參附注射液對膿毒癥大鼠心肌組織Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

胡丹丹 徐慧連 樓黎明

參附注射液對膿毒癥大鼠心肌組織Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

胡丹丹 徐慧連 樓黎明

目的研究參附注射對膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響，闡明參附注射液抗膿毒癥心肌損傷的相關(guān)機制。方法雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和參附組，每組8只。以盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）法建立膿毒癥大鼠動物模型，觀察各組大鼠心肌酶譜變化；凋亡原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，RT-PCR法檢測心肌細(xì)胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組、參附組心肌肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌酸激酶（CK）均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[CK-MB：（4208.51±382.57）U/L、（3584.59±347.06）U/L比（2187.41±556.63）U/L，P＜0.05；CK：（3216.75±565.42）U/L、（1986.21± 366.73）U/L比（1189.40±245.87）U/L，P＜0.05]；與參附組比較，模型組心肌酶明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。三組均可見大鼠心肌細(xì)胞凋亡，與假手術(shù)組比較，模型組、參附組TUNEL平均光密度（MOD）升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（0.24±0.11、0.18±0.09比0.09±0.05，P＜0.05）；模型組升高最明顯，與參附組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組、參附組大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)均較假手術(shù)組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 [（3.83±0.07）×10-3、（4.86±0.08）×10-3比（5.75±0.09）×10-3，P＜0.05]；參附組Bcl-2 mRNA表達(dá)高于模型組（P＜0.05）。模型組、參附組Bax mRNA表達(dá)均較假手術(shù)組升高[（7.12±0.08）×10-3、（6.26±0.06）×10-3比（4.61±0.05）×10-3，P＜0.05]；參附組Bax mRNA表達(dá)低于模型組（P＜0.05）。結(jié)論參附注射液能減輕膿毒癥大鼠的心肌損傷，其作用機制與上調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(dá)，下調(diào)Bax mRNA表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)。

大鼠；膿毒癥；心??；Bcl-2；Bax；參附注射液

膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、重癥感染等多種危重疾病應(yīng)激狀態(tài)下的常見并發(fā)癥，具有高發(fā)病率，高死亡率的特點，其高死亡率與它易致多臟器功能損傷直接相關(guān)。40%～50%的膿毒癥可導(dǎo)致心功能不全，其特征為左右心室擴大、收縮功能下降及舒張功能障礙[1]。心肌細(xì)胞損傷是膿毒癥心功能不全發(fā)生的主要原因，細(xì)胞凋亡在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用,已有的試驗已證明抗凋亡治療有逆轉(zhuǎn)膿毒癥心肌損傷的作用[2]。中醫(yī)認(rèn)為，心功能不全多責(zé)之于邪氣損傷心陽、心陽不足，參附注射液具有溫陽祛邪的作用。本研究通過觀察參附注射液對大鼠膿毒癥模型心肌損傷標(biāo)記物、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響，探討參附注射液對膿毒癥大鼠心肌損傷的保護(hù)作用及其機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，清潔級，體質(zhì)量（200±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供和飼養(yǎng)，許可證號：SYXK（浙）2013-0184。造模前適應(yīng)性喂養(yǎng)7天。

1.2 儀器與試劑 低溫離心機（Eppendorf Centrifuge 5804德國）；紫外分光光度計（BECKMAN DU-600，美國）；電泳轉(zhuǎn)膜裝置（Bio-RAD，美國）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（泰州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司）；Model 550酶標(biāo)儀（Bio-Rad，美國）；BioSenSC300凝膠圖象分析系統(tǒng)（上海山富科學(xué)儀器有限公司）；PTC-225 Peltier Thermal Cycler（MJ Research Inc，Waltham，Massachusetts）；Rotor-Gene RG-3000 Real-Time Thermal Cycler（Corbett Reseach，Sydney，Aus-tralia）等。參附注射液（雅安三九藥業(yè)有限公司）；戊巴比妥鈉（上海西塘生物科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 膿毒癥模型的制備 參照相關(guān)文獻(xiàn)[3]以盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法制備膿毒癥模型。

