我國毒物代謝和毒代動力學(xué)研究三十年回顧

李樺

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850）

我國毒物代謝和毒代動力學(xué)研究三十年回顧

李樺

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850）

李 樺，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事藥物毒物代謝和化學(xué)損傷防治研究，負(fù)責(zé)多項(xiàng)國家和軍隊(duì)重大或重點(diǎn)課題。在國家重大科技專項(xiàng)資助下，建立毒劑代謝技術(shù)平臺，重點(diǎn)開展軍用毒劑及其他有毒物質(zhì)的毒代動力學(xué)和毒代-毒效相關(guān)性研究，獲得軍隊(duì)科技進(jìn)步一等獎1項(xiàng)，二等獎3項(xiàng)。國內(nèi)外期刊發(fā)表研究論文80余篇。現(xiàn)任中國毒理學(xué)會災(zāi)害與應(yīng)急毒理學(xué)專業(yè)委員會主任委員。

毒物代謝和毒代動力學(xué)是毒理學(xué)科的重要分支，研究毒物經(jīng)不同途徑染毒后在體內(nèi)的吸收、靶器官分布、代謝解毒或活化、以及排泄消除的規(guī)律，理解毒物暴露動力學(xué)與毒理效應(yīng)的相關(guān)性，并通過考察不同因素對毒物體內(nèi)過程的影響，了解中毒機(jī)制，發(fā)現(xiàn)可能的中毒或解毒靶點(diǎn)及途徑，為毒物的有效防治提供思路和方法。本文概述了毒代動力學(xué)的研究特點(diǎn)，并通過研究個例的評述，回顧30年來我國毒物代謝和毒代動力學(xué)的研究特色和進(jìn)展。

毒代動力學(xué)；代謝；化學(xué)戰(zhàn)劑；有毒中藥；農(nóng)藥；環(huán)境污染物

毒物代謝和毒代動力學(xué)研究有毒物質(zhì)經(jīng)不同途徑染毒后在體內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、靶器官分布、代謝解毒或生物活化、以及排泄的動力學(xué)過程及規(guī)律，是毒理學(xué)研究的重要組成部分。在我國，系統(tǒng)的毒代動力學(xué)研究起始于軍用毒劑和火箭推進(jìn)劑的研究。近年來，隨著藥物代謝動力學(xué)理論和技術(shù)的快速發(fā)展，以及國家和民眾對環(huán)境、食品和藥品安全的高度關(guān)注，毒代動力學(xué)的研究對象和范疇不斷擴(kuò)展，研究水平也有很大提高。在《中國藥理學(xué)和毒理學(xué)雜志》創(chuàng)刊30周年之際，本文通過對研究個例的評述，回顧我國毒物代謝和毒代動力學(xué)30年來的研究特色和進(jìn)展。

1 毒物代謝和毒代動力學(xué)的研究特點(diǎn)

毒代動力學(xué)和藥代動力學(xué)都研究外源物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄（absorption，distribu?tion，metabolism and excretion，ADME）處置過程，二者的基礎(chǔ)理論和技術(shù)方法基本相同，但因研究對象、目的和關(guān)注點(diǎn)的不同而各具特點(diǎn)。毒代動力學(xué)的研究對象是有毒物質(zhì)，包括在一定劑量水平可引起中毒或毒性反應(yīng)的藥物和食品添加物等，重點(diǎn)關(guān)注毒物經(jīng)不同途徑和方式染毒后在血循環(huán)和靶器官的暴露水平及其動力學(xué)特征，探討劑量與暴露、暴露與毒效強(qiáng)度和時間的關(guān)系，考察毒物在體內(nèi)的代謝活化或清除解毒，從而認(rèn)識毒物的毒性特征及其物質(zhì)基礎(chǔ)，理解中毒機(jī)制，發(fā)現(xiàn)可能的中毒或解毒靶點(diǎn)/途徑，為毒物的中毒診斷和有效防治提供思路或依據(jù)。在解毒藥或?qū)勾胧┑难芯恐?，將毒物的毒代動力學(xué)與抗毒藥物的藥代動力學(xué)研究相結(jié)合，有助于闡明毒物和抗毒藥的ADME動力學(xué)過程及其相互作用，增進(jìn)對抗毒藥物作用特點(diǎn)及機(jī)制的了解，對抗毒藥物的研發(fā)和合理用藥方案制定具有重要意義。

