蓖麻毒素毒性作用機(jī)制及防治研究進(jìn)展

王玉霞，喬 虹，劉子僑

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850；2.南開(kāi)大學(xué)法學(xué)院，天津 300350）

蓖麻毒素毒性作用機(jī)制及防治研究進(jìn)展

王玉霞1，喬 虹1，劉子僑2

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850；2.南開(kāi)大學(xué)法學(xué)院，天津 300350）

王玉霞，研究員，1997年畢業(yè)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)專(zhuān)業(yè)獲博士學(xué)位。2012-2014年，作為訪問(wèn)學(xué)者在內(nèi)布拉斯加醫(yī)學(xué)中心從事轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型研究。承擔(dān)軍隊(duì)十二五重大新藥創(chuàng)制專(zhuān)項(xiàng)、973、海洋863、國(guó)家自然科學(xué)基金等課題，在靶向抗腫瘤藥物、多糖佐劑、納米制劑的安全性研究中取得了較好進(jìn)展，在神經(jīng)性毒劑主動(dòng)免疫、蓖麻毒素抗毒藥物及免疫分析等方面取得了顯著成績(jī)。現(xiàn)兼任中國(guó)毒理學(xué)會(huì)飼料專(zhuān)業(yè)委員會(huì)委員、中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì)工業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)分會(huì)理事。目前獲授權(quán)發(fā)明專(zhuān)利9項(xiàng)，在國(guó)際和國(guó)內(nèi)學(xué)術(shù)期刊發(fā)表論文60余篇，其中30余篇為SCI收錄。

蓖麻毒素為提取自蓖麻子的植物毒素，屬于Ⅱ型核糖體活性抑制劑，含有A和B亞基（RTA和RTB），通過(guò)二硫鍵相連。RTB與靶細(xì)胞表面的糖蛋白或糖脂結(jié)合，介導(dǎo)毒素內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞并沿逆向轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，還原釋放RTA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)RTA通過(guò)其RNA核糖酶活性抑制蛋白合成產(chǎn)生細(xì)胞毒性。除蛋白合成抑制作用，蓖麻毒素還具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子釋放及過(guò)氧化作用。蓖麻毒素具有制備成本低廉、性質(zhì)穩(wěn)定、多種中毒途徑和無(wú)特效解毒藥等特點(diǎn)。由于它毒性劇烈，作為生物戰(zhàn)劑和恐怖劑，嚴(yán)重威脅公共安全。本文針對(duì)蓖麻毒素作為恐怖劑應(yīng)用歷史、結(jié)構(gòu)和毒性作用機(jī)制、檢測(cè)方法和特異性抗毒藥物研究進(jìn)行綜述。

蓖麻毒素；核糖體活性抑制蛋白；生物恐怖

蓖麻在世界各國(guó)均有種植，主要集中在印度、中國(guó)和巴西，占世界產(chǎn)量的95%以上。蓖麻全株有毒，其中蓖麻籽中毒素含量最高。蓖麻毒素（ricin）制備成本低廉、毒性極強(qiáng)、多種中毒途徑、潛伏期長(zhǎng)、性質(zhì)穩(wěn)定、無(wú)特效的解毒藥。近10年來(lái)，蓖麻毒素作為暗殺、恐怖武器已構(gòu)成全球性威脅。因此，蓖麻毒素易于為恐怖分子利用，隨著反恐怖斗爭(zhēng)的不斷升級(jí)，對(duì)蓖麻毒素作為恐怖劑的偵檢、防護(hù)及中毒急救越來(lái)越受到國(guó)際關(guān)注。

1 蓖麻毒素

蓖麻（Ricinus communis）是大戟科蓖麻屬植物，是重要的油料作物，除蓖麻油外，其種子含有大量的蓖麻毒素。據(jù)記載，1888年德國(guó)科學(xué)家Stiumark攻讀博士期間，從蓖麻籽中分離得到一種毒蛋白，并命名為蓖麻毒素。目前，全球每年上百萬(wàn)噸蓖麻籽用于生產(chǎn)蓖麻油，其廢物蓖麻粕重量的5%是蓖麻毒素。由于來(lái)源廣，制備簡(jiǎn)單，可通過(guò)施放氣溶膠或噴灑液體、污染食物和水源、用注射器刺入人體等途徑使人中毒，美、英、加和法等國(guó)一直嘗試將蓖麻毒素作為生物戰(zhàn)劑。早在第一次和第二次世界大戰(zhàn)期間，美國(guó)和加拿大就試圖制備蓖麻毒素生物戰(zhàn)劑氣溶膠或毒性彈頭［1］。作為純化蛋白，蓖麻毒素毒性作用沒(méi)有炭疽桿菌和肉毒桿菌持久，且作為生物戰(zhàn)劑大規(guī)模使用需要成噸的蓖麻毒素，因此難以作為戰(zhàn)劑使用［2］。蓖麻毒素引起關(guān)注的原因在于它易于制備，可以為恐怖分子用于恐怖計(jì)劃。

