植物冷激蛋白的研究概況

楊雪 張東哲 吳疆

摘 要：在植物體內(nèi)合成的特定低溫應(yīng)激蛋白中，多數(shù)已經(jīng)被鑒定。近年來(lái)，研究的焦點(diǎn)主要集中在幾種特殊類(lèi)型的冷激蛋白，其中，植物抗凍蛋白保護(hù)細(xì)胞免受冰晶破壞，分子伴侶和脫水蛋白在冷脅迫期間保護(hù)細(xì)胞大分子不受損傷，線(xiàn)粒體內(nèi)解偶聯(lián)蛋白的氧化和磷酸化過(guò)程，可以使植物保持高于0℃一段時(shí)間，為隨后適應(yīng)低于0℃的環(huán)境做充分的準(zhǔn)備。

關(guān)鍵詞：植物；冷激蛋白；應(yīng)激蛋白

中圖分類(lèi)號(hào) Q946 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）22-0017-03

Abstract：In the plant，specific low temperature stress protein synthesized by the plant most have been identified. In recent years，the focus of the research is mainly concentrated in some special types of cold shock protein，such as the plant antifreeze proteins to protect cells from ice crystals，molecular chaperone and dehydration proteins to protect cell macromolecular damaged during cold stress，mitochondrial uncoupling protein oxidation and phosphorylation in process，will keep plants above 0℃ for a period of time，in order to adapt then below 0℃ environment.

Key words：Plant；Cold shock protein；Stress protein

植物適應(yīng)低溫的過(guò)程，是一個(gè)多種生化機(jī)制共同作用的結(jié)果，其中許多機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了深入的研究。這些機(jī)制包括脂質(zhì)和磷脂的代謝，不飽和脂肪酸[1]和的糖積累。這些代謝過(guò)程阻止植物細(xì)胞內(nèi)的冰致死[2]。

所有這些機(jī)制都擁有一個(gè)共同的特點(diǎn)，就是有多種多樣酶蛋白的參與。這些酶包括磷脂酶和脫氫酶參與的脂質(zhì)代謝[3-4]，蔗糖合成酶參與的細(xì)胞內(nèi)蔗糖的生物合成。植物冷適應(yīng)特性正式通過(guò)改變這些酶的生物合成和活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的，最終，都涉及到這些酶基因表達(dá)調(diào)控的改變[5-6]。低溫脅迫在抑制植物持家基因表達(dá)的同時(shí)誘導(dǎo)應(yīng)激蛋白的生物合成[7]。大量的研究表明，冷激蛋白不僅參與了植物細(xì)胞防御機(jī)制的形成，在植物耐受寒冷脅迫過(guò)程中也具有重要作用。

1 抗凍蛋白

植物在低溫下，特別是在低于0℃的溫度下合成的蛋白質(zhì)具有一個(gè)特殊的功能，就是防止細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。雖然低溫下植物細(xì)胞內(nèi)阻止冰核生長(zhǎng)主要是由于糖類(lèi)的積累[8]，但在低溫脅迫期間合成的特異性蛋白也影響了冰核和冰晶的生長(zhǎng)。例如，冬黑麥的葉片合成的一種分泌到液泡和細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)，就改變了冰晶生長(zhǎng)的類(lèi)型，并降低了細(xì)胞質(zhì)的冰點(diǎn)溫度[9]。冬黑麥能夠具有這樣的耐凍性，主要是由于合成了許多分子量在15～109kD的蛋白。免疫學(xué)分析表明這些蛋白質(zhì)的定位于葉肉細(xì)胞的外細(xì)胞壁的表面，木質(zhì)部導(dǎo)管的次生細(xì)胞壁，并在表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁。由于黑麥抗凍蛋白定位在可能的細(xì)胞接觸位點(diǎn)，其功能是作為一個(gè)屏障，防止冰凍影響細(xì)胞和抑制結(jié)晶的生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，冬小麥中第五號(hào)染色體控制了抗凍蛋白的生物合成和其抗寒性的提高[10]，通過(guò)SDS-電泳和免疫印跡確定了兩個(gè)抗凍蛋白，分子量分別為32kD和35kD，它們位于葉肉細(xì)胞的細(xì)胞壁和木質(zhì)部導(dǎo)管中。在進(jìn)過(guò)冷適應(yīng)的葉片中，這些蛋白質(zhì)定位在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體，質(zhì)膜的囊泡[11]。這些研究結(jié)果表明抗凍蛋白是通過(guò)胞外分泌途徑被定位在合適位點(diǎn)的。在植物體內(nèi)同樣也能夠發(fā)現(xiàn)分子量是25、32和35kD的蛋白，但這些蛋白的與抗凍蛋白的定位是完全不同的，同時(shí)這些蛋白質(zhì)對(duì)植物耐受低溫脅迫也不起任何作用。

