effect of CMP on the T－AOC activities in heart，liver and kidney of mice in different treatments

2.5小鼠心臟、肝臟和腎臟中MDA含量

由表5可知，與BC組相比，CY處理極顯著增加了小鼠心臟、肝臟和腎臟中MDA的含量（P＜ 0.01）；與CY組相比，所有CMP處理小鼠內(nèi)臟MDA活性均極顯著降低（P＜0.01）。

表5　蛹蟲草多糖對(duì)各處理小鼠心臟、肝臟和腎臟中MDA含量的影響（nmol／mg）Table 5 Effect of CMP on MDA level in heart，liver and kidneys of mice in different treatments

3 討 論

自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化與許多疾病的發(fā)生有關(guān)，如超氧自由基、羥基自由基、過(guò)氧化氫和一氧化氮（統(tǒng)稱為ROS）的過(guò)量產(chǎn)生，在組織損傷和許多組織和器官功能的喪失中發(fā)揮著多種重要的作用［18－19］。越來(lái)越多的研究表明，許多種類的多糖都具有清除自由基防止氧化損傷的作用［20－22］。添加高、中劑量刺五加多糖能夠顯著提高肉雞血清中SOD、GSH－Px和CAT的含量，且高劑量組MDA的含量顯著降低，表明飼料中添加刺五加多糖能夠促進(jìn)肉雞的抗氧化性能［6］；蒲公英多糖可以顯著提高肉雞血清中SOD活性，降低血清MDA含量［10］；黃芪多糖可以提高幼犬血清T－SOD活力，降低血清MDA含量［11］；枸杞多糖可以顯著提高倉(cāng)鼠血清中的SOD、GSH－Px的水平，顯著降低MDA的水平［12］。小鼠飼喂β－葡聚糖，可明顯降低脂質(zhì)超氧化物，血清中的谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比例，而SOD的活性明顯提高［13］。環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生負(fù)面影響，主要是能降低小鼠血清中抗氧化物酶活性，導(dǎo)致肝組織抗氧化防御系統(tǒng)的抗氧化功能都有不同程度下降，進(jìn)一步增加ROS的含量，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，使肝組織丙二醛含量升高，最終導(dǎo)致肝臟氧化應(yīng)激損傷［23］。蟲草多糖能清除自由基，蛹蟲草多糖的抗氧化活性甚至強(qiáng)于冬蟲夏草和古尼蟲草［24］。體外活性研究表明，蛹蟲草多糖P70－1和CBP－1能夠劑量依賴性地清除自由基，IC50分別是0.548和0.638mg／mL［7－8］。這與本研究結(jié)果相同。當(dāng)小鼠用CY處理后，心臟、肝臟和腎臟中的T－AOC、CAT、SOD和GSH－Px活性顯著降低，而MDA水平顯著增加。然而，給予CMP（17.5、35.0和70.0mg／kg體重）后可顯著增加T－AOC、CAT、SOD和GSH－Px活性，同時(shí)降低MDA水平。由此表明CMP可以有效清除各種自由基及其產(chǎn)物，提高環(huán)磷酰胺處理小鼠的抗氧化能力。

4 小 結(jié)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，CMP可以提高小鼠的抗氧化能力，提高體內(nèi)抗氧化酶活性，有效清除氧化產(chǎn)物。CMP可以開發(fā)為具有抗氧化活性的免疫調(diào)控劑，也可與化療藥物相結(jié)合應(yīng)用于抗腫瘤的免疫治療。

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（責(zé)任編輯 盧慶萍）

中圖分類號(hào)：S853.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671－7236（2016）12－3251－06

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.025

收稿日期：2016－02－25

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303040－08）；863計(jì)劃課題“偶蹄動(dòng)物用新型免疫佐劑的創(chuàng)新”（2011AA2114）。

作者簡(jiǎn)介：王 米（1975－），男，四川綿陽(yáng)人，博士，副研究員，研究方向：中獸藥，E－mail：wangmi＠shvri.ac.cn

通信作者：＊薛飛群（1956－），甘肅天水人，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：新獸藥，E－mail：feiqun＠gmail.com

The Effect ofCordycepsMilitarisPolysaccharides on the Antioxidant Function in Mice Injected With Cyclophosphamide

WANG Mi，WANG Xiao－yang，ZHANG Li－fang，F(xiàn)EI Chen－zhong，ZHANG Ke－yu，WANG Chun－mei，YANG Rui－le，XUE Fei－qun＊
（DepartmentofPharmacy，ShanghaiVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyof AgriculturalSciences，Shanghai200241，China）

Abstract：To investigate the antioxidant effects of theCordycepsmilitarispolysaccharides（CMP），90male BALB／c mice were randomly divided into six groups，three experimental groups（CMP groups），model control group（CY group），blank control group（BC group）and positive control group（PC group）.The mice in CMP and CY groups were given cyclophosphamide at 80mg／kg via intraperitoneal injection for 3d.Then the CMP groups were administrated 17.5，35.0and 70.0mg／（kg·BW）CMP via gavage，respectively，BC and CY groups were given physiological saline，and PC group was orally administered 70mg／（kg·BW）CMP，lasting 18d.At 24hafter the last administration，heart，liver and kidney were collected to measure the levels of MAD，CAT，SOD，GSH－Px and T－AOC in the homogenate.SOD and TAOC activity of three CMP groups increased significantly（P＜0.01），and the level of MDA decreased significantly（P＜0.01）compared with CY group.As for CAT activity of heart，the value in low－dose CMP group had no significant change（P＞0.05），while in middle and high－dose groups had significant（P＜0.05）and extremely significant（P＜0.01）increase respectively.Except that the hepatic GSH－Px activity increased significantly（P＜0.05）in low－dose CMP group，the rest values ofGSH－Px activities in all CMP groups increased extremely significantly（P＜0.01）.The results indicated that CMP could effectively improve the antioxidant function of mice and had the potential to be a good resource of new antioxidant drugs.

Key words：Cordycepsmilitarispolysaccharides；cyclophosphamide；antioxidant activity；mice