氣相色譜-火焰熱離子檢測(cè)器法測(cè)定白酒中甜蜜素的研究

王 爍，柯潤(rùn)輝，安紅梅，李曉斌，尹建軍

（中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京 100015）

甜蜜素是一種人工合成的非營(yíng)養(yǎng)性水溶性的甜味劑，化學(xué)名稱為環(huán)己基氨基磺酸鈉（或環(huán)己基氨基磺酸鈣），是食品生產(chǎn)中常用的添加劑。由于甜蜜素風(fēng)味好，價(jià)格低廉，并且不會(huì)提供能量，因此甜蜜素廣泛用于調(diào)味品、糕點(diǎn)、蜜餞、飲料等食品以及供糖尿病人等特殊人群使用的甜食[1]。我國(guó)食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定了食品添加劑的使用范圍和使用限量，但是超限量、超范圍違規(guī)使用各類食品添加劑的現(xiàn)象仍然屢禁不絕。

白酒是我國(guó)傳統(tǒng)的釀造飲品，歷史悠久，工藝獨(dú)特。優(yōu)質(zhì)白酒之所以具有醇甜感，是由于發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的多元醇、酮等甜味物質(zhì)帶來(lái)的，比如丁二醇、雙乙酰等[2]。甜味適度的白酒給人以綿甜、甘醇的愉悅感，并且能遮蓋酒類發(fā)酵過(guò)程中的苦澀等雜味。為保護(hù)我國(guó)特有的傳統(tǒng)酒種，我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定發(fā)酵型白酒中禁止添加甜味劑[3]，但仍有一些生產(chǎn)廠家為了降低成本和改善口感向白酒中違規(guī)添加甜蜜素等甜味劑。目前，測(cè)定食品中甜蜜素常用的方法有氣相色譜法[4]、液相色譜法[5-6]、質(zhì)譜法[7]、比色法[8]、薄層層析法[9]等。其中，比色法、薄層層析法和液相色譜法靈敏度較低，難以滿足痕量檢測(cè)需求。質(zhì)譜法靈敏度高，但是儀器價(jià)格昂貴，使用成本高，在企業(yè)中普及難度大。目前應(yīng)用較多的是氣相色譜法，甜蜜素衍生后用火焰離子化檢測(cè)器（FID）[11]或電子捕獲檢測(cè)器（ECD）[12]測(cè)定。氣相色譜法方法比較成熟，成本較低。但是由于FID檢測(cè)器為通用型檢測(cè)器，靈敏度相對(duì)較低，且在測(cè)白酒基質(zhì)時(shí)易受干擾而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果[13]，故國(guó)標(biāo)方法中特別說(shuō)明GC-FID法不適用于白酒中甜蜜素的檢測(cè)[14]。而ECD檢測(cè)器雖然對(duì)電負(fù)性物質(zhì)具有很高靈敏度，但也具有抗干擾能力差、易被污染的缺點(diǎn)。因此建立一種低成本、高靈敏度、準(zhǔn)確可靠且適用于白酒中痕量甜蜜素檢測(cè)的方法十分必要。

FTD檢測(cè)器是選擇性檢測(cè)器，對(duì)含氮和含磷有機(jī)化合物有高靈敏度、高選擇性、重復(fù)性好和線性范圍寬的優(yōu)點(diǎn)，其抗干擾能力好于ECD檢測(cè)器，靈敏度優(yōu)于FID檢測(cè)器。本研究建立了次氯酸鈉衍生，正庚烷提取，氣相色譜-火焰熱離子檢測(cè)器（FTD）測(cè)定白酒中甜蜜素的方法，前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，基質(zhì)干擾少，靈敏度高，能有效避免假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。應(yīng)用本方法對(duì)市售78個(gè)白酒樣品中甜蜜素進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)陽(yáng)性白酒樣品進(jìn)行了質(zhì)譜確認(rèn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人滿意。本方法可為白酒企業(yè)進(jìn)行甜蜜素的日常監(jiān)控提供簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確可靠的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