2 分子伴侶與脫水蛋白

植物在低溫脅迫期間合成的蛋白質(zhì)具有另一個(gè)重要功能，就是對(duì)由細(xì)胞脫水誘導(dǎo)損傷大分子的保護(hù)。最初，分子伴侶的作用被認(rèn)為是幫助其它蛋白質(zhì)形成正確的空間立體結(jié)構(gòu)[12]。后來(lái)，分子量是60、70和90kD的分子伴侶被發(fā)現(xiàn)是熱激蛋白[13]，另一些分子伴侶為冷激蛋白。

大腸桿菌內(nèi)的一個(gè)分子伴侶表現(xiàn)出丙基異構(gòu)酶的活性，它與核糖體新生多肽相連接，結(jié)合形成CPN60（伴侶蛋白60）。與大多數(shù)伴侶不同，它是一個(gè)熱激蛋白，其生物合成受到一個(gè)觸發(fā)因子的影響，在溫度從42℃逐漸降低到16℃的過(guò)程中，它的表達(dá)量反而升高了。研究表明，這個(gè)觸發(fā)因子是一個(gè)冷激蛋白。這一研究結(jié)果表明，雖然熱激蛋白是在高溫下對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用，但是其生物合成受到冷激蛋白的觸發(fā)[14]。

在春小麥和冬小麥中，低溫馴化在相當(dāng)大的程度上影響了脫水蛋白和胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白質(zhì)（LEA）的表達(dá)[15]。脫水蛋白的主要功能是穩(wěn)定大分子結(jié)構(gòu)，這一功能與蛋白伴侶的作用非常相似[13]。從9月至11月，冬小麥細(xì)胞內(nèi)的脫水蛋白含量比春小麥中的顯著增高。經(jīng)過(guò)這樣的冷適應(yīng)過(guò)程，冬小麥細(xì)胞內(nèi)積累了大量的脫水蛋白，并使得冬小麥表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐寒性[16]。

冬小麥中的冷激蛋白（WCS120）是在冷適應(yīng)的過(guò)程中得到積累的[17]。這些蛋白質(zhì)是谷類(lèi)作物特有的，通過(guò)低溫控制其在細(xì)胞內(nèi)的含量。免疫學(xué)研究表明，50kD的WCS120至少涉及了5個(gè)WCS120家族[17]。同時(shí)，利用Western blotting研究WCS120蛋白質(zhì)的含量和細(xì)胞內(nèi)定位表明，這些WCS120家族都定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，在其他的細(xì)胞器和細(xì)胞壁上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。這些研究結(jié)果表明，WCS120的主要具有兩個(gè)生物學(xué)功能，一個(gè)是保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，另一個(gè)是在細(xì)胞核內(nèi)保護(hù)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。WCS120的高含量、高親水性以及其對(duì)熱的抗性，推測(cè)其在低溫環(huán)境中可以給細(xì)胞內(nèi)的生物大分子提供一個(gè)特定的微環(huán)境使細(xì)胞能夠抵抗低溫脅迫和冰凍脅迫。

