不同酵母菌株釀造橘子酒香氣比較

陳清嬋，簡清梅，李 蓉，孫愛紅

（荊楚理工學(xué)院，生物工程學(xué)院，湖北荊門 448000）

以柑橘為原料釀造果酒，酒精度低，酒質(zhì)溫和爽口，果香味濃，基本保持了柑橘中的天然營養(yǎng)成分。湖北是柑橘生產(chǎn)區(qū)之一，柑橘業(yè)已成為湖北省農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的支柱產(chǎn)業(yè)。因此充分利用湖北省的柑橘資源，釀造具有本地柑橘特色的果酒，為柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展開辟了一條新的道路。柑橘酒的香氣和味道對柑橘酒的品質(zhì)起著很大的作用，也是評價(jià)柑橘酒品質(zhì)的重要感官指標(biāo)。然而，柑橘酒的香氣和呈味并非是單一化合物的作用。酒中含有多種香氣物質(zhì)，主要包括醇類、醛類、酮類、酯類等，這些物質(zhì)的濃度從每升幾毫克到每升幾百毫克，正是這些物質(zhì)相互作用形成了酒的特征香氣。特征呈味是由多種呈味物質(zhì)，如有機(jī)酸、氨基酸、酚酸、單寧酸、糖類等物質(zhì)相互作用的結(jié)果，這些滋味物質(zhì)一部分來源于橘子本身，另一部分來源于發(fā)酵過程和陳釀老化階段。

目前，鑒定果酒中香氣、呈味物質(zhì)方法主要包括GC-MS法、GC-O法、頂空固相微萃取法、液液萃取法等。汪立平等[1]以頂空固相微萃取法和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用，研究了蘋果酒香氣的快速提取方法。溫海祥、江東文等[2]利用液-液萃取法提取香蕉果酒中的揮發(fā)性香氣成分，用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)技術(shù)進(jìn)行分析。董曼、任婧楠等[3]研究了自然發(fā)酵和接種發(fā)酵樹莓酒中的香氣物質(zhì),并對其進(jìn)行感官分析，運(yùn)用GC-O檢測法確定特征香氣活性物質(zhì)。

本試驗(yàn)通過對從橘子果實(shí)上分離篩選出的天然野生優(yōu)良菌株和優(yōu)選的商業(yè)果酒酵母所釀造橘子酒的生香性能進(jìn)行比較研究，確定柑橘果酒的香氣組成及不同釀酒酵母對柑橘果酒香氣成分的影響。初步探討適合釀造柑橘果酒的酵母菌，為橘子酒生產(chǎn)菌種的選擇提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料與試劑：橘子，荊門本地產(chǎn)；白砂糖，武漢廣盛元食品有限公司；法國葡萄酒專用酵母FX10、安琪果酒酵母、高溫釀酒酵母，煙臺帝伯仕自釀機(jī)有限公司；酵母菌JZ-1和JZ-2，實(shí)驗(yàn)室篩選得到；亞硫酸（分析純），天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。

儀器設(shè)備：固相微萃取(SPME)裝置、手動固相微萃取進(jìn)樣器、二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)50/30 μm、20 mL頂空鉗口樣品瓶，美國 Supelco公司；Agilent 6890N/5975MSD氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)儀，美國Agilent公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 橘子酒釀造工藝

橘子→去皮→打漿→過濾→橘子清汁→調(diào)糖→調(diào)SO2濃度→接種→發(fā)酵。

調(diào)糖：用白砂糖調(diào)整橘子汁糖度為20°Bx。調(diào)SO2：用亞硫酸調(diào)整SO2濃度為100 mg/L。

斜面酵母菌株的活化：用接種環(huán)取1環(huán)保存的斜面酵母轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)24～48 h，至酵母長滿斜面。

干酵母的活化：稱取0.02 g干酵母，置于調(diào)好的100 mL橘子清汁中，于30℃水浴鍋水浴活化15 min。

菌種擴(kuò)大培養(yǎng)：從活化斜面培養(yǎng)基上取1環(huán)活化菌種接入50 mL經(jīng)滅菌處理的橘子清汁中，28℃搖床培養(yǎng)24 h，振蕩速度120 r/min。

接種：分別將各菌株擴(kuò)大培養(yǎng)液按5%的體積比例接入到100 mL橘子清汁中。

發(fā)酵：放入25℃培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為7 d。

1.2.2 固相微萃取(SPME)法質(zhì)譜條件

取10 mL樣品置于20 mL鉗口瓶中，用聚四氟乙烯隔墊密封，于磁力攪拌器上在60℃加熱平衡15 min后，通過隔墊插入已活化好的SPME萃取頭(270℃活化30 min)，推出纖維頭，頂空吸附40 min后，插入GC進(jìn)樣口解析5 min。

色譜條件：色譜柱為DB-5 MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣：氦氣；柱流量：1 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃，不分流進(jìn)樣；起始溫度40℃，保持3 min，以3℃/min升至160℃，再以8℃/min升至220℃，保持3 min。