樣品：實(shí)驗(yàn)所用的白酒樣品均采集于本地零售市場(chǎng)，共78個(gè)，涵蓋濃香型、清香型、醬香型等主流香型。

試劑：正庚烷（色譜純，美國(guó)J.T.Baker公司），次氯酸鈉（有效氯≥8.0%，西隴化工股份有限公司），硫酸（優(yōu)級(jí)純，95.0%～98.0%，北京化工廠），碳酸氫鈉（含量≥99.5%，西隴化工股份有限公司），氫氧化鈉（含量≥96.0%，北京化工廠）、乙醇（≥95.0%vol，北京化工廠）、甜蜜素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(標(biāo)準(zhǔn)純度值99.3%，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院)，所用試劑未指明者均為分析純，水為蒸餾水。

儀器設(shè)備：GC-14C氣相色譜儀（日本島津公司），LCMS-8050液相色譜儀-串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本島津公司），BSC323S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司），GL-88B渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），SE812氮?dú)獯蹈蓛x（北京帥恩科技有限責(zé)任公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

準(zhǔn)確稱取0.100 g環(huán)乙基氨基磺酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，用水溶解并定容，混勻，即得濃度為1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取10 mL于100 mL容量瓶中，搖勻，即得濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 色譜條件

色譜柱為TG-5MS石英毛細(xì)柱（30 m×0.25μm×0.25 mm，美國(guó)Thermo Scientific公司）；載氣為高純度氮（純度99.999%）；恒流模式，柱流速為1.00 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；無(wú)分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL；FTD檢測(cè)器溫度250℃，氫氣表壓力：50 kPa，空氣表壓力40 kPa。

升溫程序：氣化室初始溫度80℃，保持2 min，以10℃/min的速率升至200℃，總運(yùn)行時(shí)間為14 min。

1.2.3 測(cè)定方法

準(zhǔn)確吸取白酒樣品10.0 mL于50 mL具塞試管中，待測(cè)。

前處理方法參考《GB 5009.97—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中環(huán)已基氨基磺酸鈉的測(cè)定》中第二法（高效液相色譜法）[14]，略作調(diào)整。具體如下：將處理好的白酒樣品溶液或標(biāo)準(zhǔn)溶液中準(zhǔn)確加入2.0 mL硫酸溶液（1∶1，v∶v），5.0 mL正庚烷和1.0 mL次氯酸鈉溶液（1∶1，v∶v），于渦旋振蕩器上渦旋1 min。靜置，吸取上層有機(jī)相于另一50 mL具塞試管中，加入25 mL碳酸氫鈉溶液（5%，W∶V），渦旋1 min。靜置，加入一定量無(wú)水Na2SO4脫水，準(zhǔn)確取出3.0 mL，氮吹濃縮定容至0.5 mL后，吸取試樣lμL注入氣相色譜儀進(jìn)行分析。

陽(yáng)性樣品則用GB 5009.97—2016方法中第三法（液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法）進(jìn)行確認(rèn)[14]：準(zhǔn)確吸取樣品2.0 mL，過(guò)0.45 μm濾膜，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀分析測(cè)定。

2 結(jié)果討論

2.1 樣品處理?xiàng)l件對(duì)檢測(cè)白酒中甜蜜素含量的影響

2.1.1 p H值的影響

考慮到白酒為微酸性液體，本方法考察了樣品溶液pH值對(duì)提取效率的影響。取5份超純水溶液，加入適量甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液使其濃度為20 mg/L，然后用硫酸溶液和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH值為5、5.5、6、6.5、7。再經(jīng)過(guò)1.2.3測(cè)定方法分析，考察pH值對(duì)回收率的影響。實(shí)驗(yàn)共5組，每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行樣品，取平均值，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1表明，5組實(shí)驗(yàn)的回收率均在95%～105%之間，說(shuō)明微酸性樣品溶液對(duì)方法的提取效率無(wú)明顯影響。

2.1.2 酒精度的影響

由于白酒中含有大比例的乙醇，本試驗(yàn)考察了不同濃度的乙醇對(duì)方法提取效率的影響。將95%vol乙醇溶液用蒸餾水配制成乙醇濃度分別為30%vol、40%vol、50%vol、60%vol的4組乙醇水溶液，模擬不同酒精度數(shù)的白酒，分別加入相同濃度的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.3方法分析測(cè)定，每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行樣品，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 樣品溶液中乙醇濃度對(duì)提取效率的影響

圖2表明，4組實(shí)驗(yàn)的回收率均在96%～102%之間，說(shuō)明在30%vol～60%vol濃度范圍的乙醇對(duì)實(shí)驗(yàn)提取效率無(wú)明顯影響。

