銅綠假單胞菌Gxun-2 產(chǎn)鐵載體發(fā)酵條件優(yōu)化及其抑菌效果

李樞妍，何艷麗，宋超東，黃夏至，陸君銘，李時勇，張紅巖，申乃坤,*，姜明國

（1.廣西民族大學海洋與生物技術(shù)學院，廣西多糖材料與改性重點實驗室，廣西南寧 530008；2.西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，陜西楊陵 712100）

鐵元素因可參與生命體電子傳遞以及生理生化代謝反應(yīng)等多種生命活動，成為大多數(shù)生物生長需要所必需的微量元素，雖然鐵在地殼中含量較高，但在自然條件下易被氧化為溶解性極差的氧化鐵或生成沉淀，轉(zhuǎn)變?yōu)闅溲趸F，并不能直接被生物體吸收，導致作物出現(xiàn)缺鐵現(xiàn)象[1]。鐵載體（Siderophore）是微生物合成并分泌的一種對鐵有高親和性的低分子量化合物，對Fe3+具有超強的螯合作用，可以螯合環(huán)境中的鐵離子以攝取鐵元素[2]。而植物根際促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）可在缺鐵條件下分泌鐵載體，幫助微生物從環(huán)境中吸收Fe3+，增加環(huán)境中Fe3+移動，微生物分泌鐵載體螯合環(huán)境中的Fe3+被認為是植物的有效鐵來源的主要途徑之一，從而促進植物生長[3-4]。此外，分泌鐵載體的細菌通過與植物病原菌競爭鐵離子，從而抑制病原菌生長[5-7]。如甘蔗和黑麥草根內(nèi)的大腸桿菌分泌鐵載體，從而促進了甘蔗和黑麥草的生長[8]；從泰國水稻根中分離出的內(nèi)生鏈霉菌GMKU3100 產(chǎn)生的鐵載體能促進水稻和綠豆生長，顯著提高根莖生物量和長度[9]。在病原菌侵染植物過程中，植物細胞周圍堅硬的細胞壁限制了病原菌在細胞內(nèi)的繁殖，但病原菌可以分泌大量的細胞壁降解酶和效應(yīng)蛋白，損傷植物細胞并從中獲得營養(yǎng)物質(zhì)，包括從寄主植物中獲取鐵元素以用于自身的生長繁殖。植物免疫系統(tǒng)嚴密調(diào)控著體內(nèi)鐵的穩(wěn)態(tài)，限制病菌獲取大量的鐵元素，從而抑制病原菌的侵染。植物除了可以利用微生物分泌的鐵載體滿足自身生長發(fā)育外，還可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)，限制病原菌的鐵吸收，抑制病原菌的侵染[10-13]。鐵載體還在環(huán)境保護、微生物生態(tài)和醫(yī)療等方面都有著重要的影響[14-17]。因此，高產(chǎn)鐵載體菌株的分離和條件優(yōu)化具有重要的意義。

在微生物代謝過程中，培養(yǎng)基和發(fā)酵條件對菌體生長、產(chǎn)物合成及代謝物產(chǎn)量均有重要的影響，因此，對高產(chǎn)鐵載體的菌株進行培養(yǎng)條件優(yōu)化十分重要。吳嶺等[18]對菌株WJ-3 進行產(chǎn)鐵載體條件優(yōu)化后，產(chǎn)生的鐵載體螯合劑的合成率可達64.42%；伊鳳嬌[19]對解淀粉芽孢桿菌Y14 產(chǎn)鐵載體能力優(yōu)化后，鐵載體活性單位達到62.09%，與最初的42.71%相比有明顯的提高。楊常娥等[20]篩選得到的創(chuàng)傷弧菌V.vulnificusY8 經(jīng)優(yōu)化后的平均鐵載體活性單位為89.68%，較優(yōu)化前提高了23.73%。菌株Gxun-2為本實驗室前期從香蕉根際土壤分離得到的一株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），可分泌鐵載體，對香蕉枯萎病的病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumf.sp.cubense，F(xiàn)OC4）具有良好的防病作用[21]，且對香蕉植株具有一定的促生效果。但目前對銅綠假單胞菌產(chǎn)鐵載體條件優(yōu)化研究還未見報道。