質(zhì)譜條件：接口溫度280℃；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；離子化方式：EI；電子能量70 eV；質(zhì)量范圍35～350 amu/s。

1.2.3 化合物鑒定及定量

定性分析：樣品揮發(fā)性化合物經(jīng)氣相色譜分離，不同組分形成其各自的色譜峰，用氣相色譜-質(zhì)譜-計(jì)算機(jī)聯(lián)用儀進(jìn)行分析鑒定。分析結(jié)果運(yùn)用計(jì)算機(jī)譜庫(NIST/WILEY)進(jìn)行初步檢索及資料分析，再結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行人工譜圖解析，確認(rèn)揮發(fā)性化合物的各個(gè)化學(xué)成分。以歸一法計(jì)算各香氣物質(zhì)的峰面積，作為各香氣成分的相對含量。根據(jù)香氣物質(zhì)種類及含量比較各菌株的生香性能。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種酵母菌釀造的橘子酒香氣組分

5種酵母釀造的橘子酒通過HS-SPME法分析后，所檢測的揮發(fā)性成分差異比較明顯。GC-MS鑒定出的橘子酒中揮發(fā)性成分及其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表1。

由表1可知，5種酵母菌發(fā)酵橘子酒的香氣成分經(jīng)GC-MS分析后，共檢出香氣成分38種，共6類化合物。安琪果酒酵母發(fā)酵橘子酒中檢出酯類12種，醇類4種，烯類12種，醛類2種，雜環(huán)類1種，酚類1種，共32種化合物。FX 10酵母發(fā)酵橘子酒中檢出酯類12種，醇類1種，烯類12種，醛類1種，酚類1種，共27種化合物。高溫釀酒酵母發(fā)酵橘子酒中檢出酯類8種，醇類1種，烯類12種，酚類1種，共22種化合物。JZ-1酵母發(fā)酵橘子酒中檢出酯類11種，醇類2種，烯類11種，酚類1種，共25種化合物。JZ-2酵母發(fā)酵橘子酒中檢出酯類9種，醇類1種，烯類10種，醛類1種，酚類1種，共22種化合物。安琪果酒酵母發(fā)酵橘子酒檢出物質(zhì)中相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的是1-戊醇（29.11%）、辛酸乙酯（21.72%）、乙酸異戊酯（9.1%）、苯乙醇（9.06%）、癸酸乙酯（8.36%）、正己酸乙酯（3.2%）、D-檸檬烯（3.88%）、乙酸苯乙酯（2.88%）；FX 10酵母發(fā)酵橘子酒中檢出的物質(zhì)中相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的有甲酸異戊酯（21.73%）、乙酸異戊酯（5.63%）、辛酸乙酯（15.45%）、乙酸苯乙酯（2.98%）、癸酸乙酯（8.22%）、苯乙醇（12.69%）、D-檸檬烯（3.82%）、3-蒈烯（14.04%）、(+)-樅油烯（2.8%）；高溫釀酒酵母發(fā)酵橘子酒中檢出的物質(zhì)中相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的有乙酸異戊酯（3.86%）、辛酸乙酯（5.92%）、乙酸苯乙酯（5.78%）、苯乙醇（37.66%）、D-檸檬烯（3.27%）；JZ-1酵母發(fā)酵橘子酒中檢出的物質(zhì)中相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的有乙酸異戊酯（10.32%）、正己酸乙酯（2.8%）、癸酸乙酯（11.82%）、苯乙醇（10.35%）、3-蒈烯（3.1%）；JZ-2酵母發(fā)酵橘子酒中檢出的物質(zhì)中相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的有乙酸異戊酯（4.06%）、辛酸乙酯（13.44%）、癸酸乙酯（3.84%）、苯乙醇（25.18%）、D-檸檬烯（2.18%）、3-蒈烯（4.16%）、(+)-樅油烯（2.04%）。