大多數(shù)毒物，特別是軍用毒劑的毒性高、劑量低，進(jìn)入體內(nèi)后在血循環(huán)和組織中的濃度較低，因此，毒物動力學(xué)研究要求應(yīng)用高靈敏度和高分辨率的檢測技術(shù)。毒物的代謝性質(zhì)評價通常應(yīng)用體外模型或染毒動物模型進(jìn)行，由于染毒方式和途徑對毒物的ADME性質(zhì)影響較大，因此，在進(jìn)行毒代動力學(xué)研究前要建立適宜的染毒動物模型，使之盡可能接近實(shí)際中毒情況。例如，氣態(tài)或氣溶膠形式的軍用毒劑通常經(jīng)呼吸道和眼睛染毒，液態(tài)毒劑大多經(jīng)皮膚染毒，毒代研究需要建立和應(yīng)用呼吸道、眼睛和皮膚染毒模型。由于毒物的高毒性及其對機(jī)體的損傷作用，毒物研究通常不能在人體上進(jìn)行，或者在人體試驗(yàn)中，不能采用引起毒性反應(yīng)的劑量。因此，需要建立和發(fā)展毒物代謝性質(zhì)和毒代動力學(xué)的體外-體內(nèi)、動物-人體外推和模擬預(yù)測模型或技術(shù)。

近年來，生命科學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和分析化學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，推動了毒代動力學(xué)的進(jìn)步，研究水平隨之快速提升。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、同位素標(biāo)記示蹤技術(shù)、免疫分析技術(shù)等為復(fù)雜生物樣品中微量毒物及其代謝產(chǎn)物或生物標(biāo)志物的檢測提供了手段；基于計(jì)算機(jī)軟件的虛擬預(yù)測技術(shù)能快速預(yù)測毒劑的代謝和毒理性質(zhì)，并可進(jìn)行同類毒劑的比較和分級，提高了新毒劑的追蹤和評估能力；對外源物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體的認(rèn)識和評價技術(shù)的發(fā)展，為理解毒劑代謝消除、生物活化、特異性分布和排泄機(jī)制，開辟思路和研究方向，并為體內(nèi)外評價提供了高效和可靠的模型和方法?；谏淼亩敬鷦恿W(xué)模型（physiologically based toxicokinetic model，PBTK）的發(fā)展，為人體暴露和動力學(xué)的模擬預(yù)測提供手段，并獲得風(fēng)險(xiǎn)評估和醫(yī)學(xué)對抗措施研究所需的人體評估資料。

2 軍用毒劑的代謝和毒代動力學(xué)研究

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院是國內(nèi)最早開展毒物代謝和毒代動力學(xué)的研究機(jī)構(gòu)之一，自20世紀(jì)70年代起，系統(tǒng)研究了化學(xué)戰(zhàn)劑和火箭推進(jìn)劑的代謝性質(zhì)和毒代動力學(xué)［1］。在有機(jī)磷神經(jīng)性毒劑的研究中，李勁彤和應(yīng)翔宇等［2-6］在體內(nèi)外多個染毒模型上研究了梭曼在血液、肺、肝和腸等主要解毒器官的降解作用與機(jī)制，闡明了梭曼手性異構(gòu)體的代謝動力學(xué)特點(diǎn)。他們還通過解毒酶誘導(dǎo)、中毒酶的重活化、以及通過增加外周血流灌注調(diào)節(jié)梭曼體內(nèi)分布等手段［7-10］，首次從調(diào)控梭曼體內(nèi)代謝處置的角度，探索了促進(jìn)體內(nèi)梭曼代謝解毒的途徑，闡明了毒劑與抗毒藥的作用機(jī)制，為梭曼抗毒藥物篩選與評價奠定了重要基礎(chǔ)。在火箭推進(jìn)劑的毒理學(xué)研究中，關(guān)永彪和張寶真等［11］系統(tǒng)研究了肼、甲基肼和偏二甲基肼的靜注和吸入毒代動力學(xué)。研究表明，氣態(tài)肼類化合物在家兔呼吸道以表觀零級速度完全吸收，體內(nèi)的分布和消除很快，且無顯著的臟器蓄積。他們還開展了毒代與毒效的相關(guān)性研究［12］，為推進(jìn)劑接觸人員的健康風(fēng)險(xiǎn)評估和防護(hù)措施研究提供了關(guān)鍵資料。