本研究先對P.aeruginosaGxun-2 產(chǎn)鐵載體類型進行分析，進一步對該菌株產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，最后對優(yōu)化前后鐵載體發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌（FOC4）的抑制效果進行比較。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）Gxun-2 分離自健康香蕉根際土壤[12]，現(xiàn)保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC No：61615；供試病原菌香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌（FOC4）分離自香蕉發(fā)病植株，鑒定并保藏于本實驗室；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉 上海源葉生物科技有限公司；琥珀酸鈉培養(yǎng)基（g/L）：琥珀酸鈉4.0，K2HPO46.0，KH2PO43.0，（NH4）2SO41.0，MgSO4·7H2O 0.2，pH7.2；琥珀酸鈉培養(yǎng)基+甘油（g/L）：琥珀酸鈉4.0，K2HPO46.0，KH2PO43.0，（NH4）2SO41.0，MgSO4·7H2O 0.2，甘油15.0，pH7.2；MKB 培養(yǎng)基（g/L）：酸水解酪蛋白氨基酸5.0，K2HPO42.5，MgSO4·7H2O 1.5，甘油15.0，pH7.0；蔗糖-天冬氨酸（MSA）培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖20.0，天冬氨酸2.0，K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，pH7.2。

Epoch 全自動酶標儀 美國伯騰公司；BSP-150 生化培養(yǎng)箱 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)鐵載體的檢測 參考Schwyn 等[22]的研究方法進行鐵載體檢測，將Gxun-2 菌株接種至CAS瓊脂培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落周圍顏色變化。采用Baakza 等[23]的方法對Gxun-2 產(chǎn)鐵載體類型進行檢測。

1.2.2 菌株Gxun-2 產(chǎn)鐵載體發(fā)酵培養(yǎng)基單因素實驗 將Gxun-2 種子液以1%（v/v）的接種量分別接入到LB、MKB、蔗糖-天冬氨酸、琥珀酸鈉以及琥珀酸鈉+甘油的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min 以及裝液量100/250 mL、自然pH 條件下培養(yǎng)3 d，測定不同發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)鐵載體活性單位，篩選最優(yōu)初始發(fā)酵培養(yǎng)基。在確定初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別考察碳源種類（10.0 g/L 的甘油、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖和果糖）及碳源濃度（0、5、10、15、20、25 g/L）、琥珀酸鈉濃度（0、2、4、6、8、10 g/L）、氮源種類（1 g/L 玉米漿、酵母粉、尿素、氯化銨和硫酸銨）及氮源濃度（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L）、無機鹽種類（0.4 g/L的KCl、NaCl、CaCl2、海鹽和ZnSO4）及無機鹽濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）對菌株Gxun-2 產(chǎn)鐵載體Su 的影響。每組設(shè)3 個平行，結(jié)果取平均值。

1.2.3 菌株Gxun-2 產(chǎn)鐵載體發(fā)酵條件單因素優(yōu)化確定菌株Gxun-2 最優(yōu)培養(yǎng)基組分后，以單因素實驗分別考察發(fā)酵初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）、發(fā)酵時間（12、24、36、48、60、72、84 h）、發(fā)酵溫度（25、30、33、35、37、40 ℃）、裝液量（20、40、60、80、100、120、140、160、180 mL/250 mL）、接種量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，（v/v））對菌株產(chǎn)鐵載體活性單位（Su）的影響。

1.2.4 Plackett-Burman（PB）試驗及正交試驗 根據(jù)單因素實驗的9 個因素，采用PB 設(shè)計對關(guān)鍵影響菌株Gxun-2 產(chǎn)鐵載體Su 因素進行篩選，試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。選取PB 試驗中影響較大的4 項因素，進行4 因素3 水平L9（34）的正交試驗，試驗設(shè)計見表2，從而確定產(chǎn)鐵載體的最佳工藝。

表1 Plackett-Burman 試驗設(shè)計Table 1 Design of Plackett-Burman experimental

表2 L9（34）正交試驗因素水平設(shè)計Table 2 Design of L9(34) orthogonal

1.2.5 鐵載體活性單位（Su）測定 鉻天青（chrome azurol sulfonate，CAS）檢測液的配制：溶液A：準確稱取CAS 0.079 g 溶于50 mL 去離子水中，再向其中加入1 mmol/L FeCl3溶液（HCl 配制）10 mL；溶液B：準確稱取十六烷基三甲基溴化銨（HDTMA）0.069 g 溶于40 mL 的去離子水中；將溶液A 沿燒杯壁緩緩加入溶液B 中，攪拌混勻即得CAS 藍色檢測液[24]。

