補(bǔ)體C5a在百草枯誘導(dǎo)急性肺損傷中的作用和機(jī)制

王仁喜，黎 燕

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所分子免疫學(xué)研究室，北京 100850）

補(bǔ)體C5a在百草枯誘導(dǎo)急性肺損傷中的作用和機(jī)制

王仁喜，黎 燕

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所分子免疫學(xué)研究室，北京 100850）

黎 燕，研究員，博士生導(dǎo)師，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所分子免疫學(xué)研究室。主要從事疾病的免疫應(yīng)答和免疫耐受調(diào)控靶點(diǎn)和機(jī)制研究，以及治療性基因工程抗體的研制。1993年獲國家政府津貼、1999年國家杰出青年基金、2003年解放軍總后勤部科技銀星。曾承擔(dān)并參加國家“863”和國家“973”等項(xiàng)目。

百草枯急性中毒受損最嚴(yán)重的是肺組織，而急性肺損傷是百草枯中毒致死的主要原因。補(bǔ)體活化產(chǎn)物C5a通過誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等在肺部聚集、活化，進(jìn)而產(chǎn)生過量的氧自由基和細(xì)胞因子等介導(dǎo)百草枯中毒后所導(dǎo)致的急性肺損傷。本文對補(bǔ)體C5a在百草枯誘導(dǎo)急性肺損傷中的作用和機(jī)制予以詳細(xì)的綜述。

補(bǔ)體；C5a；百草枯；急性肺損傷

百草枯，化學(xué)名稱是1-1-二甲基-4-4-聯(lián)吡啶陽離子鹽，是一種快速滅生性除草劑，是人類急性中毒死亡率最高的除草劑。口服中毒死亡率可達(dá)90%，且無特效解毒藥。國內(nèi)己有多例急性中毒病例報告，經(jīng)口誤服20%水劑30 mL以上者均死亡。百草枯中毒早期為急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征，死亡率為50%～70%；中毒后期出現(xiàn)肺纖維化、呼吸衰竭和多器官衰竭。百草枯中毒目前尚無特效解毒藥，中毒后臨床救治多以對癥和支持治療為主，如洗胃、導(dǎo)瀉、血液灌流、抗自由基藥物和免疫抑制劑等［1］，因無特異性治療藥物使得中毒死亡率居高不下［2］。對百草枯損傷機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒后所誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基對機(jī)體組織有巨大損傷效應(yīng)，維生素C、維生素E、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和乙酰半胱氨酸等抗自由基藥物可減輕自由基對機(jī)體組織的損傷；百草枯中毒可激活粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞合成并釋放大量炎癥細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）等，參與并加重機(jī)體組織損傷。目前，臨床嘗試使用重組人Ⅱ型TNF-α受體-Fc融合蛋白（combination fusion protein of humanⅡtype TNF-α and Fc fragment of anti?body，TNF-TNF-αR-Fc）（國產(chǎn)商品名：益賽普）救治百草枯中毒患者，通過TNFαR-Fc與血漿TNF-α特異性結(jié)合，降低TNF-α介導(dǎo)的組織損傷［2-3］。機(jī)體組織的損傷程度與炎癥因子的過量表達(dá)釋放有密切的相關(guān)性，提示在誘發(fā)炎癥因子的上游可能存在著更關(guān)鍵的靶點(diǎn)。近期的研究結(jié)果證實(shí)，百草枯中毒使得體內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)迅速活化，作為過敏毒素的補(bǔ)體C5a活化產(chǎn)物可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IL-6和IL-1等，阻斷C5a的過度活化可減少炎癥因子的產(chǎn)生［4］。因此，探討補(bǔ)體C5a在百草枯誘導(dǎo)急性肺損傷中的作用機(jī)制有可能為研制此類毒物中毒的救治藥物提供有意義的靶點(diǎn)和依據(jù)。

