細(xì)胞治療帕金森病的研究進(jìn)展

曹津津，宋瓊，鄒春林

帕金森?。≒D）是第二大常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理特征是中腦黑質(zhì)多巴胺（DA）能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失和路易體形成。PD 的臨床表現(xiàn)包括靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩等運(yùn)動(dòng)障礙和認(rèn)知障礙以及自主神經(jīng)功能障礙等非運(yùn)動(dòng)障礙［1］。目前，我國(guó)患PD 人數(shù)逐年增多，65 歲以上人群的PD 發(fā)病率為1.06%［2］。臨床干預(yù)PD 的手段主要是以左旋多巴（L-DOPA）為主的藥物治療，此外還有腦深部電刺激術(shù)及外科手術(shù)等［1］。隨著病程的延長(zhǎng)，PD患者的生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響，同時(shí)也給家庭和社會(huì)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。常用的治療策略不能從根本上逆轉(zhuǎn)PD發(fā)生和發(fā)展。細(xì)胞治療被認(rèn)為是治療PD 的有效方法之一，即通過(guò)移植細(xì)胞替代損失的DA能神經(jīng)元以恢復(fù)黑質(zhì)多巴胺的神經(jīng)傳遞［3］。20 世紀(jì)90 年代初開始的胎兒腹側(cè)中腦組織（fVM）移植治療PD 會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，不能保證其長(zhǎng)期療效，胎兒組織的使用也引發(fā)了倫理方面的爭(zhēng)議，人們轉(zhuǎn)而尋求新的移植細(xì)胞來(lái)源。近年來(lái)，胚胎干細(xì)胞（ESCs）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）、間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）、神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）、誘導(dǎo)神經(jīng)元（iNs）等細(xì)胞移植治療快速發(fā)展，不同的細(xì)胞有不同的優(yōu)勢(shì)和各自局限性，本文對(duì)不同來(lái)源的移植細(xì)胞的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 fVM移植治療PD

fVM 移植治療是將6～9 周齡人胎兒中腦多巴胺（mDA）能神經(jīng)元移植到中腦，進(jìn)行PD 治療。Lindvall 等［4］首次將 fVM 單側(cè)植入 2 例 PD 晚期患者的殼核中，恢復(fù)了DA神經(jīng)傳遞。多項(xiàng)fVM移植的開放標(biāo)簽試驗(yàn)中，PD患者的臨床表現(xiàn)及神經(jīng)影像學(xué)檢查結(jié)果表明fVM可在體內(nèi)存活并釋放DA，有效改善PD 癥狀［5-7］。Li 等［8］發(fā)現(xiàn)，PD 患者在移植 fVM 術(shù)后24 年，移植細(xì)胞仍存活且能支配宿主紋狀體，恢復(fù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。以上結(jié)果說(shuō)明fVM 細(xì)胞移植治療PD 有效可行。

美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）資助的2 項(xiàng)fVM 移植治療PD的隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)中，患者臨床癥狀沒(méi)有明顯的改善，32%（18/56）的患者出現(xiàn)移植誘發(fā)的異動(dòng)癥（GIDs）［9-10］。一項(xiàng)回顧性研究指出，造成上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的主要影響因素為患者的年齡、移植細(xì)胞的異質(zhì)性和免疫識(shí)別等［3］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，5-羥色胺（5-HT）神經(jīng)元非生理性釋放DA是導(dǎo)致 GIDs 的原因［11］。fVM 細(xì)胞移植治療的療效一直以來(lái)頗具爭(zhēng)議，移植細(xì)胞制備、移植部位、免疫抑制等方案設(shè)計(jì)的缺陷可能是造成2項(xiàng)雙盲試驗(yàn)陰性結(jié)果的原因［3，11］，因此不能完全否定fVM細(xì)胞移植治療PD 的潛力。歐盟資助開展了多中心臨床試驗(yàn)TRANSEURO，以期找到fVM 移植治療的標(biāo)準(zhǔn)化方案［12］。fVM細(xì)胞移植治療仍然存在一些亟待解決的問(wèn)題：人胎兒組織樣品量不足（通常每例患者至少需要3個(gè)胎兒提供的細(xì)胞）［12］；由于移植細(xì)胞來(lái)源于人類胎兒組織，面臨倫理問(wèn)題；移植手術(shù)后，患者體內(nèi)的病理性α-突觸核蛋白可呈朊病毒樣傳播至宿主來(lái)源的移植細(xì)胞中，引起神經(jīng)元病變，進(jìn)而可能導(dǎo)致治療失?。?，13］。