T-2毒素是由鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素，可導(dǎo)致糧食減產(chǎn)并引起人和畜的急慢性中毒。T-2毒素也是20世紀(jì)70年代報(bào)道的生物化學(xué)戰(zhàn)劑“黃雨”的主要成分。李樺和阮金秀等［13］系統(tǒng)研究了［3］H-T-2毒素在小鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)該毒素在肝、腎和肺的暴露較高，毒素及其毒性產(chǎn)物可在脂肪組織中明顯蓄積，導(dǎo)致毒素在體內(nèi)的截留并消除緩慢，長期微量接觸時，蓄積程度加重，推測這可能是該毒素誘發(fā)腫瘤的可能原因之一。應(yīng)用大鼠在體肝-腸灌流模型，他們發(fā)現(xiàn)T-2毒素具有顯著的肝腸首過效應(yīng)，生成HT-2等毒性產(chǎn)物，后者存在顯著的腸-肝循環(huán)，使得毒素消除緩慢［14-16］。腸道細(xì)菌和非特異性羧酸酯酶參與了毒性代謝產(chǎn)物在腸道的生成［17］。由此提出，T-2毒素在體內(nèi)的急慢性毒性作用、特別是致死性的腸道毒性，主要由其代謝產(chǎn)物所引起。隨后，彭雙清等［18］進(jìn)一步評價了該毒素及其產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與毒性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)T-2毒素及其產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中的環(huán)氧結(jié)構(gòu)，是其發(fā)揮毒性作用的決定性基團(tuán)。這些研究為認(rèn)識T-2毒素的毒理特點(diǎn)以及代謝與毒性的關(guān)系提供了重要依據(jù)。

近年來，隨著蓖麻毒素作為恐怖劑使用的風(fēng)險(xiǎn)增高，蓖麻毒素的毒理作用、毒物代謝動力學(xué)和醫(yī)學(xué)對抗措施研究形成熱點(diǎn)。王晨宇和馬小溪等相繼建立了雙夾心酶聯(lián)免疫分析技術(shù)［19］和免疫磁珠捕獲富集-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatog?raphy-mass spectrometry，LC-MS/MS）檢測技術(shù)［20］，定量檢測生物樣品中的蓖麻毒素。毒代動力學(xué)研究表明，蓖麻毒素經(jīng)靜脈或肌注染毒后，在血循環(huán)中有顯著暴露，消除半衰期（t1/2）長達(dá)數(shù)小時。提示染毒后，血循環(huán)中的毒素留有數(shù)小時的中和抗體作用時間窗，及時給予抗體治療，可有效清除血循環(huán)中的毒素。王晨宇等［19］還發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)靜脈染毒后，可快速分布進(jìn)入肝、腎、脾、肺、腸和脂肪，其中，在脾和肝的暴露水平顯著高于血清，呈現(xiàn)明顯的特殊攝取或滯留作用。毒性病理學(xué)觀察表明，脾和肝是毒素的毒性靶器官，毒素可以與巨噬細(xì)胞上半乳糖基特異性結(jié)合，這是毒素在脾和肝這兩個網(wǎng)狀內(nèi)皮組織的高暴露、并產(chǎn)生毒性的機(jī)制之一。隨后，董娜等［21］又在體外細(xì)胞和小鼠體內(nèi)，研究了毒素的轉(zhuǎn)運(yùn)和分布性質(zhì)。作為蛋白類毒素，蓖麻毒素在體外不能透過Caco-2單層細(xì)胞，但在腸囊外翻模型上，可透過腸壁吸收，空腸和回腸是主要的吸收部位。小鼠灌胃染毒后，毒素可快速進(jìn)入血循環(huán)，并分布至肝、腎、肺和脾等重要臟器。染毒1 h時，免疫組化檢查觀察到毒素在上述臟器的顯著分布，病理學(xué)檢查可見肝腎組織的明顯損傷，且靶器官的損傷遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于小鼠全身中毒癥狀。這些研究為闡明蓖麻毒素的毒理機(jī)制、發(fā)現(xiàn)對抗靶點(diǎn)和研究醫(yī)學(xué)救治措施，打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