1 百草枯誘導(dǎo)急性肺損傷和肺纖維化

百草枯中毒可引起多系統(tǒng)損傷，其中尤以肺損傷最為嚴(yán)重。中毒后百草枯首先選擇性聚集在肺內(nèi)，其肺組織中的百草枯濃度高于血漿10～90倍。肺泡Ⅱ型細(xì)胞是攝取內(nèi)源性聚胺（腐胺、亞精胺和精胺）的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，由于百草枯的結(jié)構(gòu)與聚胺有著特殊的相似性，中毒后與聚氨競爭性被肺泡Ⅱ型細(xì)胞所攝取，進(jìn)一步導(dǎo)致大量氧自由基的產(chǎn)生，最終肺組織發(fā)生不可逆性損傷。百草枯中毒可引起肺充血、出血、水腫、透明膜形成和變性、增生和纖維化等病理改變。在1周內(nèi)死亡者，主要為肺紋理增多，肺間質(zhì)炎性變，可見點(diǎn)、片狀陰影，肺部透亮度減低或呈毛玻璃狀，肺充血，水腫，肺重量增加。生存期超過1周者，肺泡滲出物（含脫落的肺泡上皮碎屑、巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞及透明膜）增多，單核細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)肺實(shí)變或大片實(shí)變，同時出現(xiàn)部分肺纖維化。后期（2周后）發(fā)生出血和間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生，肺泡間質(zhì)增厚，結(jié)果導(dǎo)致廣泛的纖維化和肺不張。急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征是百草枯中毒致死的主要原因［5］。

2 百草枯誘導(dǎo)補(bǔ)體活化

補(bǔ)體作為機(jī)體天然免疫中的重要成分，在機(jī)體自我保護(hù)中發(fā)揮第一道防線的作用，因此成為炎癥反應(yīng)的最主要調(diào)節(jié)開關(guān)。補(bǔ)體過度激活可引起病理性損傷。補(bǔ)體在百草枯中毒所導(dǎo)致急性肺損傷的早期即被激活，并在百草枯所致的急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。百草枯中毒后，C1q在肺間質(zhì)、細(xì)支氣管上皮基底膜及肺血管內(nèi)皮特異性著色逐漸增強(qiáng)。Mooly等［6］研究表明，脂多糖誘發(fā)急性肺損傷時，C1q在發(fā)病4 h升高，到48 h開始下降。C1是補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典激活途徑的起始成分，C1q為具有識別作用的亞單位，在肺組織高表達(dá)，說明百草枯中毒導(dǎo)致急性肺損傷可能有補(bǔ)體經(jīng)典途徑激活；補(bǔ)體活化通過經(jīng)典、旁路替代和凝集素3條主要途徑，都以C3活化作為樞紐。百草枯處理的大鼠模型，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選百草枯中毒的生物學(xué)診斷與治療標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)C3被顯著上調(diào)［7］。急性肺損傷發(fā)病早期，首先是補(bǔ)體系統(tǒng)被激活。百草枯處理的小鼠模型，百草枯處理24 h后，能有效地誘導(dǎo)急性肺損傷，肺部補(bǔ)體蛋白C1q和C3和補(bǔ)體受體C3aR和C5aR的表達(dá)顯著升高［4］。百草枯1.596和3.192 mg·L-1處理的斑馬魚模型，誘導(dǎo)后7 d能誘導(dǎo)C3活化，及肝、腎和脾組織損傷［8］。百草枯20 mg·kg-1染毒小鼠，發(fā)現(xiàn)染毒后4 h血清C3c水平與正常相近；到12 h升高明顯，24 h達(dá)高峰，一直持續(xù)到48 h， C3c增多表明有補(bǔ)體的活化［9］。此結(jié)果與相關(guān)研究一致，發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性創(chuàng)傷和膿毒血癥患者，發(fā)生急性肺損傷早期表現(xiàn)為C3下降，C3被裂解并消耗，故裂解產(chǎn)物升高［10-11］。與野生型小鼠相比，C3缺失的小鼠生存時間較長，肺部炎癥細(xì)胞浸潤減少，病理變化較輕。應(yīng)用C3抑制劑也能有效地延長生存時間，降低肺部炎癥細(xì)胞浸潤，減輕肺組織病理變化［4］。小鼠在沒有補(bǔ)體參與下染毒，肺組織中性粒細(xì)胞浸潤減少，肺血管通透性減輕，損傷減輕，存活時間延長，表明補(bǔ)體在百草枯中毒導(dǎo)致急性肺損傷中可能具有促進(jìn)作用，抑制補(bǔ)體活性可以減輕肺組織損傷。