2 干細(xì)胞移植治療PD

近年來(lái)，干細(xì)胞移植治療PD具有明顯優(yōu)勢(shì)。干細(xì)胞是一類具有自我更新和定向分化潛能的細(xì)胞。用于細(xì)胞移植治療的干細(xì)胞主要分為兩類：多能干細(xì)胞（PSCs）和成體干細(xì)胞。PSCs 包括 ESCs 和iPSCs。成體干細(xì)胞包括NSCs 和MSCs。目前為止，上述干細(xì)胞已被用于PD 的臨床前期研究和臨床研究［14］。

2.1 PSCs Thomson等［15］從早期人類胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離建立了具有多方向潛能和永久增殖能力的人ESCs（hESCs）。早期研究中ESCs直接移植后能夠部分分化為DA 能神經(jīng)元，但存在生成畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)，ESCs 經(jīng)體外誘導(dǎo)后進(jìn)行移植可以降低畸胎瘤的發(fā)生率。通過(guò)擬胚體法、共培養(yǎng)法或逐步添加小分子化合物的方法可直接誘導(dǎo)ESCs產(chǎn)生神經(jīng)祖細(xì)胞，但分化效率低、神經(jīng)祖細(xì)胞分化階段不同步，導(dǎo)致DA能神經(jīng)元純度低和產(chǎn)量小。Chambers 等［16］采用“雙重 SMAD 抑制法”，使用 Noggin 和 SB431542 抑制SMAD-BMP 信號(hào)通路，可誘導(dǎo)80%以上的hESC 同步化且快速分化為神經(jīng)祖細(xì)胞。由于PD 的主要病理改變?yōu)閙DA 能神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失并引起運(yùn)動(dòng)功能障礙，移植可產(chǎn)生mDA 能神經(jīng)元的細(xì)胞，補(bǔ)充丟失的神經(jīng)元是細(xì)胞移植治療PD的關(guān)鍵。mDA 能神經(jīng)元起源于腹側(cè)中腦底板，Nolbrant 等［17］通過(guò)添加音猬因子（SHH）、GSK3 抑制劑（GSK3i）以及成纖維生長(zhǎng)因子-8（FGF-8）將hESC 分化為中腦底板祖細(xì)胞，體外分化為表達(dá)叉頭框蛋白A2（FOXA2）、同源盒轉(zhuǎn)錄因子1a（LMX1A）、酪氨酸羥化酶（TH）、G-蛋白偶聯(lián)內(nèi)向整流鉀離子通道2（GIRK2）的mDA能神經(jīng)元；將獲得的中腦底板神經(jīng)祖細(xì)胞移植到6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導(dǎo)PD 大鼠紋狀體中進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，顯著改善了PD 大鼠的運(yùn)動(dòng)障礙。目前，已成功建立可應(yīng)用于臨床的hESCs 細(xì)胞系，可大規(guī)模生產(chǎn)，移植后有助于恢復(fù)損傷的神經(jīng)功能，但是ESCs 的使用也帶來(lái)了免疫排斥問(wèn)題和倫理學(xué)問(wèn)題［3，17］。研究者利用細(xì)胞核移植技術(shù)（SCNT）在不受精的情況下由卵母細(xì)胞產(chǎn)生人類孤雌胚胎干細(xì)胞，用于干細(xì)胞移植治療PD，從而解決了ESCs 來(lái)源的倫理問(wèn)題［18］。