誤食蓖麻籽導(dǎo)致中毒及利用蓖麻毒素進(jìn)行暗殺和恐怖活動(dòng)時(shí)有報(bào)道。據(jù)記載，蓖麻毒素中毒已經(jīng)超過(guò)700人次，最早追溯到1974年Balint［3］報(bào)道的蓖麻毒素毒蛋白中毒，最著名的是1978年保加利亞官員馬爾科夫被保加利亞特務(wù)刺傷，死于蓖麻毒素中毒，暗殺武器為克格勃制造的毒傘［2］。近年來(lái)，利用蓖麻毒素進(jìn)行暗殺和恐嚇的事件不斷發(fā)生，Bozza等［4］匯總了為人矚目的蓖麻毒素事件，其中包括2012年Assiri報(bào)道的蓖麻毒素粉末引起的消化道致死事件、2013年Shannon Richardson寄給美國(guó)總統(tǒng)奧巴馬及參議員Wicker的含蓖麻毒素信件。1997年，美國(guó)政府將一些包括蓖麻毒素在內(nèi)的核糖體活性抑制劑（ribosome inactivating pro?teins，RIP）歸類(lèi)為B類(lèi)生物戰(zhàn)劑，強(qiáng)調(diào)對(duì)蓖麻毒素恐怖威脅的應(yīng)急措施是非常必要的［5-7］。

2 蓖麻毒素的分子結(jié)構(gòu)和毒性作用機(jī)制

2.1 蓖麻毒素的分子結(jié)構(gòu)

20世紀(jì)70年代，蓖麻毒素的一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定己經(jīng)完成，蓖麻毒素含有2個(gè)肽鏈，A鏈（ricin A chain，RTA）和B鏈（ricin B chain，RTB），RTA分子質(zhì)量為32 ku，等電點(diǎn)為7.3；RTB分子質(zhì)量為34.7 ku，等電點(diǎn)為5.2；氨基酸和DNA序列均已發(fā)表［8-9］。

有關(guān)蓖麻毒素的二級(jí)結(jié)構(gòu)研究顯示，蓖麻毒素是典型的Ⅱ型RIP，RTA和RTB通過(guò)二硫鍵相連接，Lord等［10］和Dang等［11］就蓖麻毒素的合成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳盡的研究。起初，在植物細(xì)胞中合成的一條單鏈前體稱為preproricin，RTA序列含有26個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和9個(gè)氨基酸的前肽，在RTA和RTB之間有個(gè)12個(gè)氨基酸殘基組成的連接肽。信號(hào)肽轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，前體蛋白的信號(hào)肽切除，初級(jí)N-糖基化及分子間二硫鍵形成，對(duì)于蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)的形成是非常重要的。此時(shí)的前肽和連接肽依然存在，可以維護(hù)RTA為非活性狀態(tài)，保護(hù)植物細(xì)胞免遭毒性作用。進(jìn)而，糖基化的毒素前體由囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基復(fù)合體，最終進(jìn)入空泡。此過(guò)程中完成了進(jìn)一步的糖基修飾、N端前肽和連接肽清除最終形成了Ⅱ型RIP［12-13］。

值得注意的是，來(lái)自不同蓖麻及其變種的蓖麻毒素，氨基酸序列及糖基修飾不完全相同，分子量也具有輕微的差異。例如Hegde［14］等分離出2種不同的毒蛋白蓖麻毒素D和蓖麻毒素E，Cawley等［9］分離出3種不同的毒蛋白：蓖麻毒素1、蓖麻毒素2和蓖麻毒素3。Skilleter等［15］和Foxwell等［16］的研究揭示，RTA含有267個(gè)氨基酸，由于糖基化水平的差異，RTA分為2個(gè)亞類(lèi)，亞類(lèi)A1占總RTA 60%以上，含有1個(gè)寡糖組成單元，（Man）3-4（Fuc）1（Xyl）1（GlcNAc）2；亞類(lèi)A2占總RTA 30%以上，比A1多1個(gè)富含甘露糖的寡糖。而RTB由262個(gè)氨基酸組成，含有2個(gè)組成為（Man）4-6（GlcNAc）2的寡糖；Montfort等［17-18］報(bào)道的RTA含有263個(gè)氨基酸殘基，有（GIcNAc）2（Man）4寡糖鏈修飾；RTB是259個(gè)氨基酸殘基組成的序列，含2個(gè)寡糖鏈，（GlcNAc）2（Man）8和（GlcNAc）2（Man）7。

2.2 蓖麻毒素的毒性作用機(jī)制

早期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蓖麻毒素可引起紅細(xì)胞凝聚及可溶性血清蛋白出現(xiàn)沉淀，一度認(rèn)為此凝聚作用是其毒性的根源。到1891年，Ehrlich提出了異議，指出毒素可能是通過(guò)結(jié)合簇（haptophore）固定于細(xì)胞或組織表面，而發(fā)揮毒性作用的部分是毒素的毒簇（toxophore）。待蓖麻毒素晶體結(jié)構(gòu)被解析，證實(shí)了Ehrlich假設(shè)的合理性［19-20］。在蓖麻毒素毒性作用中，RTA和RTB承擔(dān)了不可或缺的角色，RTA具有細(xì)胞毒性，RTB負(fù)責(zé)與細(xì)胞識(shí)別結(jié)合。

