1株具促生作用的氫氧化細(xì)菌的分離及鑒定

李忠玲 周曉倫 王衛(wèi)星 牛李瑩 萬建新 王衛(wèi)衛(wèi)

摘要：為了從沙打旺（Astragalus adsurgens Pall.）根際土壤分離具有促生潛力的氫氧化細(xì)菌，鑒定其種屬并研究其促生機(jī)制，利用連續(xù)通氫裝置分離篩選氫氧化細(xì)菌，Salkowski比色法測定產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）能力，2，4-二硝基苯肼法測定1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶活性，通用CAS平板法檢測鐵載體產(chǎn)生，再結(jié)合16S rDNA序列分析和生理生化試驗(yàn)結(jié)果鑒定細(xì)菌種屬。結(jié)果表明，篩選出1株具有較高促生潛力的氫氧化細(xì)菌SDW-16，該菌株具有分泌鐵載體的能力，產(chǎn)IAA的量為21.62 μg/mL，ACC脫氨酶活性為8 694.55 nmol/（mg·h）。結(jié)合生理生化和16S rDNA序列（GenBank登錄號(hào)：KF835389）分析，鑒定其為熒光假單胞菌。菌株SDW-16具有多項(xiàng)促生特征且均高于或達(dá)到了其他報(bào)道中相關(guān)水平，說明菌株SDW-16有較高的促生潛力和研究價(jià)值，同時(shí)也初步闡明氫氧化細(xì)菌的促生機(jī)制。在熒光假單胞菌中發(fā)現(xiàn)氫氧化細(xì)菌尚屬首次，豐富了人們對(duì)氫氧化細(xì)菌分類地位的認(rèn)識(shí)。

關(guān)鍵詞：氫氧化細(xì)菌；鐵載體；IAA；ACC脫氨酶

中圖分類號(hào)： Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0500-03

E-mail：610253095@qq.com。

通信作者：王衛(wèi)衛(wèi)，博士，教授，主要從事豆科植物-根瘤菌共生固氮生態(tài)生理學(xué)及根際微生物多樣性研究。E-mail：wwwang@nwu.edu.cn。

定植于植物根際、能對(duì)植物生長發(fā)育產(chǎn)生積極促進(jìn)作用的細(xì)菌稱為植物根際促生菌[1-2]。植物根際促生菌有直接和間接2種方式促進(jìn)植物生長，直接方式包括固氮作用、產(chǎn)生植物生長激素、分泌鐵載體、溶磷、合成1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶等，間接方式包括產(chǎn)生抗生素、與病原菌競爭根際有限的營養(yǎng)與空間、增強(qiáng)植物抗性等[3]。鑒于植物根際促生菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域的巨大應(yīng)用潛力，優(yōu)勢植物根際促生菌的分離鑒定已經(jīng)成為非常有價(jià)值的一項(xiàng)工作。

豆科作物的輪作、間作效益多被歸功于根瘤菌的固氮作用，而已有研究表明，僅有約25%的增產(chǎn)效益與固氮作用相關(guān)[4-5]。王瑾等通過對(duì)固氮過程中放氫現(xiàn)象和根際微生物群落變化的研究，提出了“氫肥”的概念，即不含吸氫酶（without uptake hydrogenase，HUP-）的根瘤菌在固氮過程中釋放的氫氣能促進(jìn)根際氫氧化細(xì)菌的生長進(jìn)而促進(jìn)植物生長[6-7]。氫氧化細(xì)菌已被歸類為植物根際促生菌，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有廣闊的應(yīng)用前景，因此開展與其相關(guān)的研究工作很有必要。