取發(fā)酵液2 mL，在12000 r/min，室溫條件下離心2 min，保留上清液。將1 mL 上清液與1 mL CAS檢測液混合，用去離子水稀釋定容至15 mL，反應(yīng)1 h 后在紫外可見分光光度計630 nm 處測量吸光度值（As），以無菌的培養(yǎng)基作為參比值（Ar），定量測定菌株的產(chǎn)鐵量鐵載體能力，即鐵載體活性單位[25]。

式中：Su 表示鐵載體活性單位；As 表示Gxun-2發(fā)酵上清液在紫外可見分光光度計630 nm 處的吸光度值；Ar 表示無菌培養(yǎng)基在紫外可見分光光度計630 nm 處的吸光度值。

1.2.6 菌株Gxun-2 對FOC4 的抑菌效果測定 采用平板對峙法測定抑菌效果，以尖孢鐮刀菌為靶標菌，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。觀察菌株Gxun-2 鐵載體發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌的抑制效果，計算抑菌率[26]。

式中：D 表示對照組靶標菌菌直徑；d 表示試驗組靶標菌菌落直徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個試驗設(shè)計3 個平行，結(jié)果取平均值。本研究使用IBM SPSS Statistics 21.0 對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和顯著性分析（P＜0.05），利用Design-Expert 10 軟件對PB 試驗數(shù)據(jù)進行分析，用GraphPad Prism 8 進行圖形的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Gxun-2 產(chǎn)鐵載體的定性檢測分析

菌株Gxun-2 在培養(yǎng)CAS 檢測平板上培養(yǎng)2 d后，菌落周圍有明顯的橙黃色暈圈生成。證明菌株Gxun-2 能產(chǎn)生鐵載體以螯合培養(yǎng)基中的鐵（圖1），進一步對產(chǎn)鐵載體類型進行檢測，在高氯酸鐵試驗中，由Gxun-2 制備的鐵載體溶液顏色能夠立即發(fā)生變化呈紅色，并在495 nm 處出現(xiàn)吸收峰，這說明菌株Gxun-2 能分泌異羥肟酸型（hydroxamates）鐵載體。

圖1 菌株Gxun-2 CAS 平板檢測結(jié)果Fig.1 CAS plate test result of strain Gxun-2

2.2 菌株Gxun-2 產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基成分優(yōu)化

由圖2A 可知，以琥珀酸鈉培養(yǎng)基＋甘油為基礎(chǔ)培養(yǎng)基時，鐵載體活性單位（Su）為44.40%±0.31%，顯著高于其他幾個培養(yǎng)基的Su（P＜0.05）。因此，選擇琥珀酸鈉培養(yǎng)基＋甘油為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行下一步優(yōu)化。碳源優(yōu)化結(jié)果表明，菌株Gxun-2 分泌鐵載體的最適碳源為甘油（圖2B）；進一步對甘油濃度進行優(yōu)化結(jié)果表明，當甘油添加量為5 g/L 和10 g/L 時，Su 分別達76.60%和77.05%，顯著高于對照組（Su 7.52%）（P＜0.05），表明甘油在鐵載體形成中具有重要的作用。但添加5 g/L 和10 g/L 甘油時，菌株的Su 無差異顯著性（P＞0.05），因此，甘油的最適添加濃度為5 g/L（圖2C）。這與Santos 等[27]報道巨大芽孢桿菌添加甘油會促進鐵載體產(chǎn)生結(jié)果類似，其優(yōu)化后鐵載體產(chǎn)量達到1182 μmol/g（干重）。添加琥珀酸鈉也可顯著提高菌株Gxun-2 產(chǎn)鐵載體能力，但當添加濃度為4 g/L（Su 73.80%）和6 g/L（Su 78.29%）時無顯著性差異（P＞0.05），因此，琥珀酸鈉的最佳添加濃度為4 g/L（圖2D）。Rachid 等[28]的研究也表明P.fluorescensP5-18 的生長和產(chǎn)生鐵載體的能力取決于培養(yǎng)基中鐵的含量和碳源的類型，其在添加琥珀酸鈉培養(yǎng)基中產(chǎn)生的鐵載體量最高。氮源是合成細菌蛋白質(zhì)、核酸等含氮物質(zhì)和鐵載體的來源。氮源優(yōu)化結(jié)果表明菌株Gxun-2 既能利用有機氮源（玉米漿、酵母粉），也能利用無機氮源（氯化銨、硫酸銨、尿素），除玉米漿產(chǎn)鐵載體較低外（Su 47.31%），其他幾種氮源對鐵載體影響并無差異顯著性（P＞0.05），考慮生產(chǎn)成本，選擇硫酸銨做為菌株Gxun-2 產(chǎn)鐵載體最佳氮源（圖2E）。進一步硫酸銨濃度優(yōu)化結(jié)果為1.0 g/L，此時菌株Su 高達73.99%，是未加硫酸銨對照組的4.8 倍（圖2F）。無機鹽同樣對菌株Gxun-2 產(chǎn)鐵載體的能力有影響，海鹽和硫酸鎂的鐵載體含量明顯大于其他無機鹽，且二者之間無顯著性差異，考慮生產(chǎn)成本，選擇海鹽作為菌株Gxun-2 發(fā)酵培養(yǎng)基的無機鹽，最適添加量為0.4 g/L，Su 最高可達76.30%（圖2G～圖2H）。