RTA具有RNA N-糖苷酶活性，1個(gè)分子的蓖麻毒素只需要1 min就可以抑制上千個(gè)核糖體的活性［21-22］。僅憑這一點(diǎn)還無(wú)法解釋蓖麻毒素極端的毒性作用，其小鼠的LD50為8.0 μg·kg-1［23］，達(dá)到如此毒性，毒素必然有一跨越細(xì)胞膜進(jìn)入靶細(xì)胞發(fā)揮毒性作用的有效途徑。

植物中的RIP有2類(lèi)。第一類(lèi)是單鏈多肽，分子質(zhì)量約30 ku，如天花粉和皂角素等，體外與游離核糖體反應(yīng)，但對(duì)完整細(xì)胞無(wú)毒性作用。第二類(lèi)分子質(zhì)量約60 ku，含有A、B兩條多肽共價(jià)連接；A鏈類(lèi)似于第一類(lèi)RIP，而B(niǎo)鏈具有糖基結(jié)合位點(diǎn)，介導(dǎo)A鏈轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，與核糖體反應(yīng)產(chǎn)生毒性。蓖麻毒素是第二類(lèi)RIP中最典型的一種［24］，其B鏈屬于糖基結(jié)合蛋白，為外源凝集素，介導(dǎo)毒素進(jìn)入細(xì)胞［25］。Sandvig等［26］應(yīng)用HeLa細(xì)胞，測(cè)定125I標(biāo)記的毒素與細(xì)胞的結(jié)合情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面存在大約3.3×107個(gè)毒素結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合常數(shù)為2.6× 107mol·L-1。細(xì)胞表面含有大量的半乳糖，N-乙酰半乳糖胺，及N-乙酰神經(jīng)氨酸［27］，一旦與RTB結(jié)合，毒素便以籠形蛋白依賴及不依賴的形式內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞［28］。

蓖麻毒素進(jìn)入細(xì)胞后存在于胞內(nèi)體中，胞內(nèi)體的成分不同于溶酶體，pH卻極相似，為5.2～6.5。在低pH環(huán)境中，少部分的蓖麻毒素-半乳糖受體復(fù)合物發(fā)生解離，受體返回細(xì)胞表面重新利用，胞內(nèi)體與初級(jí)溶酶體融合，形成次級(jí)溶酶體，其中又有部分復(fù)合物解離，部分受體又得以返回膜表面。大部分毒素進(jìn)入細(xì)胞后被溶酶體降解或再循環(huán)至細(xì)胞表面［29］，只有大約5%的毒素分子進(jìn)入高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)（trans-Golgi network，TGN），在此形成活性毒素［30-31］。蓖麻毒素進(jìn)入TGN后的作用細(xì)節(jié)至今仍不清楚，已經(jīng)明確的是，毒素通過(guò)逆轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER），進(jìn)入ER的途徑可能與B鏈識(shí)別糖基有關(guān)［32-33］。由其他蛋白毒素的逆轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究得知，許多蛋白毒素在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)歷了相同或相似的內(nèi)吞、胞內(nèi)體運(yùn)輸、從ER易位進(jìn)入胞漿這一反向跨膜易位過(guò)程，C端的短肽（REDKL）類(lèi)似于ER保守序列KDEL，可利用KDEL-ER蛋白分揀系統(tǒng)高效到達(dá)ER腔［34］。蓖麻毒素不具有KDEL或其同源序列，它先結(jié)合于一種含KDEL序列、末端具有半乳糖殘基的ER定居蛋白，形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)移到ER腔內(nèi)，與KDEL受體結(jié)合之后復(fù)合物解離，蓖麻毒素釋放入ER腔，游離的ER定居蛋白又返回TGN。蓖麻毒素在ER中利用分泌蛋白跨ER膜的各種易位因子進(jìn)行易位，進(jìn)入胞漿的方式正好相反于新生蛋白的分泌方式［35］。RTB不僅僅介導(dǎo)全毒素結(jié)合于細(xì)胞膜受體上的半乳糖基，還介導(dǎo)毒素到ER定居蛋白，提高了蓖麻毒素內(nèi)吞和加工效率，有助于毒素在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定，對(duì)蓖麻毒素毒性的實(shí)現(xiàn)至關(guān)重要。

一般認(rèn)為，進(jìn)入ER腔的蓖麻毒素的鏈間二硫鍵在跨膜前發(fā)生降解，原先被封閉的RTA的C末端暴露，激發(fā)了RTA借助于各種易位因子，以伸展形式進(jìn)入胞漿，再折疊成活性構(gòu)象［36-37］。在ER腔內(nèi)的毒素，至少其A鏈轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿［38］，Lord等［10，39］發(fā)現(xiàn)，A鏈逆轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞漿是借用細(xì)胞降解錯(cuò)誤折疊蛋白的路線，當(dāng)毒素進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白降解通路（ER-associated protein degradation，ERAD）后，大量的毒素被泛素化，并被細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白酶降解，只有小部分得以逃脫的毒素與核糖體結(jié)合。Ⅱ型RIP毒素毒性之間的巨大差異可能與毒素在ERAD途徑降解時(shí)的逃逸能力不同有關(guān)。