3 補(bǔ)體成分C5a介導(dǎo)百草枯導(dǎo)致急性肺損傷的機(jī)制

補(bǔ)體激活產(chǎn)物C5a具有廣泛的生物活性，在急性肺損傷的發(fā)病中起著非常重要的作用。

3.1 C5a介導(dǎo)肺部炎癥細(xì)胞浸潤

炎癥細(xì)胞浸潤在百草枯誘導(dǎo)急性肺損傷中扮演著重要的角色。過敏毒素C5a作為炎癥反應(yīng)的重要趨化因子，是引起中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞在肺內(nèi)聚集的關(guān)鍵分子［12］。肺部單核細(xì)胞浸潤通過釋放多種炎癥因子參與組織損傷。肺部細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等也能產(chǎn)生C5a［13］。研究顯示，在急性肺損傷患者中過敏毒素C5a能有效地誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化、聚集和活化，并介導(dǎo)肺上皮細(xì)胞損傷［14-17］。相反，急性肺損傷恢復(fù)的患者依賴C5a誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化、聚集和活化活性顯著降低［18］。除了過敏毒素C5a外，另一種重要的趨化因子——IL-8也能被肺部細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等分泌。研究顯示，IL-8的水平與中性粒細(xì)胞和肺損傷程度呈正相關(guān)［19］。關(guān)鍵的是，C5a能有效地放大脂多糖等所刺激的IL-8的表達(dá)。這些研究顯示，過敏毒素C5a作為炎癥反應(yīng)的重要趨化因子，通過介導(dǎo)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在肺內(nèi)聚集和活化，參與急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展。

3.2 C5a介導(dǎo)肺部氧自由基釋放

研究表明，百草枯能有效誘導(dǎo)氧自由基包括過氧化氫（H2O2）的產(chǎn)生［20-21］。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，在細(xì)胞內(nèi)活化為氧自由基是百草枯中毒的物質(zhì)基礎(chǔ)，所形成的過量超氧化陰離子自由基（O·_）及H2O2等可引起肺及其他許多組織器官細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，從而造成多系統(tǒng)組織器官的損傷。過敏毒素C5a不僅能有效地趨化中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在肺部聚集，也能有效地活化這些細(xì)胞產(chǎn)生氧（呼吸）爆發(fā)，而釋放大量的氧自由基如和。研究顯示，中性粒細(xì)胞表達(dá)很高的C5aR，在C5a的趨化作用下，多形核中性粒細(xì)胞在肺血管內(nèi)聚集，釋放氧自由基和蛋白溶解酶，導(dǎo)致肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺間質(zhì)及肺泡上皮細(xì)胞損傷，從而引起通透性肺水腫［23］。另外，中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基、蛋白水解酶、彈性蛋白酶、絲氨酸蛋白酶以及某些細(xì)胞因子（如IL-6）等可使C5轉(zhuǎn)化為C5a，引起組織損傷。非髓系細(xì)胞如細(xì)支氣管、肺上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均表達(dá)C5aR，并與C5a發(fā)生反應(yīng)［24］。C5a也能有效地活化絲裂原蛋白激酶如P42/P44，而這些蛋白激酶對NADPH氧化酶體的組裝及其后氧自由基如O·-和H2O2的產(chǎn)生至關(guān)重要［22］。

研究顯示，肺部所浸潤的炎癥細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基的多少能決定肺損傷的程度［25］。在肺纖維化過程中，能產(chǎn)生更多的氧自由基。相反，當(dāng)使用抗氧化處理，能有效地減少肺損傷［26］。這些研究顯示，C5a和C5aR相互作用在氧自由基產(chǎn)生中起著重要的作用［27］。使用C5aR拮抗劑來阻斷C5a/ C5aR信號通路能有效地抑制大腸桿菌所誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的氧（呼吸）爆發(fā)。相似地，使用抗C5a抗體能有阻斷奈瑟球菌所誘導(dǎo)的全血產(chǎn)生的氧呼吸爆發(fā)。這些研究提示，C5a通過介導(dǎo)肺部氧自由基的釋放等參與急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展。