但是，目前關(guān)于氫氧化細(xì)菌的研究工作并不充分，雖然以前也有關(guān)于氫氧化細(xì)菌的研究，但是把氫氧化細(xì)菌作為一類植物根際促生菌，并進(jìn)一步分析其促生特征的研究鮮有報(bào)道。本研究利用氣體循環(huán)培養(yǎng)體系從豆科植物沙打旺（Astragalus adsurgens Pall.）根際土壤分離氫氧化細(xì)菌，從吲哚乙酸（IAA）、鐵載體、ACC脫氨酶等方面探究其促生機(jī)制，結(jié)合16S rDNA序列分析和生理生化分析確定其分類地位，以期為發(fā)現(xiàn)有潛在促生價(jià)值的菌株，以及氫氧化細(xì)菌的促生機(jī)制探究作出一定貢獻(xiàn)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株SDW-16，筆者所在實(shí)驗(yàn)室從沙打旺根際土壤分離。

1.1.2主要試劑和儀器ACC、D-葡萄糖酸、α-丁酮酸，購自Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。VIS-7220N可見光分光光度計(jì)，購自北京瑞利分析儀器公司。

1.2培養(yǎng)基

MSA培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[8]配制；KingB-Trp培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[9]配制，并添加終濃度為100 mg/L的L-TrP；DF無氮培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[10]配制；DF含氮培養(yǎng)基即在DF培養(yǎng)基中加入3.0 mmol/L ACC；CAS鐵載體檢測培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[11]配制；MKB培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[12]配制。

1.3氫氧化細(xì)菌的分離篩選

取10 g土樣轉(zhuǎn)移到裝有90 mL無菌水的錐形瓶中，置于搖床中，180 r/min、30 min搖勻，吸取0.1 mL上層懸浮液加入0.9 mL無菌水中混勻，進(jìn)行一系列10倍梯度的稀釋，最終稀釋倍數(shù)為10-12。從每個(gè)梯度取0.1 mL土壤稀釋液于MSA無機(jī)鹽平板培養(yǎng)基上稀釋涂布，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)。平板倒置于連續(xù)通氫裝置（電解水制氫，濃度為0.416～2.42 mmol/L）中，于30 ℃培養(yǎng)14 d。分離的氫氧化細(xì)菌進(jìn)行植物促生試驗(yàn)，篩選出具有較高促生潛力的氫氧化細(xì)菌，進(jìn)一步研究其促生特性。

1.4促生特征的鑒定

1.4.1吲哚乙酸含量檢測將待測菌株接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，取1.0 mL菌液離心（5 000 r/min、10 min）后棄上清，用無菌水洗滌2次，然后用無菌水稀釋10倍。從上述菌懸液取0.1 mL（約107 CFU）接種到50 mL KingB-Trp（L-Trp終濃度為100 mg/L）培養(yǎng)基，于30 ℃、180 r/min搖床中避光培養(yǎng)72 h。

IAA含量測定根據(jù)文獻(xiàn)[13]中的Salkowski比色法。菌株培養(yǎng)液于10 000 r/min離心10 min，取2.0 mL上清液加入避光的凍存管中與2.0 mL Salkowski試劑（1.015 g FeCl3·6H2O，150 mL H2SO4，250 mL ddH2O）混勻，室溫暗處放置 20 min，然后在530 nm波長下測定吸光度。IAA濃度計(jì)算參照IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線（濃度10～100 μg/mL），每株菌3個(gè)重復(fù)。

1.4.2ACC脫氨酶活性檢測ACC脫氨酶陽性菌株的篩選根據(jù)其能否利用ACC為唯一氮源生長，這被看作細(xì)菌具有ACC脫氨酶活性的特征。待測菌株分別接種到DF含氮培養(yǎng)基和DF無氮培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)3 d。無法在DF無氮培養(yǎng)基上生長，但能在添加3.0 mmol/L ACC為唯一氮源的DF含氮培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌則視為ACC脫氨酶陽性菌株。α-丁酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及ACC脫氨酶活性的定量測定參照文獻(xiàn)[10]中的2，4-二硝基苯肼比色法，ACC脫氨酶活性以 1 mg 菌體蛋白1 h利用ACC產(chǎn)生的α-丁酮酸的量表示。