進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后RTA高效率地進(jìn)攻核糖體使其滅活［40］，一分子RTA、1 min可以滅活1777個(gè)核糖體［22］。RTA的作用位點(diǎn)在28s rRNA近3’端延伸袢［41-42］，導(dǎo)致單一的腺嘌呤連接糖苷鍵斷裂，丟失腺嘌呤A4324，不是直接切斷RNA鏈，也不是增加RNA對(duì)水解酶或裂解酶的敏感性［43］。rRNA袢對(duì)于蛋白合成延伸因子的結(jié)合至關(guān)重要，微小的結(jié)構(gòu)破壞即可干擾核糖體、EF-2、GTP復(fù)合體的形成［44］，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的抑制，最終細(xì)胞死亡［23，45］。

除了抑制新蛋白合成之外，陸續(xù)有蓖麻毒素其他毒性作用的報(bào)道。早在1987年Griffiths等［46］研究發(fā)現(xiàn)，蓖麻毒素可引起淋巴和腸細(xì)胞凋亡。1990年，Waring等［47］發(fā)現(xiàn)，蓖麻毒素可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、未成熟T細(xì)胞出現(xiàn)DNA碎片，發(fā)生與凋亡有關(guān)的生化改變。后續(xù)的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了蓖麻毒素誘導(dǎo)上皮樣細(xì)胞發(fā)生凋亡樣的形態(tài)學(xué)改變［48］、誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)甲狀腺及脾細(xì)胞出現(xiàn)凋亡［49］。

Oda等［48］及Waring等［47］的研究都指出，蓖麻毒素誘導(dǎo)的凋亡機(jī)制與其抑制蛋白合成作用無(wú)關(guān)。蓖麻毒素引起的細(xì)胞凋亡并非A鏈依賴，即屬于與蛋白合成抑制不相關(guān)的途徑［50］。蓖麻毒素細(xì)胞毒性存在明顯的劑量依賴性，高濃度時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞壞死，低濃度時(shí)卻引起細(xì)胞發(fā)生凋亡。目前認(rèn)為有多種途徑參與［51］，包括蓖麻毒素對(duì)于DNA的脫腺嘌呤作用及激活細(xì)胞死亡的線粒體途徑［52］和直接干擾DNA的修復(fù)機(jī)制［53］。

蓖麻毒素中毒后的早期急性反應(yīng)，如發(fā)熱、肝出血性壞死、腹水、胸水滲出和腸道出血壞死性炎癥等還不能完全用抑制蛋白質(zhì)合成來(lái)解釋。研究表明，蓖麻毒素誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的外周血單核細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β），同時(shí)在蓖麻毒素中毒大鼠的血漿中亦可檢測(cè)到低水平的TNF-α［54］。1997年，董巨瑩等［55］報(bào)道了蓖麻毒素中毒誘導(dǎo)小鼠肝產(chǎn)生TNF-α，IL-1，IL-6和IL-8。1994年，Muldoon等［56］發(fā)現(xiàn)，注射抗TNF的抗體，可明顯降低蓖麻毒素對(duì)小鼠的氧化損傷。Nadkarni等［57］發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞因子釋放與蓖麻毒素構(gòu)建的免疫毒素引發(fā)的發(fā)熱、肌痛、毛細(xì)血管滲漏綜合征等不良反應(yīng)有關(guān)。蓖麻毒素誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生的機(jī)制可能與細(xì)胞膜受體作用后，啟動(dòng)了某些核轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致了一些細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子進(jìn)而可引起重要臟器及組織的氧化損傷。

Muldoon等［58］發(fā)現(xiàn)，蓖麻毒素中毒小鼠尿液中丙二醛、甲醛和丙酮的含量增加，中毒后36 h各臟器脂質(zhì)過(guò)氧化程度明顯升高、還原型谷胱甘肽的明顯減少及DNA單鏈斷裂程度最為嚴(yán)重，認(rèn)為氧化作用可以歸屬到蓖麻毒素的毒性機(jī)制中，并提出脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的機(jī)制與毒素激活巨噬細(xì)胞分泌活性氧（reactive oxygen species，ROS）有關(guān)［59］。1997年，Sadani等［60］研究了蓖麻毒素誘導(dǎo)的大鼠甲狀腺損傷機(jī)制，也發(fā)現(xiàn)中毒大鼠甲狀腺組織抗氧化狀態(tài)的改變。研究表明，TNF-α、ROS和鐵離子等對(duì)蓖麻毒素誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化損傷具有重要的調(diào)節(jié)作用，在毒素中毒的對(duì)癥治療中，注射抗TNF-α的抗體，可以明顯降低小鼠尿液丙二醛、甲醛、丙酮的含量，給予去鐵敏（desferrioxamine）可減少蓖麻毒素誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化的水平。