利用Western blotting和Southern blotting技術(shù)對(duì)中國(guó)春小麥著絲粒端wcs120基因進(jìn)行雜交研究，表明該基因在所有受試小麥品種中定位于6號(hào)染色體的長(zhǎng)臂端。這一結(jié)果表明，wcs120基因定位于6DL染色體，并使得6A染色體同源基因沉默[18]。

研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物和細(xì)菌中，一些與DNA和RNA結(jié)合的CSP也是一種伴侶分子，特別是其中的CSPA注意作用于RNA[19]。并且，他們之間的結(jié)合不是序列特異性結(jié)合：CSPA與RNA序列中超過(guò)74個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的序列都會(huì)發(fā)生結(jié)合作用，從而阻止RNA在低溫下形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。這一功能很有可能對(duì)mRNA在低溫下進(jìn)行正常的翻譯起到了很好地保護(hù)作用。

許多細(xì)菌的CSP是RNA和DNA的調(diào)節(jié)蛋白，例如，大腸桿菌中的CSPA[20]，枯草芽孢桿菌中的CSPB、CSPC和CSPD，這些CSP都具有核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（冷休克域，CSD）。目前，已對(duì)RNA結(jié)合應(yīng)激蛋白進(jìn)行了大量研究，例如魚(yú)腥草中的RBPA1，大麥中的HAVGRP3。同時(shí)，越來(lái)越多的研究表明，與RNA結(jié)合的CSP不僅在轉(zhuǎn)錄水平，而且在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因的表達(dá)起了重要的調(diào)控作用[21]。

3 解偶聯(lián)蛋白（UCP）

冷激蛋白另一重要功能就是使機(jī)體對(duì)外界環(huán)境溫度變化產(chǎn)生防御能力，它可以在植物遇到低溫的第一時(shí)間提供短暫的熱量，以使植物可以有冷適應(yīng)的準(zhǔn)備時(shí)間。這一保護(hù)機(jī)制與線(xiàn)粒體氧化磷酸化的解偶聯(lián)機(jī)制密切相關(guān)，在哺乳動(dòng)物中以發(fā)現(xiàn)3個(gè)解偶聯(lián)蛋白：UCP1，UCP2，UCP3[22]。同樣的在馬鈴薯、冬黑麥、番茄、玉米及各種植物的果實(shí)中也發(fā)現(xiàn)了這3個(gè)蛋白。將氧化磷酸化過(guò)程與電子在呼吸鏈的傳遞過(guò)程解偶聯(lián)，可以釋放出一定的熱量，植物就可利用這些熱量對(duì)機(jī)體進(jìn)行溫度調(diào)節(jié)。冬小麥在遇到霜凍時(shí)，正是通過(guò)將氧化磷酸化過(guò)程與電子在呼吸鏈的傳遞過(guò)程解偶聯(lián)，從而產(chǎn)生了熱量，使冬小麥幼苗可以經(jīng)歷寒冬。研究表明，在冬小麥中這一耐受低溫機(jī)制是由分子量為310KD的CSP控制的，在低溫環(huán)境中，CSP310作為誘導(dǎo)解偶聯(lián)的調(diào)控因子發(fā)揮功能[20]。

目前，在人、哺乳動(dòng)物和植物的線(xiàn)粒體中都已發(fā)現(xiàn)有解偶聯(lián)蛋白，這些蛋白的主要作用都是將線(xiàn)粒體中的氧化磷酸化解偶聯(lián)。所有已知的UCP均屬于線(xiàn)粒體內(nèi)蛋白家族，且是定位于線(xiàn)粒體內(nèi)膜的膜蛋白[21]。人類(lèi)及哺乳動(dòng)物線(xiàn)粒體內(nèi)含有UCP1、UCP2和UCP3，而植物線(xiàn)粒體內(nèi)含有PUMP、StUCP和CSP310。