3.3 C5a介導(dǎo)肺部細(xì)胞因子風(fēng)暴

致病因子所致的細(xì)胞因子在體內(nèi)大量產(chǎn)生的事件被稱為細(xì)胞因子風(fēng)暴［28］。近年研究發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒可引起細(xì)胞因子風(fēng)暴。C5a可有效地誘導(dǎo)固有免疫細(xì)胞如肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞釋放大量的前炎癥細(xì)胞因子如IL-12，TNF-α和巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α［29］。除了固有免疫細(xì)胞外，C5a也可有效地誘導(dǎo)獲得性免疫細(xì)胞如T和B細(xì)胞釋放TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-8等前炎癥細(xì)胞因子［30-31］。許多細(xì)胞因子參與急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程，細(xì)胞因子通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)促進(jìn)氧自由基的損傷，或影響凝血和纖溶系統(tǒng)，或引發(fā)肺纖維化。TNF-α就是主要的細(xì)胞因子之一。重組人Ⅱ型TNF-αR-Fc可阻止肺成纖維細(xì)胞增殖及過度分泌膠原，在理論上可干預(yù)肺纖維化的形成和發(fā)展。在臨床實(shí)踐中給予重組人Ⅱ型TNF-αR-Fc配合甲潑尼龍和環(huán)磷酰胺治療急性百草枯中毒，可明顯降低肺纖維化發(fā)生［3］。另外，肺纖維化發(fā)生過程中的關(guān)鍵性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子β1拮抗劑的治療作用已經(jīng)引起了人們的高度重視［32］。這些研究顯示，C5a介導(dǎo)肺部細(xì)胞因子風(fēng)暴的產(chǎn)生等參與急性肺損傷和肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。

3.4 補(bǔ)體C5a誘導(dǎo)肺部微血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子脫落

C5a通過對微血管內(nèi)皮細(xì)胞上黏附分子的上調(diào)作用，啟動炎癥反應(yīng)及中性粒細(xì)胞在肺間質(zhì)的募集和浸潤，增加血管漏出，引起急性肺損傷。百草枯誘導(dǎo)成年新西蘭大白兔肺損傷模型中，急性中毒致肺損傷后兔肺組織內(nèi)血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1表達(dá)明顯下降，呈劑量依賴性，其與肺損傷程度和肺纖維化程度密切相關(guān)［33］。而百草枯中毒致纖維化患者血清中可溶性細(xì)胞間黏附因子明顯升高，其升高與百草枯中毒致肺纖維化有關(guān)［34］。這些研究顯示，補(bǔ)體C5a誘導(dǎo)肺部微血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子脫落而造成血清或肺部中可溶性黏附分子上調(diào)。黏附分子能有效地誘導(dǎo)肺部巨噬細(xì)胞等釋放前炎癥細(xì)胞因子如TNF-α，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)［35］。而阻斷可溶性黏附分子CDllb，CD18和P-選擇素等可有效地減少肺部中性粒細(xì)胞數(shù)目，進(jìn)而減輕急性肺損傷［36］。相似地，抗C5a抗體能通過有效地抑制黏附分子表達(dá)，進(jìn)而限制中性粒細(xì)胞浸潤而減輕急性肺損傷［22］。這些研究顯示，補(bǔ)體C5a誘導(dǎo)肺部微血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子脫落也是百草枯誘導(dǎo)急性肺損傷的一個重要機(jī)制。

3.5 其他

補(bǔ)體C5a介導(dǎo)百草枯誘導(dǎo)急性肺損傷的其他機(jī)制包括C5a介導(dǎo)肺部血管內(nèi)凝血、誘導(dǎo)組胺釋放及介導(dǎo)獲得性免疫應(yīng)答等。C5a對血管內(nèi)皮的作用包括產(chǎn)生炎癥因子（如IL-8家族和趨化因子等）和損傷產(chǎn)物（如組織因子有顯著的凝血酶原活性），可造成血管內(nèi)凝血［37］。C5a也能有效地誘導(dǎo)組胺的產(chǎn)生，如在百草枯誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型中，可誘導(dǎo)組胺顯著性升高；相反，可有效抑制急性肺損傷的環(huán)加氧酶抑制劑布洛芬，有效地降低組胺水平［22］。進(jìn)一步研究顯示，使用組胺受體拮抗劑可有效地降低急性肺損傷，表明C5a誘導(dǎo)的組胺是百草枯誘導(dǎo)急性肺損傷一個主要炎癥介質(zhì)［38］。C5a也能有效地介導(dǎo)獲得性免疫應(yīng)答反應(yīng)［22］。研究顯示，百草枯可抑制絲裂原體外誘導(dǎo)的T和B細(xì)胞增殖，也能減少分泌IgM的漿細(xì)胞數(shù)量，然而卻顯著上調(diào)IL-17家族的細(xì)胞因子如IL-17B，C，E和F，以及促進(jìn)Th17分化的細(xì)胞因子IL-9和IL-21［39］。上述研究顯示，C5a誘導(dǎo)了免疫偏離，即導(dǎo)致炎癥細(xì)胞Th17過度產(chǎn)生也是介導(dǎo)百草枯導(dǎo)致急性肺損傷的機(jī)制之一。