蓖麻毒素導(dǎo)致細(xì)胞死亡機(jī)制包括蛋白合成抑制及非蛋白合成抑制，細(xì)胞表面蛋白的特征決定進(jìn)入細(xì)胞的毒素的量和毒性。我們前期的研究結(jié)果顯示，蓖麻毒素在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)富集分布于脾和肝等組織［61-62］。Derenzini等［63］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，蓖麻毒素在血液中可快速被網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞清除，肝病理檢查發(fā)現(xiàn)肝竇間隙嚴(yán)重?fù)p傷，是肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞主動(dòng)攝取蓖麻毒素所致，與毒素表面的甘露糖與細(xì)胞甘露糖受體識(shí)別促進(jìn)了毒素的細(xì)胞內(nèi)吞噬密切相關(guān)［64-65］。

除了公認(rèn)的RTB與細(xì)胞表面的半乳糖基結(jié)合之外，蓖麻毒素含有的甘露糖可以被細(xì)胞表面的甘露糖受體識(shí)別進(jìn)入細(xì)胞，因此，蓖麻毒素對(duì)于表面富含甘露糖細(xì)胞的毒性也要引起重視。Skilleter等［15］體外實(shí)驗(yàn)還原裂解了蓖麻毒素二硫鍵，經(jīng)分離得到RTA和RTB，進(jìn)而使用酶處理去糖基，與含有糖基的RTA和RTB分別作用于肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有糖基的游離的RTA可以被肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞主動(dòng)內(nèi)吞，使用單糖D-甘露糖、L-巖澡糖或末端含有甘露糖的卵清蛋白都可以抑制75%～90%的攝取量，而D-半乳糖不能抑制；α-甘露糖苷酶切除糖基的RTA進(jìn)入肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的量下降了60%。說(shuō)明RTA通過(guò)細(xì)胞表面甘露糖受體介導(dǎo)進(jìn)入肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除了RTA與甘露糖受體結(jié)合進(jìn)入肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞外，RTB進(jìn)入肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的量是RTA的2倍，且α-甘露糖苷酶處理只能微弱影響RTB進(jìn)入細(xì)胞的水平，天然RTB及α-甘露糖苷酶處理的RTB在細(xì)胞內(nèi)聚集均可被D-甘露糖，L-巖澡糖或卵清蛋白抑制，其中D-甘露糖抑制能力較低（約40%），原因可能是α-甘露糖苷酶不能徹底去除RTB的甘露糖所致。此外，進(jìn)入肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞RTB是RTA的5～7倍，RTB和糖苷酶處理后的RTB沒(méi)有明顯區(qū)別，且只有D-半乳糖有明顯抑制，說(shuō)明天然的RTA可以被肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)吞，卻不能在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中聚集。

就肝細(xì)胞而言，蓖麻毒素進(jìn)入肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，主要靠RTB與細(xì)胞表面半乳糖基識(shí)別；對(duì)于肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，RTB除了識(shí)別細(xì)胞表面半乳糖基外，RTB的甘露糖與細(xì)胞表面甘露糖基受體識(shí)別發(fā)揮了重要作用。此外，RTA與細(xì)胞表面甘露糖基受體識(shí)別也發(fā)揮了重要作用，毒素進(jìn)入肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，至少很大一部分是依賴于細(xì)胞的甘露糖受體與RTA和RTB的甘露糖基結(jié)合介導(dǎo)的內(nèi)吞過(guò)程。

綜合分析，幾乎所有的真核細(xì)胞表面都表達(dá)含有半乳糖基修飾的受體，蓖麻毒素RTB與半乳糖基識(shí)別進(jìn)入細(xì)胞是其細(xì)胞毒性作用的主要機(jī)制。然而有部分細(xì)胞如吞噬細(xì)胞等，含有豐富的甘露糖基受體，雖然其數(shù)目遠(yuǎn)不如半乳糖基，可甘露糖基受體與蓖麻毒素表面甘露糖的親和力卻是細(xì)胞表面半乳糖與毒素親和力的近10倍［66］。此外，蓖麻毒素與細(xì)胞膜受體廣泛結(jié)合后，對(duì)受體介導(dǎo)的下游信號(hào)系統(tǒng)產(chǎn)生影響，如一些核轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)、細(xì)胞因子的分泌、抗氧化機(jī)制的影響可能是導(dǎo)致毒素多種毒性作用的原因所在。

3 蓖麻毒素的檢測(cè)分析

蓖麻毒素的快速檢測(cè)直接關(guān)系到有效的急救治療。依據(jù)蓖麻毒素的理化性質(zhì)和免疫原性已建立了多種快速、靈敏、特異的檢測(cè)方法，如由毒素的蛋白免疫原性建立的免疫學(xué)分析［67-68］、生物傳感器［69-71］及根據(jù)毒素的組成等建立的儀器分析［72-75］和免疫吸附結(jié)合電化學(xué)分析方法［76］。