UCP1，早前被稱(chēng)為UCP或產(chǎn)熱素，是一個(gè)典型的線(xiàn)粒體UCP蛋白，其定位于于哺乳動(dòng)物的褐色脂肪組織。這個(gè)33kD的蛋白質(zhì)是由核基因組編碼的，由360個(gè)氨基酸組成的單體蛋白，發(fā)揮功能的時(shí)候形成了蛋白質(zhì)二聚體[22]。哺乳動(dòng)物棕色脂肪組織是已知的專(zhuān)門(mén)產(chǎn)生附加熱量的組織。線(xiàn)粒體內(nèi)膜包含有大量的UCP1，從而使脂肪組織呈現(xiàn)棕色。UCP1的主要作用是橫跨線(xiàn)粒體內(nèi)膜，作為質(zhì)子進(jìn)出線(xiàn)粒體的載體，在這一質(zhì)子進(jìn)出線(xiàn)粒體的過(guò)程中，嘌呤核苷酸起阻礙的作用，而脂肪酸起加速的作用[20-21]。激活的UCP1是質(zhì)子返回線(xiàn)粒體基質(zhì)空間的媒介，其結(jié)果是氧化磷酸化解偶聯(lián)，代謝產(chǎn)生的能量以熱的形式散放出來(lái)。

目前有兩種模型解釋脂肪酸對(duì)UCP1的刺激作用。第一種模式認(rèn)為UCP1是質(zhì)子載體，脂肪酸是其變構(gòu)調(diào)節(jié)劑；第二種模式認(rèn)為UCP1是一種能夠促進(jìn)脂肪酸陰離子跨膜易位的化合物[22]。通過(guò)UCP1的作用，脂肪酸發(fā)揮了其解偶聯(lián)的功能，脂肪酸陰離子保留在膜和水相之間的界面處，羧基朝向的水相，親脂的“尾巴”朝向膜的內(nèi)側(cè)疏水區(qū)域。這也很好地解釋了為什么脂肪酸陰離子很難穿過(guò)膜，而其中性和陽(yáng)性離子卻能夠很容易穿越生物膜[22]。

冷激蛋白與這些典型的解偶聯(lián)蛋白具有一些顯著的差異。典型的解偶聯(lián)蛋白往往是結(jié)合在線(xiàn)粒體內(nèi)膜上，而冷激蛋白通常是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白。雖然冷激蛋白的解偶聯(lián)活性機(jī)制尚未明確，但很明顯，它與其他膜結(jié)合型解偶聯(lián)蛋白的機(jī)制是完全不同的。CSP310最初是從冬黑麥幼苗中分離的一個(gè)胞質(zhì)蛋白，它的解偶聯(lián)作用機(jī)制目前仍然不確定，但是明顯與UCP的解偶聯(lián)機(jī)制是不相同的。

綜上所述，在植物體內(nèi)存在3種類(lèi)型的冷應(yīng)激蛋白：冷激蛋白，保護(hù)細(xì)胞免受冰晶損壞；蛋白伴侶和脫水蛋白，防止生物大分子在冷適應(yīng)過(guò)程中變性失活；解偶聯(lián)蛋白，使植物可以在冰點(diǎn)以下維持生長(zhǎng)一段時(shí)間，為冷適應(yīng)過(guò)程爭(zhēng)取時(shí)間。

參考文獻(xiàn)

[1]De la Roche，Andrews CJ，Pomeroy MK，Weinberger P，et al. Lipid Changes in Winter Wheat Seedlings（T.aestivum）at Temperatures Inducing Cold Hardiness[J].Can J Bot，1972，50（12）：2401-2409.

[2]Los DA，Ray MK. Differences in the Control of the Temperature-Dependent Expression the Four Genes for Desaturases in Synechocystis sp.PCC.6803[J].Mol Microbiol，1997，25（11）：1167-1175.

[3]Sakamoto T，Bryant DA. Temperature-regulated mRNA Accumulation and Stabilization for Fatty Acid Desaturase Genes in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002[J]. Mol Microbiol，1997，23（6）：1281-1292.

[4]Crespi MD，Zabaleta EJ，Ponds HG，et al. Sucrose Synthase Expression during Cold Acclimation in Wheat[J].Plant Physiol. 1991，96（1）：887-891.