Takahashi等［19］利用4種轉(zhuǎn)錄因子（Oct3/4、Sox2、Klf4a、c-Myc）轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞重編程為類似于ESCs的多能干細(xì)胞，即iPSCs。iPSCs可經(jīng)ESCs 誘導(dǎo)分化方案產(chǎn)生mDA 能神經(jīng)元，由于iPSCs在誘導(dǎo)分化過(guò)程中產(chǎn)生5-HT 神經(jīng)元導(dǎo)致GIDs，Kikuchi 等［20］利用 CORIN 作為 DA 能神經(jīng)元標(biāo)志物篩選去除5-HT神經(jīng)元，獲得高純度mDA能神經(jīng)元，且將iPSCs 誘導(dǎo)分化的神經(jīng)祖細(xì)胞移植到5，1-甲基-4 苯基-1，2，3，-四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)PD 非人靈長(zhǎng)類食蟹猴模型中，移植細(xì)胞可在體內(nèi)存活并成熟，明顯改善食蟹猴PD 癥狀，未誘發(fā)GIDs 或腫瘤，從而解決了細(xì)胞移植中GIDs 的問(wèn)題。與ESCs 相比，iPSCs 可由體細(xì)胞重編程獲得且來(lái)源廣泛，較少涉及ESCs 面臨的倫理問(wèn)題，但是iPSCs 在體細(xì)胞重編程過(guò)程中存在遺傳不穩(wěn)定現(xiàn)象，iPSCs會(huì)產(chǎn)生癌細(xì)胞中常見的20q11.21擴(kuò)增［21］和TP53錯(cuò)義突變［22］，具有成瘤風(fēng)險(xiǎn)。因此，需通過(guò)基因篩查或者清除誘導(dǎo)后未分化iPSCs 以避免上述遺傳問(wèn)題的發(fā)生［11］。臨床前研究已證實(shí)，人PSCs 移植后細(xì)胞可存活、成熟并整合到宿主的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，以類似生理的方式將DA遞送到宿主神經(jīng)元，維持突觸內(nèi)DA水平，恢復(fù)神經(jīng)功能［3，23］。

目前PSCs 已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，包括STEMPD 試驗(yàn)、NYSTEM-PD 試驗(yàn)、CiRA 試驗(yàn)等［24］。為了減輕免疫排斥反應(yīng)，臨床試驗(yàn)中根據(jù)人類白細(xì)胞抗原（HLA）分型建立 PSCs 干細(xì)胞庫(kù)［25］。有研究將HLA配型iPSCs分化的DA能祖細(xì)胞移植到MPTP誘導(dǎo)PD 非人靈長(zhǎng)類食蟹猴模型殼核中，PD 癥狀得到改善，表明了iPSCs移植的有效性和安全性［26］。

2.2 NSCs NSCs 是一類能自我更新的可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的成體干細(xì)胞。NSCs 一般可從成人或小鼠的側(cè)腦室室管膜下區(qū)（subventricular zone，SVZ）或紋狀體中分離提取，也可從胚胎組織或人臍帶血中獲得。Svendsen等［27］首次提取人胚胎中NSCs移植到6-OHDA誘導(dǎo)PD大鼠的紋狀體中，不足1%的NSCs 分化為TH 陽(yáng)性的DA能神經(jīng)元，大部分NSCs分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。為提高 NSCs 分化效率，Parish 等［28］采用 Wnt5a 基因過(guò)表達(dá)的手段，將NSCs分化為DA能神經(jīng)元的數(shù)量提高了10倍，顯著改善了6-OHDA誘導(dǎo)PD大鼠的運(yùn)動(dòng)癥狀。

NSCs 移植不僅能補(bǔ)充所需的DA 能神經(jīng)元，而且通過(guò)營(yíng)養(yǎng)支持、神經(jīng)再生、腦血管形成及免疫調(diào)節(jié)等多種作用機(jī)制形成神經(jīng)保護(hù)，促進(jìn)神經(jīng)再生。此外，PD 病理改變累及范圍可超出黑質(zhì)和紋狀體，僅在黑質(zhì)或者紋狀體移植，無(wú)法實(shí)現(xiàn)全面修復(fù)。Zuo等［29］將未分化的人NSCs移植到6-OHDA誘導(dǎo)PD小鼠SVZ 中，NSCs 可分泌抗炎性因子和特定修復(fù)因子，刺激SVZ中神經(jīng)細(xì)胞再生，介導(dǎo)內(nèi)源性腦損傷修復(fù)。Tajiri 等［30］發(fā)現(xiàn)NSCs移植后可建立SVZ與損傷區(qū)域之間NSCs的遷移路徑。NSCs移植后能介導(dǎo)移植區(qū)域與其他損傷區(qū)域之間的細(xì)胞遷移，促進(jìn)其他區(qū)域的損傷修復(fù)，因此NSCs 具有全面修復(fù)PD 損傷的潛力［31］。

目前，NSCs 的臨床研究仍處于起始階段，多數(shù)嚙齒類動(dòng)物NSCs 細(xì)胞系已經(jīng)建立，但是人來(lái)源NSCs 需從成體、胎兒或者臍帶血中獲得，面臨細(xì)胞來(lái)源不足或倫理問(wèn)題。NSCs移植后分化的DA能神經(jīng)元在體內(nèi)無(wú)法長(zhǎng)期存活且成熟緩慢，NSCs的分化機(jī)制和細(xì)胞遷移機(jī)制尚未明確，存在移植的不確定性，因此，標(biāo)準(zhǔn)化的移植方案需要進(jìn)一步研究。