4 靶向C5a治療百草枯所致急性肺損傷

補(bǔ)體C5a可通過多種機(jī)制介導(dǎo)百草枯中毒所致急性肺損傷，提示了C5a可能作為治療百草枯所致急性肺損傷的潛在靶點(diǎn)。研究顯示，在百草枯誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型上，應(yīng)用C5a受體拮抗劑能有效地減輕肺組織中性粒細(xì)胞浸潤、細(xì)胞因子產(chǎn)生和肺血管通透性，進(jìn)而減輕肺部病理，相應(yīng)地延長生存時間［7］。抗人C5a中和性抗體治療H7N9高致病病毒誘導(dǎo)的猴急性肺損傷的研究結(jié)果證實(shí)，有效阻斷C5a的效應(yīng)如中性粒細(xì)胞趨化、細(xì)胞因子釋放，可明顯減輕急性肺損傷［40］。近期抗人C5a中和性抗體治療百草枯誘導(dǎo)的猴急性肺損傷的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗人C5a中和性抗體能有效地減輕百草枯誘導(dǎo)的急性肺損傷猴模型肺部的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤，極大地抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，相應(yīng)地有效降低了肺組織病理損傷。上述研究預(yù)示，靶向過敏毒素C5a治療可能為百草枯所致急性肺損傷性死亡的救治提供一條新途徑。

5 結(jié)語

百草枯急性中毒后可迅速活化補(bǔ)體，其中補(bǔ)體活化產(chǎn)物C5a是最強(qiáng)的炎癥介質(zhì)，C5a可通過誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞在肺部聚集與活化、肺部血管內(nèi)凝血、炎癥細(xì)胞產(chǎn)生過量的氧自由基、組胺釋放及炎癥細(xì)胞產(chǎn)生過量的細(xì)胞因子等機(jī)制介導(dǎo)百草枯中毒后所導(dǎo)致的急性肺損傷。而使用C5a受體的拮抗劑或抗C5a的中和性抗體能有效地阻斷C5a在百草枯中毒后的一系列效應(yīng)，從而有效地降低百草枯所導(dǎo)致的急性肺損傷。上述研究提示，靶向C5a可能是治療百草枯所致急性肺損傷的一個有效靶點(diǎn)。

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Mechanisms and role of complement C5a in paraquat-induced acute lung injury

WANG Ren-xi,LI Yan
（Laboratory of Molecular Immunology,Institute of Basic Medical Sciences,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China）

The lung is a major damage tissue in paraquat（PQ）-caused acute poisoned patients. Most deaths from acute PQ poisoning can be attributed to acute lung injury（ALI）.Complement activa?tion product C5a causes inflammatory cells，such as neutrophils and macrophages，to accumulate into the lung and get activated.These activated inflammatory factors generate a large number of oxidants and inflammatory sequelae named"cytokine storm"to mediate ALI induced by PQ poison.The review focused on the role and mechanisms of complement C5a in PQ-induced ALI.

complement;C5a;paraquat;acute lung injury

LI Yan，Tel：（010）66931326，E-mail：13681311661@163.com

R99，R996

A

1000-3002-（2016）12-1379-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.12.016

Foundation item：The project supported by National Science and Technology Major Project of China（2014ZX09J14105-04B）

2016-11-23接受日期：2016-12-22）

國家科技重大專項(xiàng)（2014ZX09J14105-04B）

黎 燕，E-mail：13681311661@163.com,Tel：（010）66931326

（本文編輯：齊春會）