糜爛性毒劑芥子氣是世界上存量最多的化學(xué)戰(zhàn)劑之一，也是日本在華遺留化學(xué)武器中的主要戰(zhàn)劑，對我國的環(huán)境和人民健康造成嚴(yán)重危害。芥子氣是難防難治性毒劑，目前最有效的中毒對抗措施是預(yù)先防護(hù)、及時診斷和洗消。但芥子氣從染毒到出現(xiàn)明顯癥狀，通常有12～24 h的滯后期，給及時診斷和救治帶來困難。為此，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的研究人員首先建立了定量檢測血漿、組織和細(xì)胞等生物樣品中芥子氣原型、代謝產(chǎn)物、DNA或蛋白加合物的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chroma?tography-mass spectrometry，GC-MS）或LC-MS/ MS技術(shù)［22-26］。李春正和李樺等［24，27］定量分析了芥子亞砜、硫二甘醇、二羥乙基亞砜以及谷胱甘肽加合物的β-裂解產(chǎn)物在染毒大鼠和比格犬血漿中的暴露動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)這些產(chǎn)物在動物血循環(huán)中的暴露時間窗為48～72 h不等，暴露水平隨著染毒劑量的增高呈現(xiàn)比例增加，其中毒性產(chǎn)物芥子亞砜是芥子氣染毒后血漿中的主要產(chǎn)物，從而提出將芥子亞砜等小分子代謝產(chǎn)物作為暴露標(biāo)志物，用于芥子氣染毒后的快速診斷，并由標(biāo)志物暴露水平-劑量相關(guān)性估測毒劑的染毒劑量和程度。聶志勇和岳麗君對多種暴露標(biāo)志物的檢測發(fā)現(xiàn)，動物皮膚染毒芥子氣后，在4個月內(nèi)的不同時間段，在血、尿、組織樣品中可分別檢測到代謝產(chǎn)物、DNA和蛋白加合物，可用于毒劑染毒后不同時期的溯源性分析和暴露確證。這些技術(shù)已成功用于芥子氣意外中毒傷員的樣品檢測和中毒診斷［28］，并有望發(fā)展成為日本遺留化學(xué)武器處置操作人員健康監(jiān)測技術(shù)及其臨床中毒救治療效評估的輔助手段。此外，徐斌和謝劍煒等［29］應(yīng)用同位素稀釋LC-MS/MS與化學(xué)轉(zhuǎn)化相結(jié)合的新方法，克服了在體內(nèi)不能穩(wěn)定檢測高反應(yīng)性芥子氣的技術(shù)瓶頸。在大鼠芥子氣毒代動力學(xué)和組織分布研究中，他們發(fā)現(xiàn)，芥子氣在血漿中的平均滯留時間為1～1.5 h，原型毒劑可大量蓄積在脂肪組織中，成為毒劑的體內(nèi)儲庫［29］。這些研究結(jié)果為解釋芥子氣的毒性作用特點(diǎn)以及發(fā)展針對性的防治措施，提供了重要的依據(jù)和思路。

3 有毒中藥或中藥有毒成分的代謝及毒代動力學(xué)研究

近年來，隨著中藥在世界范圍內(nèi)的應(yīng)用日益廣泛，中藥安全性引起關(guān)注，特別是有毒中藥的毒性物質(zhì)基礎(chǔ)和致毒機(jī)制、以及中藥-西藥相互作用帶來的不良反應(yīng)乃至毒性成為研究熱點(diǎn)。通過代謝及毒代動力學(xué)研究，了解有毒中藥或成分的體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的處置規(guī)律，有助于認(rèn)識它們產(chǎn)生毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)，理解復(fù)方配伍禁忌的規(guī)律，揭示中藥的毒副作用及機(jī)制，對于有效評價中藥安全性、促進(jìn)中藥現(xiàn)代化和指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要意義。中國學(xué)者在相關(guān)的研究中取得了許多重要的進(jìn)展或突破。