1.4.3鐵載體檢測細(xì)菌分泌鐵載體的定性檢測參照通用CAS平板法[14]，并加以改進(jìn)，將檢測培養(yǎng)基分為2層，下層為供細(xì)菌生長的MKB無鐵培養(yǎng)基，上層為CAS檢測培養(yǎng)基，細(xì)菌在MKB無鐵培養(yǎng)基產(chǎn)生明顯菌落后，將CAS檢測培養(yǎng)基倒入上述平板，放置一段時(shí)間后可見平板顏色從藍(lán)色變?yōu)殚冱S色，證明有鐵載體產(chǎn)生，對(duì)照為不接菌的檢測平板。

1.5菌株的鑒定

1.5.1細(xì)菌形態(tài)特征和生理生化特征鑒定細(xì)菌的形態(tài)和生理生化特征鑒定參照文獻(xiàn)[15-16]中的標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行。

1.5.216S rDNA序列測定待測菌株送至生工生物工程（上海）服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。將得到的16S rDNA序列錄入NCBI網(wǎng)站，與已知的序列比對(duì)并分析同源性。用MEGA 5.1軟件和鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果分析

2.1氫氧化細(xì)菌的分離純化

根據(jù)氫氧化細(xì)菌獨(dú)特的代謝特點(diǎn)，選取不含碳源的MSA無機(jī)鹽培養(yǎng)基分離篩選氫氧化細(xì)菌，在H2、CO2、O2組成的混合氣體環(huán)境中，只有氫氧化細(xì)菌才能利用H2為能源固定CO2為碳源進(jìn)行化能自養(yǎng)生長。在MSA無機(jī)鹽固體平板上于 30 ℃ 培養(yǎng)14 d后，從平板上挑取不同形態(tài)的單菌落進(jìn)一步劃線純化，按照文獻(xiàn)[17]中的TTC試驗(yàn)法對(duì)其進(jìn)行吸氫酶的定性檢測，得到15株氫氧化細(xì)菌，根據(jù)促生試驗(yàn)結(jié)果篩選出Pseudomonas fluorescens SDW-16具有較高的促生潛力。

2.2吲哚乙酸含量的檢測

IAA是一種重要的植物激素，在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育中起重要作用，很多植物根際促生菌能分泌IAA對(duì)植物生長產(chǎn)生積極的影響。在KingB-Trp培養(yǎng)基中于30 ℃培養(yǎng)72 h后，按上述方法測得菌株SDW-16產(chǎn)生IAA的量為（21.62±0.30） μg/mL。

2.3ACC脫氨酶活性的檢測

3討論

植物根際促生菌能有效促進(jìn)植物生長，且不會(huì)像傳統(tǒng)化學(xué)肥料引起環(huán)境污染等問題，其在世界上一些地區(qū)的實(shí)際應(yīng)用中取得了良好的效果，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中有巨大的潛力，與其相關(guān)的研究已得到重視[18]。王瑾等的研究已經(jīng)證實(shí)，氫氧化細(xì)菌也屬于一類根際促生菌，而且通過大田試驗(yàn)和實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用證實(shí)了氫氧化細(xì)菌的促生能力[6]。氫氧化細(xì)菌獨(dú)特的代謝特點(diǎn)使其成為根際促生菌家族中的獨(dú)特種群，豆科植物中有很多是重要的經(jīng)濟(jì)作物，其根瘤附近的富氫環(huán)境非常適宜氫氧化細(xì)菌生長，因此筆者選擇豆科植物沙打旺根際土壤為研究材料，通過連續(xù)通氫裝置模擬豆科植物根際的富氫環(huán)境，并利用不含碳源的MSA無機(jī)鹽培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行富集和分離，高促生潛力氫氧化細(xì)菌的研究工作對(duì)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)尤其是豆科作物的增產(chǎn)有廣闊的應(yīng)用前景。

結(jié)合16S rDNA序列及生理生化特征結(jié)果進(jìn)行分析，氫氧化細(xì)菌SDW-16 被鑒定為熒光假單胞菌（P. fluorescens），