2.2 分組及給藥 雄性SD大鼠共分為假手術(shù)組、模型組、參附組，每組8只。模型組行CLP術(shù)后，分別于0、6h、12h尾靜脈注射生理鹽水5mL/kg，參附組于CLP術(shù)后分別于上述時間點行尾靜脈注射參附注射液5mL/kg；假手術(shù)組麻醉后開腹翻動腸道，關(guān)腹。各組于術(shù)后24h麻醉腹主動脈采血處死，留取心肌組織行相關(guān)指標(biāo)檢測。

2.3 指標(biāo)檢測方法

2.3.1 心肌酶檢測 自動生化分析儀測定心肌肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平變化。

2.3.2 TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡 取心肌組織，制備石蠟切片。以末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法按試劑盒說明進(jìn)行肺組織切片細(xì)胞凋亡的原位檢測。具體方法如下：（1）石蠟包埋的切片常規(guī)脫蠟脫水。（2）用蛋白酶K （20μg/mL溶于Tris/HCl中，Ph7.4～8.0）室溫孵育15～30min。37℃度孵育15min。PBS洗2次。（3）標(biāo)記：PBS沖洗2次，擦干樣品周圍水分，滴加50μL的TUNEL反應(yīng)混合溶液，在濕盒中37℃孵育60min（為防止蒸發(fā)和保證TUNEL反應(yīng)混合物均勻分布，在孵育過程中加蓋蓋玻片）。PBS沖洗3次。（4）信號轉(zhuǎn)化和分析：擦干樣品周圍水分，加入50μL轉(zhuǎn)化劑-POD，在濕盒中37℃孵育30min（為防止蒸發(fā)和保證轉(zhuǎn)化劑-POD均勻分布，在孵育過程中加蓋蓋玻片）。PBS沖洗3次，加入50～100μL DAB底物溶液，室溫孵育10min，PBS沖洗3次。（5）蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，封片，以多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)在光鏡下行圖象分析：選擇有意義的組織相，經(jīng)登錄、編號、采集、分析、讀取數(shù)據(jù)。

2.3.3 熒光定量PCR法檢測心肌組織Bcl-2、Bax mRNA表達(dá) Trizol常規(guī)法抽提各組心肌組織總RNA，具體方法如下：（1）約100mg組織于冰浴勻漿器中，冰上迅速研磨成勻漿液，加入1mL Trizol，劇烈震蕩，室溫放置5min。（2）加入0.2mL的氯仿，蓋好后漩渦劇烈震蕩15s，室溫放置2～3min，然后離心12 000 rpm，15min，4°C。離心后分成三層，下面的紅色為酚-氯仿相、中間層、上面是無色的水相。RNA只存在于水相中。（3）將上層水相轉(zhuǎn)移到另一干凈的EP管中，加入等體積的異丙醇，靜置30min，-20℃，然后離心12 000rpm，15min，4°C。（4）去上清，加入1mL75%乙醇洗滌RNA沉淀，振蕩器混勻，離心7 500×g，5min，4℃。（5）去上清，置真空或空氣中5～10min，干燥RNA沉淀（不能在真空中離心干燥）。根據(jù)沉淀的量加入適量的RNase free水溶解RNA，去除基因組DNA；RNA定量后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；引物：Bcl-2 （110bp）：F：5’-AGTACCTGAACCGGCATCTG-3；R：5’-CAGCCAGGAGAAATCAACAG-3′。Bax（133bp）：F：5’-ACACCTGAGCTGACCTTGGA-3′；R：5’-CCGT GTCCACGTCAGCAATC-3′。GAPDH（130bp）：F：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3；R：5’-GGCATGGA CTGTGGTCATGAG-3′。取樣本總cDNA 1μL、上游和下游引物各0.5μL，加入試劑盒其他成分，樣品Bcl-2、Bax GAPDH循環(huán)條件為：94℃預(yù)變性5min；接著進(jìn)行45個循環(huán)，95°C變性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s；最后72℃延伸5min。以GAPDH作為內(nèi)參，分析Bcl-2的表達(dá)?；驍U增的Ct值：采用相對定量方法分析各樣本的ΔCt值（ΔCt=母的基因Ct 值-內(nèi)參基因Ct值），再依據(jù)ΔΔCt值=實驗組ΔCt值-對照組ΔCt值計算2-ΔΔCt的值。當(dāng)目的基因與內(nèi)參基因的擴增效率接近時，2-ΔΔCt的值表示目的基因在實驗組樣本中相對于對照組樣本的表達(dá)倍數(shù)。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)使用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示。采用單因素方差分析；方差齊性選用LSD檢驗，方差不齊采用Dunnett’s T3法檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠心肌酶譜變化 與假手術(shù)組比較，模型組、參附組大鼠血清CK-MB、CK較假手術(shù)組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，參附組大鼠血清CK-MB、CK較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