含有重金屬的中藥，例如朱砂和雄黃等，是已知的有毒中藥。丁國華等［30］給大鼠單次或連續(xù)灌胃朱砂（7 g·kg-1）后，應(yīng)用微波消解-原子熒光光譜法測定血汞濃度，觀察到汞的消除較慢，連續(xù)服用10 d后，血汞濃度呈現(xiàn)上升的趨勢。大鼠服用朱砂后，汞可分布于心、肺、肝、腎和腦等重要臟器，以腎的分布水平最高、肝次之，連續(xù)給藥后腎暴露水平顯著升高［31］。梁愛華等［32］研究了朱砂汞在大鼠的蓄積性，大鼠連續(xù)3個月服用朱砂后，汞在大鼠腎、腦和肝中均有蓄積，其中以腎的蓄積最為顯著，同時可見腎和肝組織毒性，提示腎和肝毒性與組織蓄積有關(guān)。張娟和湯毅珊等［33-34］應(yīng)用原子熒光光譜法測定了大鼠口服不同劑量雄黃后血、尿和組織樣品中的總砷濃度，觀察到雄黃中砷的血清消除較慢，砷的動力學(xué)參數(shù)不隨劑量比例變化，呈現(xiàn)非線性的動力學(xué)特征；砷在體內(nèi)主要臟器組織均有分布，以腎上腺、膀胱、卵巢的分布較高，肝、脾、肺和腎等組織次之。在大鼠排泄研究中觀察到，糞便的總砷排泄量為劑量的97.7%，其中35.4%的劑量經(jīng)膽汁排泄，而砷的腎排泄不到0.04%。這些研究揭示了朱砂和雄黃等中藥含有的重金屬在體內(nèi)的器官特異性分布或蓄積的物質(zhì)基礎(chǔ)，為指導(dǎo)臨床安全用藥提供依據(jù)。

川烏、草烏和附子為臨床常用中藥，但它們的毒性極強(qiáng)，已知的毒性成分主要是烏頭堿、中烏頭堿和新烏頭堿等。南方醫(yī)科大學(xué)的劉中秋課題組研究了大鼠口服和靜注烏頭堿、以及單次和連續(xù)口服制附子提取液后的血漿藥代動力學(xué)［35］。研究表明，烏頭堿以單體（0.5 mg·kg-1）或附子提取液（0.118 mg·kg-1）的形式給藥時，體內(nèi)吸收較快，但口服生物利用度僅分別為8.2%和4.7%；烏頭堿與血漿蛋白的結(jié)合率不到30%，從血循環(huán)的消除較快，口服t1/2在3～4 h。重復(fù)給予附子提取液時，烏頭堿的吸收速度明顯快于單次劑量，血漿暴露曲線下面積（area under curve，AUC）顯著增高，體內(nèi)清除（t1/2）呈延長趨勢。合用芍藥苷能顯著降低烏頭堿的毒性，這一現(xiàn)象與芍藥苷顯著改變?yōu)躅^堿在大鼠體內(nèi)的吸收行為，延長達(dá)峰時間和降低血漿峰值有關(guān)［36］。為了了解烏頭堿的吸收性質(zhì)和生物利用度高變異的機(jī)制，楊翠萍和張振清等［37］應(yīng)用體外Caco-2細(xì)胞模型評價了烏頭堿的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)烏頭堿在Caco-2單層細(xì)胞上的外排轉(zhuǎn)運(yùn)是溫度和pH依賴的，轉(zhuǎn)運(yùn)體P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）抑制劑能顯著降低烏頭堿的外排，提示烏頭堿的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和體內(nèi)吸收涉及轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的主動機(jī)制。他們進(jìn)而給大鼠合用烏頭堿和P-gp抑制劑維拉帕米，發(fā)現(xiàn)合用組烏頭堿的血漿峰值（cmax）從對照組的39.4 μg·L-1顯著提高至1490.7 μg·L-1，AUC相應(yīng)增加6.7倍。在灌流大鼠小腸模型上，維拉帕米也能顯著提高烏頭堿的小腸吸收［38］。他們由此推論，P-gp介導(dǎo)的外排作用是烏頭堿在體內(nèi)有限吸收和生物利用度較低的原因之一，這是機(jī)體對抗烏頭堿的毒性作用的防御功能；但當(dāng)烏頭堿與P-gp抑制劑合用時，因吸收行為的改變可能導(dǎo)致血漿暴露增加，引起嚴(yán)重的毒性。這些研究對于防范烏頭堿及其相關(guān)中藥的代謝性相互作用，管控臨床用藥的毒副作用風(fēng)險(xiǎn)，具有重要的指導(dǎo)意義。