在熒光假單胞菌中發(fā)現(xiàn)氫氧化細(xì)菌尚屬首次，這一發(fā)現(xiàn)能豐富人們對(duì)氫氧化細(xì)菌分類地位的認(rèn)識(shí)。熒光假單胞菌是一種重要的植物根際促生菌，SDW-16的促生特征分析很好地印證了這一點(diǎn)，其具有多項(xiàng)植物根際促生菌具備的重要促生特征，尤其是具有很高的ACC脫氨酶活性，植物在干旱、水災(zāi)、鹽堿等逆境條件中會(huì)產(chǎn)生過量乙烯抑制其生長，ACC脫氨酶能裂解乙烯的前體ACC為氨和α-丁酮酸，降低植物體內(nèi)乙烯水平，減輕對(duì)植物生長[JP3]的損害，所以產(chǎn)生ACC脫氨酶是重要的促生機(jī)制之一[19]。氫氧化細(xì)菌SDW-16的ACC脫氨酶活性高達(dá)8 694.55 nmol/（mg·h），遠(yuǎn)高于魏素娜等研究中AS[1 116 nmol/（mg·h）、CS （1 002 nmol/（mg·h） ]2株菌[20]；高于Grichko等研究中所有的ACC脫氨酶陽性菌株[21-22]；高于Rashid等研究中68%的ACC脫氨酶陽性株菌，與菌株YsS3[8 580 nmol/（mg·h）]的酶活相當(dāng)[23]。本研究表明，ACC脫氨酶活性在2 100～5 200 nmol/（mg·h） 之間的菌株能明顯促進(jìn)番茄和油菜的生長，并顯著增加其抗?jié)承院湍望}性[21，24]，而吉云秀等研究中證實(shí)PGPR的促生效果與ACC脫氨酶活力呈顯著正相關(guān)性[22]，可見就ACC脫氨酶活性而言氫氧化細(xì)菌SDW-16有很高的促生潛力。

IAA在植物生長發(fā)育過程中起重要作用，微生物包括細(xì)菌、真菌也能產(chǎn)生IAA。氫氧化細(xì)菌SDW-16產(chǎn)生IAA的量為21.62 μg/mL，達(dá)到了較高水平，高于Jalili等研究中全部菌株的產(chǎn)量[24]，高于Tsavkelova等研究中63.6%的IAA陽性菌株[25]，而本研究中添加的Trp終濃度為 200 mg/L。在KingB-Trp培養(yǎng)液中加入IAA的前體物質(zhì)色氨酸可以促進(jìn)IAA的產(chǎn)生。IAA含量測定選在菌株培養(yǎng)72 h后，因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)菌處于穩(wěn)定期，培養(yǎng)液中IAA含量最高，IAA見光易分解，所以相關(guān)步驟采取避光措施以減少對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾。

鐵載體是細(xì)菌在鐵缺乏環(huán)境中分泌的一種對(duì)Fe3+有很強(qiáng)特異螯合作用的低分子量化合物，在鐵脅迫環(huán)境中鐵載體產(chǎn)生菌可以分泌鐵載體螯合周圍的Fe3+，從而促進(jìn)自身生長[26]；同時(shí)還能抑制病原菌吸收Fe3+，通過抑制病原菌的生長間接促進(jìn)植物生長。CAS 檢測平板由藍(lán)色變?yōu)殚冱S色表明，菌株SDW-16具有分泌鐵載體的能力。

綜上所述，氫氧化細(xì)菌SDW-16具有分泌IAA、產(chǎn)鐵載體和ACC脫氨酶3項(xiàng)重要的促生特征，從已發(fā)表文獻(xiàn)中相關(guān)菌株的比較來看，其分泌IAA能力和ACC脫氨酶活性均高于或達(dá)到相關(guān)菌株的水平，說明氫氧化細(xì)菌SDW-16有很高的促生潛力和研究價(jià)值。氫氧化細(xì)菌對(duì)植物的促生能力可能與IAA、產(chǎn)鐵載體、ACC脫氨酶有關(guān)，后續(xù)工作要開展驗(yàn)證其實(shí)際促生效果的研究，如盆栽和田間試驗(yàn)等，為以后將其作為生產(chǎn)微生物肥料的優(yōu)質(zhì)菌種和應(yīng)用于實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

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