表1 5種酵母發(fā)酵橘子酒香氣成分的檢測

2.2 5種酵母發(fā)酵橘子酒香氣成分分析

比較5種酵母發(fā)酵橘子酒香氣成分，所得結(jié)果差異比較明顯，共同檢出的物質(zhì)有乙酸異戊酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、9-癸烯酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、苯乙醇、月桂烯、D-檸檬烯、萜品烯、3-蒈烯、(+)-樅油烯、波斯菊萜、巴倫西亞橘烯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚。但這些共有的香氣物質(zhì)中，各種物質(zhì)在5種酒中的含量差別比較大，普遍存在1.2～3倍的差距，有的甚至存在9～10倍的差距。乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯也在Kozan柑橘果酒中檢出[4]。這些新生成的酯類物質(zhì)是酵母在發(fā)酵過程中的初級代謝產(chǎn)物。在目前的報(bào)道中，有很多生香酵母可以產(chǎn)生苯乙醇。在高健等[5]分離的萵苣內(nèi)生香酵母GC-MS檢測中苯乙醇相對含量為5.21%，廖永紅等[6]分離的產(chǎn)香酵母中苯乙醇相對含量更低,僅為3.49%，而付俊淑等[7]分離出的酵母菌產(chǎn)苯乙醇相對含量較高，為19.03%。苯乙醇是一種比較典型的芳香醇[8]，閾值較低，僅為10 mg/L，具有淡雅細(xì)膩的玫瑰香氣，它也被認(rèn)為是Kozan柑橘果酒的特征香氣活性物質(zhì)[4]。因此，本次篩選出的JZ-1和JZ-2酵母具備產(chǎn)大量苯乙醇的優(yōu)勢功能。D-檸檬烯有一種較弱的柑橘香味,當(dāng)其含量低于190 ppm時(shí)，就是柑橘中的重要特征香氣物質(zhì)[9-10]。D-檸檬烯具有令人愉快的檸檬香氣[11]。巴倫西亞橘烯是橙汁和橙皮中一種重要的倍半菇類物質(zhì),并被用做橙汁的質(zhì)量指標(biāo)。但Elston等[12]研究發(fā)現(xiàn)，巴倫西亞橘烯可以作為柑橘成熟度的判定指標(biāo),但對柑橘的整體香氣沒有任何貢獻(xiàn)。1-戊醇、L-香芹醇、g-芹子烯、壬醛、2-乙氧基噻唑只在安琪果酒酵母發(fā)酵橘子酒中有檢出；甲酸異戊酯只在FX 10酵母發(fā)酵橘子酒中有檢出；α-金合歡烯、d-杜松烯只在高溫釀酒酵母發(fā)酵橘子酒中有檢出；α-水芹烯只在JZ-1酵母發(fā)酵橘子酒中有檢出。當(dāng)1-戊醇、L-香芹醇、1-辛醇這些高級醇類物質(zhì)的濃度低于300 mg/L時(shí)，就會產(chǎn)生令人愉悅的香氣[13]，這些醇類物質(zhì)也是酵母在發(fā)酵過程中的初級代謝產(chǎn)物。α-蒎烯也是柑橘的特征香氣物質(zhì)，除了JZ-1酵母釀造的酒中沒有檢出外，其他酒都有檢出。Selli等[4]曾指出乙酸乙酯也是柑橘果酒的特征香氣物質(zhì)，在安琪果酒酵母、JZ-1、JZ-2酵母釀造的酒中有檢出。

這說明經(jīng)過發(fā)酵釀造，5種酵母釀造的果酒都擁有柑橘果酒主體的特征香氣組分(16種物質(zhì)共有)，但也有各自獨(dú)有的香氣組分，存在特異性差異。從香氣成分種類數(shù)量來看，安琪果酒酵母發(fā)酵橘子酒中檢出最多，有32種，果酒香氣成分最豐富。以柑橘果酒的特征香氣活性物質(zhì)苯乙醇和乙酸乙酯相對含量為根據(jù)，高溫釀酒酵母釀造的橘子酒中苯乙醇相對含量最高，但不含乙酸乙酯；JZ-2釀造的橘子酒中苯乙醇含量較高，乙酸乙酯相對含量也是最高的，生香效果最好。

3 結(jié)論

對篩選出的2種野生酵母與3種商業(yè)酵母所釀橘子酒香氣成分進(jìn)行比較，5種酵母釀造的果酒的香氣成分共檢出38種。5種酵母菌釀造的柑橘果酒中香氣組分的主體成分接近，都有乙酸異戊酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯等16種物質(zhì)，但是各酵母菌種所釀果酒存在特有的香氣成分，1-戊醇、L-香芹醇、1-辛醇這些高級醇類物質(zhì)主要在安琪果酒酵母釀造的柑橘果酒中存在，g-芹子烯、壬醛、2-乙氧基噻唑只在安琪果酒酵母發(fā)酵橘子酒中有檢出；甲酸異戊酯只在FX 10酵母發(fā)酵橘子酒中有檢出；α-金合歡烯、d-杜松烯只在高溫釀酒酵母發(fā)酵橘子酒中有檢出；α-水芹烯只在JZ-1酵母發(fā)酵橘子酒中有檢出。安琪果酒酵母發(fā)酵橘子酒中檢出的香氣種類數(shù)最多，有32種。高溫釀酒酵母釀造的橘子酒中苯乙醇相對含量最高，JZ-2釀造的橘子酒中苯乙醇含量較高，乙酸乙酯相對含量也是最高的?？傊吧湍窲Z-2生香效果最好，安琪果酒酵母釀造的橘子酒，香氣成分最豐富。5種酵母釀造的果酒有共同的果酒特征香氣物質(zhì)，香氣組分又有特異性差異，基于各香氣成分的閾值不同，各成分對主體香氣的貢獻(xiàn)率也不同，不同酵母對釀造香氣主體的影響，有待于進(jìn)一步深入研究，通過GC-MS結(jié)合GC-O進(jìn)行嗅辨分析評價(jià)各香氣組分的差異對主體香氣的影響，將有助于對該問題的深入探討。

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