2.2 方法適用性實(shí)驗(yàn)

由于生產(chǎn)工藝的不同，我國(guó)白酒的主要香型分為5種：濃香型、清香型、醬香型、米香型和其他香型[15]。白酒的香型與其化學(xué)組成部分密切相關(guān)，不同香型的白酒中成分差別較大。為了考察不同香型白酒中的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)甜蜜素的測(cè)定的影響，本方法進(jìn)行了方法適用性的研究。

取未檢出甜蜜素的濃香型、清香型、醬香型白酒樣品，分別加入相同濃度的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.3測(cè)定方法分析測(cè)定。實(shí)驗(yàn)共3組，每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行樣品，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同香型白酒方法適用性實(shí)驗(yàn)

圖1 樣品溶液pH值對(duì)提取效率的影響

圖3表明，3組實(shí)驗(yàn)的回收率均在96%～103%之間，說(shuō)明白酒的香型對(duì)甜蜜素的測(cè)定無(wú)干擾，本方法可適用于各種香型白酒中甜蜜素的檢測(cè)。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將處理好的甜蜜素衍生待測(cè)液放置于4℃下冷藏保存，每隔1 h測(cè)定1次，重復(fù)測(cè)定4次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)明顯差異，在樣品溶液處理后的24～48 h之間，不定時(shí)重復(fù)測(cè)定6次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)明顯差異。說(shuō)明本方法處理的甜蜜素衍生物性質(zhì)穩(wěn)定，可靠性好。

2.4 方法的線性范圍和檢出限

將濃度為100 mg/L的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋，分別配制成含量為0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.3測(cè)定方法分析測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。以甜蜜素的峰面積y對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程：Y=11121X+4372.6，R2=0.9994。

結(jié)果表明，甜蜜素的含量在0.5～10.0 mg/L之間時(shí)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（見(jiàn)圖4）。

圖4 甜蜜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）和某陽(yáng)性白酒樣品氣相色譜圖（B）

方法的最低檢出限按3倍信噪比計(jì)算，量取10 mL白酒樣品，甜蜜素添加濃度為標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)，按照1.2.3測(cè)定方法分析測(cè)定，得到方法的最低檢出限為0.2 mg/L，能夠滿足日常監(jiān)測(cè)的需要。

2.5 方法的回收率和精密度

分別在空白白酒樣品中添加從低到高3個(gè)濃度水平的甜蜜素標(biāo)樣，添加濃度分別為0.5 mg/L、2.0 mg/L和5.0 mg/L，按實(shí)驗(yàn)1.2.3方法測(cè)定，每個(gè)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率和精密度，所得結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 方法回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

實(shí)驗(yàn)測(cè)定的回收率在92.3%～102.6%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.5%～4.3%之間，符合分析檢測(cè)試驗(yàn)的要求。結(jié)果表明，本方法測(cè)定白酒中甜蜜素精密度良好，加標(biāo)回收率符合要求。

3 實(shí)際樣品的檢測(cè)

利用本研究建立的分析方法對(duì)78個(gè)市售白酒樣品中的甜蜜素進(jìn)行了測(cè)定，其中包括濃香型白酒20個(gè)，清香型白酒31個(gè)，醬香型白酒17個(gè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3個(gè)樣品檢出甜蜜素（圖5），其余的均未檢出。然后3個(gè)陽(yáng)性樣品用GB 5009.97—2016中第三法LC-MS/MS分析方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行確證，均為陽(yáng)性樣品（表2），兩種方法所得結(jié)果具有較好的一致性。結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確可靠，可用于白酒中甜蜜素的檢測(cè)。

表2 兩種方法測(cè)定甜蜜素含量結(jié)果

4 結(jié)論

本研究建立了一種氣相色譜-火焰熱離子檢測(cè)器測(cè)定白酒中甜蜜素的方法，并應(yīng)用本方法對(duì)市售78個(gè)白酒樣品中的甜蜜素進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，本方法無(wú)假陽(yáng)性干擾、操作簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、方法檢出限低，能夠滿足用氣相色譜法測(cè)定白酒中甜蜜素的要求。本方法的建立彌補(bǔ)了國(guó)標(biāo)中氣相色譜法不適用于白酒樣品的不足，為白酒中測(cè)定甜蜜素的提供了新的工具，可在白酒企業(yè)質(zhì)量把關(guān)方面發(fā)揮積極作用。

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