不同的蓖麻毒素檢測(cè)方法具有不同的檢測(cè)原理和不同的檢測(cè)靈敏度及檢測(cè)樣本需求。毛細(xì)管電泳結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸附電離質(zhì)譜法等儀器分析方法多根據(jù)毒素的理化性質(zhì)，具有靈敏度高，樣品用量少等特點(diǎn)，但儀器昂貴，普及困難，難以進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速分析。根據(jù)毒素的抗原特性建立的免疫分析方法如放免分析和免疫PCR具有較高的檢測(cè)靈敏度，但是要求在專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，生物傳感器操作快速，然而檢測(cè)靈敏度差異較大，干擾因素多。蓖麻毒素快速檢測(cè)試紙是根據(jù)膠體金免疫層析原理，其檢測(cè)靈敏度高，操作簡(jiǎn)便快速，然而多種樣品本身對(duì)此方法存在嚴(yán)重的干擾［77］。

分析樣品中是否含有蓖麻毒素，同時(shí)還可以告知毒素是否還具有毒力的方法才是更有效的檢測(cè)分析方法［4］。雙夾心ELISA［78-79］、化學(xué)發(fā)光［80］、膠體金免疫層析［67，77］、xMAP微球免疫分析［81］、DNA適配子及拉曼分析［82］、表面等離子共振（SPR）［79，83-85］、免疫PCR［86］、免疫吸附結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用［87］及免疫捕獲飛行質(zhì)譜［75］等無(wú)法檢測(cè)毒素生物活性。RTA作為N-糖苷酶與核糖體60s大亞單位的28s RNA作用，水解腺嘌呤的N-糖苷鍵，脫去腺嘌呤，可通過(guò)反相化學(xué)發(fā)光［88］、HPLC［89］、拉曼［90］和MS檢測(cè)等［75］檢測(cè)釋放的腺嘌呤判斷蓖麻毒素活性。還可以通過(guò)免疫分析［91］、HPLC［92］、質(zhì)譜［93］和PCR技術(shù)［94］檢測(cè)分析樣品中的蓖麻毒素蛋白和DNA，通過(guò)蛋白合成抑制檢測(cè)蓖麻毒素導(dǎo)致的核糖體功能失活［95］。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)［96-99］和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［100］檢測(cè)RTB鏈糖基結(jié)合位點(diǎn)的完整性以及RTA鏈?zhǔn)欠窬哂写呋钚浴?/p>

4 蓖麻毒素中毒治療及其抗毒藥物

4.1 中毒途徑及對(duì)癥治療

蓖麻毒素毒性強(qiáng)度取決于中毒途徑，吸入毒性高于經(jīng)口途徑，潛伏期一般為4～8 h。經(jīng)口毒性主要作用靶器官為肝和脾，其他臟器也會(huì)受到損傷；吸入性毒性則表現(xiàn)為非心源性肺水腫［101］。

吞服蓖麻籽可通過(guò)胃腸道排出，而咀嚼可加速毒素釋放和吸收。嚴(yán)重中毒可導(dǎo)致廣泛的細(xì)胞中毒性器官損傷，如水腫、出血和壞死等，還可引起中毒性肝病、腎病及出血性胃腸炎。中毒較輕的可在48～72 h恢復(fù)，嚴(yán)重者可因呼吸和循環(huán)衰竭在24 h～ 4 d死亡，也有中毒者在恢復(fù)期因腎功能衰竭死亡［102-104］。Audi等［103］報(bào)道，蓖麻毒素口服中毒，小鼠LD50為30 mg·kg-1，人致死劑量為1～20 mg·kg-1。小鼠吸入小于5 μm大小的毒素氣溶膠，LD50為3～5 μg·kg-1。氣溶膠顆粒直徑越小，危害越大，首發(fā)癥狀起于8 h內(nèi)，表現(xiàn)為呼吸困難、發(fā)熱、咳嗽、惡心及胸部緊迫、大汗、肺水腫、紫紺，最后導(dǎo)致低血壓、呼吸衰竭，甚至死亡。亞致死劑量中毒導(dǎo)致的急性肺損傷后需要長(zhǎng)時(shí)間才能恢復(fù)［105］。注射途徑的小鼠最小致死劑量為0.7～2 μg·kg-1，LD50為5～10 μg·kg-1，注射部位會(huì)出現(xiàn)肌肉、淋巴結(jié)壞死，肝、腎、脾功能障礙、胃腸道出血，患者最后死于多臟器衰竭［103，106］。當(dāng)年馬爾科夫在被含有蓖麻毒素的毒傘尖刺傷后第3天死亡。中毒后24 h會(huì)相繼出現(xiàn)疲勞、惡心、嘔吐和發(fā)熱癥狀，進(jìn)而發(fā)展為廣泛性的壞死性淋巴結(jié)病和注射部位的組織壞死。臨終的并發(fā)癥有胃腸道出血、失血性休克及腎衰竭［107］。無(wú)破損的皮膚接觸毒素一般不會(huì)引起中毒，眼睛接觸可致結(jié)膜炎、瞳孔放大和視神經(jīng)損傷。