3.2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況 三組均可見凋亡細(xì)胞，模型組、參附組大鼠心肌細(xì)胞TUNEL平均光密度（MOD）均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；參附組MOD較模型組明顯降低（P＜0.05），見表2，圖1。

表1 各組大鼠心肌酶譜比較（x±s）

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞TUNEL光密度值比較（x±s）

3.3 各組大鼠心肌組織Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)水平變化 與假手術(shù)組比較，模型組、參附組大鼠心肌Bcl-2 mRNA較假手術(shù)組明顯降低，Bax mRNA較假手術(shù)組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，參附組大鼠心肌Bcl-2 mRNA明顯升高，Bax mRNA明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠心肌組織Bcl-2 mRNA 和Bax mRNA表達(dá)比較（×10-3，x±s）

圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況（熒光定量，×200）

4討 論

膿毒癥可導(dǎo)致多器官損傷，心臟是其損傷的重要靶器官之一。本研究顯示，模型組及參附組大鼠CK-MB、CK均出現(xiàn)不同程度升高，心肌細(xì)胞TUNEL平均光密度（MOD）均高于假手術(shù)組（P＜0.05），表明CLP大鼠存在心肌損傷。參附組與模型組比較，CKMB、CK、MOD降低（P＜0.05），表明參附注射液對膿毒癥心肌損傷有一定的保護(hù)作用。

研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥心肌損傷除與心肌細(xì)胞低氧、線粒體損傷能量代謝障礙有關(guān)，還與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)[3]。膿毒癥心肌細(xì)胞凋亡存在多條信號通路，線粒體途徑是其中最重要的通路之一[4]。Bcl-2家族控制著線粒體外膜和內(nèi)膜的通透性，它們通過激活一系列下游基因發(fā)揮調(diào)節(jié)凋亡作用，因此是線粒體凋亡途徑的主要調(diào)控者[5]。Bcl-2家族蛋白按功能可分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白兩大類，抗凋亡蛋白以Bcl-2、Bcl-xl為代表，具有抑制細(xì)胞凋亡作用，主要分布于線粒體；促凋亡蛋白以Bax、Bad、Bid為代表的，可以促進(jìn)或誘導(dǎo)線粒體凋亡因子的釋放，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。Bcl-2家族蛋白通過二聚體的形式相互作用，調(diào)控細(xì)胞的凋亡，不同二聚體間的精細(xì)平衡決定了細(xì)胞是繼續(xù)存活還是走向死亡。Bcl-2是此途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，有抑制凋亡作用。Bcl-2表達(dá)占優(yōu)勢時可阻止細(xì)胞凋亡[6]。在小鼠CLP模型，抗凋亡蛋白Bcl-2的過表達(dá)可抑制巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞凋亡[7]，腸道特異Bcl-2過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠膿毒癥死亡率較其他小鼠低[8]。本研究顯示，模型組及參附組大鼠心肌Bax mRNA表達(dá)均高于假手術(shù)組，Bcl-2 mRNA表達(dá)低于假手術(shù)組（P＜0.05），心肌細(xì)胞凋亡增加，與文獻(xiàn)報道相一致。