2.3 MSCs MSCs是一類具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，存在于人體多種組織和器官間質(zhì)中，目前用于PD 移植治療的 MSCs 包括骨髓MSCs（BMMSCs）、脂肪 MSCs（AD-MSCs）、人臍帶 MSCs（UCMSCs）、嗅黏膜 MSCs（OM-MSCs）。其作用機(jī)制與MSCs的替代、免疫調(diào)節(jié)、抗凋亡、抗炎、神經(jīng)保護(hù)、促進(jìn)血管重建等有關(guān)［32］。

MSCs 臨床前研究主要采用腦立體定位法植入細(xì)胞，此外可經(jīng)靜脈、動(dòng)脈以及鼻腔注射等方式進(jìn)行細(xì)胞移植。Bouchez等［33］將人BM-MSCs通過(guò)腦立體定位法植入6-OHDA誘導(dǎo)PD大鼠右側(cè)紋狀體，發(fā)現(xiàn)MSCs 可分化為 DA 能神經(jīng)元，恢復(fù) DA 釋放，減輕部分PD 運(yùn)動(dòng)障礙。有研究表明，AD-MSCs、UC-MSCs移植到PD 嚙齒類動(dòng)物模型后，可分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)移植細(xì)胞的存活且改善動(dòng)物PD 運(yùn)動(dòng)癥狀［34-35］。Venkataramana等［36］將自體BM-MSCs移植到7例PD患者的SVZ 中，通過(guò)統(tǒng)一PD 評(píng)分量表（UPDRS）評(píng)價(jià)，患者的運(yùn)動(dòng)癥狀得到有效改善，其中3例患者經(jīng)36個(gè)月治療后具有穩(wěn)定的療效。隨后，該研究團(tuán)隊(duì)又將同種異體BM-MSCs 植入8 例PD 患者和4 例帕金森疊加綜合征患者，經(jīng)過(guò)UPDRS 評(píng)分顯示患者PD 癥狀改善，且早期 PD 患者療效更顯著［37］。上述研究結(jié)果證實(shí)了MSCs細(xì)胞治療的安全性和有效性，但是臨床試驗(yàn)中的細(xì)胞制備方案及臨床治療方案仍需標(biāo)準(zhǔn)化。

目前MSCs 細(xì)胞移植治療PD 以BM-MSCs 最常見，但是BM-MSCs 需要采用有創(chuàng)性方式獲得，且分離后得到的細(xì)胞數(shù)量較少；AD-MSCs可通過(guò)脂肪切除手術(shù)或吸脂手術(shù)獲得，且脂肪組織中MSCs數(shù)量是骨髓組織中的500倍；UC-MSCs具有增殖能力強(qiáng)、可塑性強(qiáng)、免疫排斥反應(yīng)低、能夠免疫調(diào)節(jié)的特點(diǎn)［32］。BM-MSCs 和AD-MSCs 均可采用自體移植，但是PD患者自身細(xì)胞由于衰老可能導(dǎo)致MSCs 增殖能力低下，影響治療效果。UC-MSCs是自體移植和同種異體移植細(xì)胞治療的重要來(lái)源，但是MSCs 細(xì)胞表面HLA-Ⅱ類分子的表達(dá)可隨細(xì)胞多次傳代和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，從而增強(qiáng)MSCs 免疫原性。因此，需采用低傳代的MSCs 進(jìn)行移植治療以減少免疫排斥反應(yīng)［34］。近期研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于嗅黏膜固有層的MSCs 可分化為TH 陽(yáng)性DA 能神經(jīng)元，且移植到6-OHDA 誘導(dǎo)的PD 大鼠后，可減少阿樸嗎啡誘導(dǎo)的PD大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)，改善運(yùn)動(dòng)障礙，OM-MSCs有望成為PD細(xì)胞移植治療的另一種細(xì)胞來(lái)源［38］。

此外，MSCs 細(xì)胞外囊泡（EVs）具有與MSCs 相同的生物學(xué)效應(yīng)，可對(duì)組織和器官進(jìn)行修復(fù)和治療，MSCs-EVs 可抑制6-OHDA 誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡［39］。因此，MSC-EVs的非細(xì)胞性治療方式可能成為PD治療的新策略。