由于蓖麻毒素起效迅速、毒性作用不可逆，其中毒的有效治療非常困難，對(duì)于高危職業(yè)的軍人和外交人員應(yīng)該接種有效的疫苗；按照生物戰(zhàn)劑的洗消方案處理和輔助性治療是目前常用的治療手段，糾正體液的酸堿平衡、保護(hù)肝腎功能是治療的第一步。對(duì)于吸入性中毒，要注意呼吸道的對(duì)癥處理，比如給予抗炎藥物、鎮(zhèn)痛藥和人工換氣等。研究顯示，地塞米松和二氟甲基鳥(niǎo)氨酸在延長(zhǎng)中毒小鼠的存活時(shí)間上明顯好于丁羥茴醚（butylated hydroxyani?sole）和維生素E［101，103］。經(jīng)口中毒者，應(yīng)盡早洗胃、催吐、導(dǎo)瀉和腸灌洗，為減少毒物繼續(xù)吸收，還可以口服蛋清或冷牛奶、冷米湯，必要時(shí)給予胃黏膜保護(hù)劑。

4.2 抗毒藥物

值得注意的是，針對(duì)蓖麻毒素中毒的預(yù)防和急救藥物研究已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展，人們首先想到的是從源頭阻止毒素進(jìn)入細(xì)胞，包括使用小分子拮抗肽、免疫疫苗及中和性抗體［108］。1991年，Lambert等［109］制備了含有2個(gè)半乳糖殘基、具有三叉結(jié)構(gòu)的糖肽可以與RTB結(jié)合。Khan等［110］用隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)篩選到與蓖麻毒素特異性結(jié)合的12肽，Trp-Pro-His-Arg-His-His-His-Ser-Glu-Iso-Gly-His，與單抗比較，此肽和蓖麻毒素的結(jié)合緩慢而解離速率較快，用于抗毒沒(méi)有明顯優(yōu)勢(shì)。

抗蓖麻毒素單抗可被動(dòng)保護(hù)同系小鼠抵抗蓖麻毒素中毒［111-113］，說(shuō)明免疫防護(hù)產(chǎn)生特異性抗體，可有效抵抗蓖麻毒素襲擊。免疫疫苗可采用脫毒的毒素或去糖基化的RTA［114］，免疫動(dòng)物可對(duì)抗致死劑量的蓖麻毒素中毒［115-116］。RTA本身的毒性作用可通過(guò)突變其酶活性部位的Y80，Y123，E177，R180，N209和W211等關(guān)鍵氨基酸殘基降低其毒性，而RTA抗原免疫動(dòng)物引起局部甚至全身的血管滲漏綜合征（vascular leak syndrome，VLS）可通過(guò)突變氨基酸L74，D75和V76而減輕或避免。因此，重組RTA突變體作為免疫抗原均明顯地降低了毒副作用，并具有很好的抗毒活性［117-118］。Kende等［119］研發(fā)了針對(duì)毒素氣溶膠襲擊用于黏膜免疫的免疫微球（Soligenix Inc）。研發(fā)的RiVax?疫苗免疫小鼠、家兔和人員都表現(xiàn)出非常好的抗毒效果［120-122］，可對(duì)抗10倍LD50劑量的蓖麻毒素襲擊，可使100%免疫動(dòng)物抵抗致死劑量的蓖麻毒素氣溶膠攻擊［123］。

蓖麻毒素免疫疫苗主動(dòng)免疫有很好的抗毒效果，疫苗產(chǎn)生有效的抗毒抗體至少需要1個(gè)月以上的免疫時(shí)間。對(duì)于沒(méi)有進(jìn)行過(guò)免疫接種的中毒人員還需要特異性的抗毒抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫治療。以滅活全毒素、RTA及RTB為抗原制備的單克隆抗體均有明確的抗毒活性［112-113，124］，這些研究結(jié)果推動(dòng)了抗毒抗體研究［125-128］。Hu等［129］和Prigentu等［130］篩選了抗毒活性抗體并進(jìn)行了人源化，發(fā)現(xiàn)將RTA抗體和RTB抗體合用可提高抗毒效果，小鼠抗毒活性實(shí)驗(yàn)可以對(duì)抗5×LD50蓖麻毒素中毒。我國(guó)自行研制的蓖麻毒素抗毒抗體，在小鼠蓖麻毒素腹腔中毒后2 h后用于急救仍可完全對(duì)抗3個(gè)致死劑量的毒素中毒；致死劑量中毒后6 h給予抗體急救，仍有70%小鼠存活［131］，此抗體已經(jīng)完成了人源化研究。