《內(nèi)經(jīng)》有“少火生氣，壯火食氣”的論述，膿毒癥邪氣傷人，先傷臟腑之功能，后則損及形質(zhì)，重癥膿毒癥的高熱階段必然耗損正氣，甚則陽氣耗散，膿毒癥心臟損傷，也表現(xiàn)為先傷及心陽而后心之形質(zhì)受損?！瓣柣瘹?、陰成形”，膿毒癥時邪氣損傷心陽，心陽受損、氣化失司，陰血不生，臟腑失養(yǎng)進(jìn)一步加劇心臟功能障礙。因此溫陽益氣是治療膿毒癥心臟損傷的關(guān)鍵，心陽恢復(fù)、氣化得行則陰血自生，從而恢復(fù)正常的臟腑功能。參附注射液由紅參、附子組成，主要有效成分為人參皂苷和烏頭堿，具有溫陽益氣養(yǎng)心、回陽救逆之效。臨床常用于膿毒癥而癥見胸悶、氣促、悸動不安、動則尤甚等心陽不足證候者。已有的研究發(fā)現(xiàn)參附注射液具有抗缺血再灌注損傷、改善心臟功能、抗休克、增強心肌收縮力等作用。江榮林等[9]臨床研究表明，參附注射液可改善膿毒癥患者的組織氧代謝。邱澤亮等[10]則發(fā)現(xiàn)參附注射液可以降低嚴(yán)重膿毒癥患者急性生理和慢性健康狀況評分（acute physiology and chronic health evaluation，APACHE）II、Marshall評分及IL-6和CRP水平，明顯升高CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞HLA－DR，提示參附注射液具有維持促炎/抗炎平衡，雙向調(diào)節(jié)嚴(yán)重膿毒癥免疫紊亂作用。本研究顯示，與模型組比較，參附組大鼠心肌Bcl-2 mRNA表達(dá)較模型組上調(diào)，細(xì)胞凋亡明顯減少，心肌損傷酶學(xué)指標(biāo)較模型組降低。認(rèn)為參附注射液可以通過上調(diào)心肌細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)，下調(diào)Bax mRNA表達(dá)，減少膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡的機制，改善膿毒癥相關(guān)的心肌損傷。

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（收稿：2015-04-08 修回：2015-07-07）

Effect of Shenfu Injection on the Expression of Bcl-2 and Bax in Rats with Sepsis

HU Dandan,XU Huil－ian,LOU Liming. Department of Respiratory Diseases,Third Affilated Hospital of Zhejiang Traditional Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China

ObjectiveTo investigate the effect of Shenfu injection on the expression of BCL-2 and Bax and myocardial cellapoptosis in rat models with sepsis,in order to elucidate the anti-myocardial injurymechanism of Shengfu Injection.MethodsTwenty-fourmale SD rats were randomly divided 3 groups:sham-operated group（n=8）, model group（n=8）and Shenfu group（n=8）.Rat sepsis models were established through cecal ligation and puncture. Myocardial creatine kinase（CK）and itsisozyme（CK-MB）levels in plasma were detected in 24 h after sepsis,myocardial apoptosis were detected by TUNEL（TdT dUTP nick and labelling）technique,and the expression of Bcl-2 mRNA and Bax mRNA in myocardial cells were detected by RT-PCR.ResultsCompared with sham-operated group,CK and CK-MB levels in model group and Shenfu group were higher with a significant difference（CK-MB: 4208.51±382.57U/L,3584.59±347.06U/L vs 2187.41±556.63U/L;CK:3216.75±565.42U/L,1986.21±366.73U/L vs 1189.40±245.87U/L;all P＜0.05）;CK and CK-MB in model group were higher than those in Shenfu group（P＜0.05）.Myocardial cellapoptosis was observed in 3 groups;the mean optical density in model group and Shengfu group was higher than that in sham-operated group（0.24±0.11,0.18±0.09 vs 0.09±0.05,P＜0.05）and that in Shenfu group was lower than that in model group（P＜0.05）.The expression of Bcl-2 mRNA in myocardial cells in model group and Shenfu group was lower than that in sham-operated group[（3.83±0.07）×10-3,（4.86±0.08）×10-3vs（5.75± 0.09）×10-3,P＜0.05];that in Shenfu group was higher than that in model group（P＜0.05）.The expressionof Bax mR－NA in myocardial cells in model groupand Shenfu group was higher than that in sham-operated group[（7.12±0.08）×10-3,（6.26±0.06）×10-3vs（4.61±0.05）×10-3,P＜0.05];that in Shenfu group was lower than that in model group （P＜0.05）.ConclusionShengfu injection canalleviatesepsis-induced myocardial injury in rats through increasing Bcl-2 mRNA and decreasing Bax mRNAand reducing myocardialapoptosis.

rats;sepsis;myocardium;Bcl-2;Bax;Shenfu injection

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No.2009CA041）；浙江省自然科學(xué)基金（No.LY12H15004）

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸科（杭州 310005）

樓黎明，Tel：0571-88393529