圖2 培養(yǎng)基成分對菌株Gxun-2 產(chǎn)鐵載體的影響Fig.2 Effects of media composition on strain siderophore of strain Gxun-2

2.3 菌株Gxun-2 產(chǎn)鐵載體發(fā)酵條件優(yōu)化

當發(fā)酵初始pH 在6.5～8.5，Su 并無顯著差異（P＞0.05），但當初始pH＜6.0 時，菌株產(chǎn)鐵載體能力顯著降低，可能是由于過低的pH 影響了菌體生長和代謝。因此將菌株發(fā)酵的初始pH 控制在6.5～8.5（圖3A）。發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)鐵載體的影響如圖3B 所示，隨著發(fā)酵時間延長，Su 逐漸增加，72 h時達到最高值（Su 77.13%），進一步延長發(fā)酵時間，Su 反而下降。因此，菌株產(chǎn)鐵載體的最適發(fā)酵時間為72 h。發(fā)酵溫度對菌株Su 影響較大，當發(fā)酵溫度低于35 ℃時，Su 隨發(fā)酵溫度升高而增加；但當溫度高于35 ℃時，Su 顯著降低（P＜0.05），因此確定35 ℃為菌株Gxun-2 產(chǎn)鐵載體的最適發(fā)酵溫度（Su 78.00%±0.28%）（圖3C）。由圖3D 可知，當裝液量為140/250 mL 時，Su 最高為77.14%，裝液量120 mL/250 mL 次之，Su 為75.81%±0.33%，但兩者無顯著性差異（P＞0.05），綜合考慮確定裝液量為140 mL/250 mL。接種量在0.5%～3.0%（v/v）時，對菌株的Su 并無顯著性影響，因此選擇1%（v/v）為該菌株最佳產(chǎn)鐵載體接種量（圖3E）。

圖3 發(fā)酵條件對菌株產(chǎn)鐵載體的影響Fig.3 Effects of fermentation conditions on siderophore production in strains

2.4 Packett-Burman 試驗分析

利用Design-Expert 10 軟件對PB 試驗數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果見表3。各影響因子顯著性排序為：G＞C＞B＞A＞E＞H＞F＞J＞D。其中G、C、B、A、E、H具有顯著性（表4），表明這6 個因素即發(fā)酵初始pH、硫酸銨濃度、琥珀酸鈉濃度、甘油濃度、發(fā)酵時間和接種量是影響菌株產(chǎn)鐵載體的重要因素，選擇影響較大的4 個因素，即發(fā)酵初始pH、甘油、琥珀酸鈉及硫酸銨濃度進行下一步正交試驗。

表3 Plackett-Burman 試驗設(shè)計和結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experimental

表4 Plackett-Burman 試驗各因素顯著性分析Table 4 Significance analysis of each factor in Plackett-Burman

2.5 正交試驗分析

4 因素3 水平正交試驗結(jié)果（表5）表明，各因素對菌株產(chǎn)鐵載體的影響的順序為：硫酸銨濃度＞初始pH＞琥珀酸鈉濃度＞甘油，且各影響因子最佳組合為：A2B1C2D1，即甘油10 g/L，琥珀酸鈉2 g/L，硫酸銨1 g/L，初始pH 為6.8。但最優(yōu)結(jié)果并未出現(xiàn)在正交表中，需要進行驗證試驗。菌株驗證試驗Su 結(jié)果為81.20%±0.24%，與預測值一致，表明正交試驗的準確性。優(yōu)化后Su 較優(yōu)化前（44.40%±0.31%）提高了82.84%±0.82%。