有毒中藥或毒性成分在體內(nèi)可以經(jīng)藥物代謝酶解毒，也可經(jīng)代謝酶的生物活化而產(chǎn)生毒性。近年來，中國學(xué)者在中藥活性成分代謝與毒性的研究上，有諸多發(fā)現(xiàn)。例如，吡咯里西啶生物堿（pyrroli?zidine alkaloid，PA）是廣泛存在于紫草科、菊科和豆科植物中的活性成分，具有肝毒性，人或動物誤服含有PA的植物后，可發(fā)生中毒，嚴(yán)重時危及生命。香港中文大學(xué)林鴿教授團(tuán)隊(duì)在含有谷胱甘肽的大鼠肝微粒體中，首次檢測并鑒定了奧索千里光裂堿型（otonecine-type）PA的吡咯代謝產(chǎn)物（以谷胱甘肽加合物的形式），從而證實(shí)這一類型PA的肝毒性機(jī)制與倒千里光裂堿型（retronecine-type）PA相似，在細(xì)胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP）的催化下生成反應(yīng)性產(chǎn)物脫氫PA，后者是強(qiáng)親電性產(chǎn)物，可以與機(jī)體大分子發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生肝毒性［39］；當(dāng)反應(yīng)體系存在谷胱甘肽時，反應(yīng)性產(chǎn)物生成谷胱甘肽加合物，從而減少其與大分子的結(jié)合，降低毒性。她們隨后進(jìn)行了系統(tǒng)的研究工作，在大鼠肝微粒體孵育液中檢測到PA的反應(yīng)性產(chǎn)物及其與肝微粒體蛋白的結(jié)合物［40］。應(yīng)用HepG2細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，證明反應(yīng)性產(chǎn)物脫氫PA是PA所致肝毒性的元兇，且表明與HepG2細(xì)胞相比，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞對脫氫PA更為敏感，其較低的谷胱甘肽基礎(chǔ)水平導(dǎo)致更為嚴(yán)重的谷胱甘肽耗竭和吡咯-蛋白加合物生成的顯著增加，從而初步解釋了PA主要攻擊肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致肝毒性的機(jī)制［41］。應(yīng)用自創(chuàng)的LC-MS/MS定量技術(shù)，他們在誤服“土三七”中毒者的血清中首次檢測到吡咯-蛋白加合物，展示了人體PA反應(yīng)性產(chǎn)物修飾蛋白并產(chǎn)生毒性反應(yīng)的直接證據(jù)。結(jié)合在“土三七”中檢測到的PA成分以及大鼠服用藥材后的肝毒性等結(jié)果，他們確證中毒者的肝竇阻塞綜合征是因?yàn)檎`服含有PA的“土三七”引起的［42］。隨后，將此方法用于一組疑似藥源性肝病患者樣品的檢測，不僅在PA相關(guān)的肝竇阻塞綜合佂患者血樣中檢測到吡咯-蛋白加合物，還觀察到血樣吡咯-蛋白加合物濃度與肝損傷嚴(yán)重程度和臨床癥狀密切相關(guān)［43］。為此，他們提出人血吡咯-蛋白加合物可用作PA所致肝竇阻塞綜合征的診斷和預(yù)警標(biāo)志物，通過及時檢測和早期診斷，可以降低PA所致肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)。