3 iNs治療PD

iNs 是將已分化的體細(xì)胞進(jìn)行直接重編程轉(zhuǎn)換為神經(jīng)元，而不經(jīng)過(guò)多能干細(xì)胞或祖細(xì)胞階段。Vierbuchen 等［40］首次使用轉(zhuǎn)錄因子 Brn2、Ascl1 和Myt1l（BAM）直接重編程小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）誘導(dǎo)為神經(jīng)元。Caiazzo 等［41］使用轉(zhuǎn)錄因子Mash1（Ascl1）、Lmx1a 和 Nurr1，將人和鼠來(lái)源的成纖維細(xì)胞直接重編程為誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元（iDA），但是轉(zhuǎn)化效率低于18%。Jiang等［42］在9 d內(nèi)將人胚胎的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為iDA，轉(zhuǎn)化效率提高到 59.2%。Kim 等［43］將 MEFs 重編程轉(zhuǎn)分化為iDA，移植到6-OHDA 誘導(dǎo)PD 小鼠后，可降低苯丙胺誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，改善運(yùn)動(dòng)障礙，說(shuō)明iNs 移植治療PD 具有重要潛力。iNs 不經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)干細(xì)胞階段，不僅節(jié)省大量時(shí)間，同時(shí)也避免了干細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)生畸胎瘤的危險(xiǎn)；而且iNs 不存在倫理爭(zhēng)議，任何個(gè)體的體細(xì)胞都能進(jìn)行直接重編程，增加了自體移植可行性。iNs也存在一定的局限性，直接重編程產(chǎn)生的神經(jīng)元難以大量擴(kuò)增，高齡患者自體移植的細(xì)胞進(jìn)行重編程存在DNA損傷的風(fēng)險(xiǎn)。

由于體外細(xì)胞移植會(huì)因?yàn)槊庖吲懦鈱?dǎo)致移植細(xì)胞死亡，且PD 病理?yè)p傷會(huì)促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)炎癥產(chǎn)生，研究人員嘗試直接在體內(nèi)將神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行重編程，轉(zhuǎn)化為DA 能神經(jīng)元，治療PD。目前，轉(zhuǎn)化為iDA 的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞主要包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（也稱NG2 膠質(zhì)細(xì)胞）。Guo 等［44］首次將 NeuroD1 基因逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入皮層受損的小鼠腦內(nèi)，90%的星形膠質(zhì)細(xì)胞在2 周內(nèi)表達(dá)NeuroD1并形成神經(jīng)元，1個(gè)月內(nèi)形成功能性神經(jīng)元。Rivetti di Val Cervo等［45］使用轉(zhuǎn)錄因子NeuroD1、Ascl1 和Lmx1a 以及miR218（統(tǒng)稱NeAL218）將星形膠質(zhì)細(xì)胞體內(nèi)重編程為iDA，可改善PD小鼠運(yùn)動(dòng)癥狀。Qian等［46］通過(guò)敲低RNA結(jié)合蛋白PTBP1，將PD小鼠中腦的80%星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟的黑質(zhì)神經(jīng)元，而后支配紋狀體，可恢復(fù)黑質(zhì)的DA水平，改善PD 小鼠運(yùn)動(dòng)障礙。Torper 等［47］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)體內(nèi)重編程后小鼠紋狀體的NG2膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)Ascl1、Lmx1a 和Nurr1 并轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸能神經(jīng)元，但不表達(dá)DA 能神經(jīng)元標(biāo)志物酪氨酸羥化酶（TH），因此無(wú)法轉(zhuǎn)化為成熟的DA 能神經(jīng)元。體內(nèi)直接重編程摒棄了體外擴(kuò)增再移植的方式，有望實(shí)現(xiàn)細(xì)胞原位治療。

4 總結(jié)與展望

fVM 組織細(xì)胞移植已在臨床試驗(yàn)中用于治療PD，證實(shí)DA 能神經(jīng)元移植是治療PD 的有效途徑。近年來(lái)，干細(xì)胞和細(xì)胞重編程技術(shù)的快速發(fā)展在一定程度上解決了細(xì)胞來(lái)源的問(wèn)題，但是宿主與移植細(xì)胞之間的免疫排斥反應(yīng)和移植細(xì)胞自身病理風(fēng)險(xiǎn)的問(wèn)題依然存在。雖然細(xì)胞治療仍存在一系列的問(wèn)題亟待解決，但是其前景依然值得期待。目前，臨床策略無(wú)法治愈PD，嘗試聯(lián)合細(xì)胞治療、藥物治療和外科治療（如腦深部電刺激術(shù)）來(lái)制定出一套標(biāo)準(zhǔn)化治療方案，可為今后PD治療提供新的研究方向和思路。