表5 正交試驗結(jié)果Table 5 Results of orthogonal experiment

近年來，對微生物產(chǎn)鐵載體的條件優(yōu)化的相關(guān)研究有很多，但因菌種不同，其生長情況和產(chǎn)鐵載體類型不同，鐵載體檢測方法和優(yōu)化結(jié)果也不同。陳偉等[29]在黑麥草根際土壤中篩選出一株鐵載體產(chǎn)生菌WN-H3，在最佳發(fā)酵工藝（蔗糖10 g/L，酵母浸出粉5 g/L，NaCl 5 g/L，初始pH7.5，溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵48 h）條件下，該菌株鐵載體Su 值可達80.4%。彭雯杰等[30]對分離出的阿斯青霉菌XK-12 工藝進行了優(yōu)化，獲得最佳發(fā)酵工藝為：添加NH4Cl 3 g/L、葡萄糖20 g/L、L-鳥氨酸 1g/L、初始pH6.0、發(fā)酵溫度28℃、發(fā)酵周期168 h，該菌株鐵載體最高可達0.173 mg/mL。與上述研究相比，菌株Gxun-2 產(chǎn)鐵載體的pH 范圍更廣，在pH6.5～8.5 條件下均能產(chǎn)生大量鐵載體，且該菌對溫度的適應(yīng)性更強，在30～37 ℃溫度下仍然能產(chǎn)生大量鐵載體，更利于在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用；同時，經(jīng)過優(yōu)化后菌株的培養(yǎng)中使用價格相對低廉的琥珀酸鈉和甘油為碳源，硫酸銨為氮源，海鹽為無機鹽，在提高菌株產(chǎn)鐵載體能力的同時，大大降低鐵載體發(fā)酵的成本，為該菌株在農(nóng)業(yè)的應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)。

2.6 菌株Gxun-2 產(chǎn)鐵載體發(fā)酵液對FOC4 的抑菌效果

平板對峙實驗研究結(jié)果表明，菌株Gxun-2 產(chǎn)鐵載體發(fā)酵工藝優(yōu)化前后對FOC4 的抑菌效果差別較大，優(yōu)化后發(fā)酵液對FOC4 的抑制效果顯著增加，抑菌率達70.60%±1.87%，較優(yōu)化前提高了52.68%±4.23%（圖4），這表明Gxun-2 及其優(yōu)秀的產(chǎn)鐵載體的能力在植物防病方面有巨大的應(yīng)用。這與前人從土壤中分離出的銅綠假單胞菌NJ-5 和RZS3 功能一致，通過減少根際微生物區(qū)系中可用的鐵離子數(shù)量來抑制病原菌的生長[31-33]。由此可見，鐵載體可以用于植物病原菌的防治，銅綠假單胞菌Gxun-2 在抗病促生長方面有著較大的應(yīng)用潛力。今后可對菌株產(chǎn)生的鐵載體進行分離、純化及結(jié)構(gòu)鑒定，從而進一步對解析鐵載體抑制病原菌的機理。

圖4 菌株Gxun-2 產(chǎn)鐵載體能力的增加對FOC4 的抑菌效果Fig.4 Inhibitory effects of Gxun-2 on FOC4 by increasing the siderophores-producing capacity

3 結(jié)論

本研究通過CAS 平板和全波段紫外光吸收法確定P.aeruginosaGxun-2 是一株高產(chǎn)異羥肟酸型鐵載體的菌株。獲得該菌株產(chǎn)鐵載體最佳發(fā)酵工藝為：琥珀酸鈉2 g/L、甘油10 g/L、硫酸銨1 g/L，初始pH6.8，溫度35 ℃、接種量1%（v/v）、裝液量140/250 mL。在此條件下，鐵載體活性單位（Su）可達81.20%±0.24%，較優(yōu)化前提高了82.84%±0.54%。優(yōu)化后菌株Gxun-2 對香蕉枯萎病病原菌FOC4 的抑菌率達70.60%±1.87%，較優(yōu)化前提高了52.68%±4.23%?？傊珿xun-2 具有良好產(chǎn)鐵載體和抑制植物病原菌的作用，經(jīng)發(fā)酵工藝優(yōu)化，顯著提高了菌株的鐵載體含量和抑菌能力，為今后該菌株在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)。

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