[5]Guy ChL，Huber JLA，Huber SC. Sucrose phosphate Synthase and Sucrose Accumulation at Low Temperature[J].Plant Physiol，1992，100（1）：502-508.

[6]Abromeit M，Askman P，Sarnighausen E. Accumulation of High-Molecular-Proteins in Response to Cold Hardening and Abscisic Acid Treatment in Two Winter Wheat Varieties with Different Frost Tolerance[J].J Plant Physiol，1992，140（1）：617-622.

[7]Griffith M，Ala P，Yang DSC. Antifreeze Protein Produced Endogenously in Winter Rye Leaves，Plant Physiol[J].1992，100（2）：593-596.

[8]Griffith M，Antikainen M，Hon WC.，et al. Antifreeze Proteins in Winter Rye[J]. Plant Physiol，1992，100（3）：327-332.

[9]Pihakaski-Maunsbach K，Griffith M，Antikainen M.Immune gold Localization of Gluconase-Like Antifreeze Protein in Cold Acclimated Winter Rye[J].Protoplasma，1996，191（2）：115-125.

[10]Gatenby AA，Viitanen PV.Structural and Functional Aspects of Chaperonin-mediated Protein Folding，Annu[J].Plant Mol Biol，1994，45（3）：469-491.

[11]Close TJ.Dehydrins：Emergence and a Biochemical Role of a Family of Plant Dehydration Proteins[J].Physiol Plant，1996，97（4）：795-803.

[12]Kandror O，Goldberg AL.Trigger Factor Is Induced upon Cold Shock and Enhances Viability of Escherichia coli at Low Temperatures[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（1）：4978-4981.

[13]Robertson AL，Weninget A，Wilen RW.Differential Expression of Dehydrins in Spring and Winter Cereals during Cold Acclimation[J].Plant Physiol，1994，105（1）：169-182.

[14]Robertson AJ，Weninger A.Comparison of Dehydrin Gene Expression and Freezing Tolerance in Bromus in，ermis and Secalecereale Grown in Controlled Environments，Hydroponics，and the Field[J].Plant Physioi，1994，106（1）：1213-1216.

[15]Houde M，Daniel C，Lachapelle，M.Immunolocalization of Freezing-Tolerance-associated Proteins . in the Cytoplasm and Nucleoplasm of Wheat Crown Tissues[J].Plant J，1995，8（4）：583-593.

[16]Sarhan F，Ouellet F，Vazquez-Tello A.The Wheat WCS 120 Gene Family：A Useful Model to Understand the Molecular Genetics of Freezing Tolerance in Cereals[J].Physiol Plant，1997，101（2）：439-445.

[17]Jiang WN，Hou Y，Inouye M.cspA，the Cold-Shock Protein of Escherichia coli，Is an Major Chaperone[J].J Biol Chem，1997，272（1）：196-202.

[18]Li WW，Hsiung YC，Wong V.Suppression of grp78 Core Promoter Element-mediated Stress Induction by the dbpA and bpB（YB-1）Cold Shock Domain Proteins[J].Mol Cell Biol. 1997，17（1）：61-68.

[19]Ladomery M.Multifunctional Proteins Suggest Connections between Transcriptional and Post-Transcriptional Processes，BioEssays[J].1997，19（10）：903-909.

[20]Jezek P，Engstova H，Zackova M，Vercesi AE，et al. Fatty Acid Cycling Mechanism and Mitochondrial Uncoupling Proteins[J].Biochim Biophys Aeta，1998，1365（1-2）：319-327.

[21]Voinikov V，Pobezhimova akina，Kolesnichenko A，et al. Stress Protein 310 KD Affects the Energetic Activity of Plant Mitochondria under Hypothermia[J].J Therm Biol. 1998，23（1）：1-4.

[22]Palou A，Pico C，Bonet ML. The Uncoupling Protein，Thermogenin[J].Int J Biochem Cell Biol，1998，30（1）：7-11.

（責(zé)編：張長(zhǎng)青）