特異性抗體可用于蓖麻毒素中毒的預(yù)防和急救，其效果與中毒時(shí)間和給藥時(shí)機(jī)密切相關(guān)，對(duì)于中毒時(shí)間稍長(zhǎng)、錯(cuò)過(guò)了最佳抗體治療的中毒人員，抗體難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，治療無(wú)效。況且，蓖麻毒素從中毒到出現(xiàn)明顯的中毒癥狀，至少有幾個(gè)小時(shí)的潛伏期。因此，與抗毒疫苗和抗體相比較，研制能進(jìn)入細(xì)胞的蓖麻毒素小分子拮抗劑同樣重要。

2010年，Wahome等［97］建立了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)高方法通量篩選蓖麻毒素小分子拮抗劑。Stechmann等［98］成功合成了小分子拮抗劑Retr-2，作用于中毒早期TGN的逆轉(zhuǎn)運(yùn)途徑從而具有抗毒活性，但要在中毒前1 h大劑量給予才有效。2013年Gupta等［132-133］研究合成了Retr-2的衍生物（S）-Retro-2.1。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，預(yù)防給藥抗蓖麻毒素活性提高了1000倍，是抗毒活性最強(qiáng)的小分子化合物。（S）-Retro-2.1是否能成為有效的急救藥物還需要進(jìn)一步進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)及安全性研究。

作為生物戰(zhàn)劑的蓖麻毒素的醫(yī)學(xué)防護(hù)，無(wú)論是戰(zhàn)時(shí)還是和平時(shí)期的反恐怖都是非常重要的。特異性醫(yī)學(xué)防護(hù)包括采用疫苗進(jìn)行預(yù)防和使用小分子抗毒藥物或大分子抗毒抗體進(jìn)行急救，理想的免疫疫苗能快速激活機(jī)體的免疫反應(yīng)，可對(duì)抗大劑量的毒素中毒，治療抗體或小分子藥物可對(duì)抗致死劑量的蓖麻毒素中毒并具有較寬的治療窗口。防護(hù)效果除了與毒素的中毒途徑、劑量相關(guān)外，還與治療藥物的給藥途徑、劑量及及給藥時(shí)機(jī)密切相關(guān)。

5 結(jié)語(yǔ)

蓖麻毒素作為典型的Ⅱ型RIP，其主要毒性作用機(jī)制為抑制細(xì)胞蛋白的合成，具有劇烈的細(xì)胞毒性。此外，它還具有誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子，引起脂質(zhì)過(guò)氧化及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。隨著反恐怖斗爭(zhēng)的不斷升級(jí)，對(duì)蓖麻毒素的偵檢、防護(hù)及中毒急救越來(lái)越受到國(guó)際關(guān)注。已經(jīng)建立多種蓖麻毒素檢測(cè)方法，其中能判定毒素、同時(shí)檢測(cè)其生物活性的方法是研究的重點(diǎn)。在蓖麻毒素的抗毒藥物研究中，疫苗免疫具有很好的預(yù)防效果，抗毒抗體作為急救藥物特異、有效，但對(duì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的毒素?zé)o效。因此，在開(kāi)發(fā)特異性大分子抗毒藥物的同時(shí)，安全有效、可用于預(yù)防及急救的小分子抗毒藥物有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。建立蓖麻毒素的檢測(cè)預(yù)警、防護(hù)及中毒治療體系，是軍事醫(yī)學(xué)研究中針對(duì)生物戰(zhàn)劑及恐怖劑襲擊的重點(diǎn)內(nèi)容。

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Toxicity and treament of ricin poisoning：a review

WANG Yu-xia1,QIAO Hong1,LIU Zi-qiao2
（1.Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China;2.School of Law,Nankai University,Tianjin 300350,China）

Ricin is a plant toxin isolated from the seed of the castor plant（Ricinus communis）.As a typical II ribosome inactivating protein，ricin consists of two polypeptide chains named ricin toxin A chain（RTA）and ricin toxin B chain（RTB），linked via a disulfide bridge.RTB binds to both glycopro?tein and glycolipid at the surface of the target cell and mediates ricin to be endocytosed and transported retro?gradely to the endoplasmic reticulum.After being reduced and retrotranslocated to the cytosol，RTA mediates its toxicity due to its activity of a RNA N-glycosidases.Aside from its main toxic effect of protein synthesis inhibition，ricin also displays other properties that contribute to its toxicity such as inducing apoptosis，cytokine secreting and peroxidation.Ricin is stable and can be easily isolated.It has many routes of intoxication with no specific antidotes.Due to its natural abundance，remarkable toxicity，and the potential to be used in biological warfare as well as terrorist attacks，ricin has been classified as a Category B biothreat agent.Here we reviewed its history as a biothreat agent，constitu?tion，intoxication mechanism，detection methods and the development of specific antitodes.

ricin;biothreat agent;ribosome inactivating protein;bioterrorism

WANG Yu-xia，Tel：（010）66931645，E-mail：wangyuxia1962@hotmail.com

R99，R996.2

A

1000-3002-（2016）12-1385-12

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.12.017

2016-11-20接受日期：2016-12-05）

（本文編輯：?jiǎn)?虹）

王玉霞，E-mail：wangyuxia1962@hotmail.com，Tel：（010）66931645