在藥物代謝酶介導(dǎo)的生物活化增毒機(jī)制研究中，沈陽藥科大學(xué)鄭江教授課題組將對溴芐胺和谷胱甘肽作為呋喃類化合物反應(yīng)性產(chǎn)物的捕獲劑，建立了高靈敏、高選擇的LC-MS/MS分析技術(shù)［44］，由此研究了中藥呋喃類活性成分的生物活化及毒性機(jī)制。他們發(fā)現(xiàn)，在肝微粒體CYP酶、特別是CYP3A的介導(dǎo)下，有毒中藥黃藥子的活性成分黃獨(dú)素B和8-表黃藥子素E乙酸酯可產(chǎn)生反應(yīng)性中間體順烯二醛，當(dāng)在微粒體孵育液中加入谷胱甘肽和N-乙酰賴氨酸等捕獲劑時，應(yīng)用上述方法可檢測到反應(yīng)性中間體與捕獲劑的加合物，在服用活性成分的動物尿和膽汁中也可檢測到谷胱甘肽加合物；合用CYP3A抑制劑則可顯著降低加合物的生成［45-46］。隨后，他們通過化學(xué)還原呋喃環(huán)、動物合用CYP3A抑制劑以及預(yù)先服用丁硫氨酸亞砜胺等手段，證實(shí)了黃獨(dú)素B和8-表黃藥子素E乙酸酯生物活化與肝毒性的相關(guān)性［47-48］；通過檢測反應(yīng)性產(chǎn)物與蛋白賴氨酸殘基和半胱氨酸殘基的加合物，進(jìn)一步闡明了黃藥子毒性成分經(jīng)代謝活化生成反應(yīng)性中間產(chǎn)物，并修飾蛋白的毒性機(jī)制［49］。

與代謝活化相對應(yīng)，有些有毒中藥或成分在體內(nèi)經(jīng)代謝消除，或在轉(zhuǎn)運(yùn)體的介導(dǎo)下清除，起到解毒的作用。例如，雷公藤的主要有效成分雷公藤甲素的治療窗很窄，具有劑量依賴的肝毒性，臨床上常見肝損傷的報(bào)道。雷公藤甲素在肝藥酶的催化下發(fā)生廣泛代謝，其中CYP3A是參與其代謝的主要酶系［50］。Xu等［51］在敲除細(xì)胞色素還原酶的小鼠上觀察到，代謝酶的缺失能顯著提高雷公藤甲素的血漿和組織暴露水平，血漿AUC約為野生型小鼠的3.6倍。同時，敲除小鼠的肝毒性顯著增高，并導(dǎo)致死亡。在大鼠體內(nèi)和大鼠肝細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)雷公藤甲素與CYP3A酶抑制劑或誘導(dǎo)劑合用時，同樣觀察到肝毒性的顯著增高或降低［52-53］。這些研究表明，肝CYP3A酶介導(dǎo)的代謝消除是雷公藤甲素的重要解毒途徑。隨后，莊笑梅和沈國林等發(fā)現(xiàn)［54］，雷公藤甲素是外排轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp的底物。應(yīng)用大鼠體外“三明治”培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞模型，他們發(fā)現(xiàn)P-gp介導(dǎo)的膽汁排泄也是雷公藤甲素的重要解毒途徑，抑制劑或誘導(dǎo)劑通過調(diào)控肝細(xì)胞頂膜的P-gp功能，可顯著改變雷公藤甲素的膽汁排泄率和肝毒性；同時或分別應(yīng)用P-gp和CYP3A抑制劑，觀察到CYP酶介導(dǎo)的代謝和P-gp介導(dǎo)的膽汁排泄，是雷公藤甲素在肝細(xì)胞并行的2個解毒途徑，且二者的貢獻(xiàn)相當(dāng)。隨后，孔令雷等［55］應(yīng)用干擾RNA技術(shù)，成功敲減小鼠的P-gp的基因表達(dá)；通過比較干擾RNA處理小鼠與對照小鼠的血漿和肝暴露水平以及肝毒性，證實(shí)P-gp介導(dǎo)的膽汁排泄在雷公藤甲素的體內(nèi)清除解毒中發(fā)揮重要作用，抑制P-gp的表達(dá)或功能，將顯著增加其在肝的暴露水平，提高肝毒性的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。這些研究闡釋了雷公藤甲素劑量依賴的肝毒性機(jī)制，并有助于指導(dǎo)臨床合理用藥、預(yù)防因中藥-西藥代謝性相互作用導(dǎo)致的肝毒性。

4 農(nóng)藥和環(huán)境污染物的代謝和毒代動力學(xué)研究

我國是農(nóng)業(yè)大國，每年因殺蟲劑、除草劑中毒的病例眾多，且死亡率很高。農(nóng)藥的毒代動力學(xué)研究，是開展健康風(fēng)險(xiǎn)評估和中毒救治的重要基礎(chǔ)。為此，眾多學(xué)者在動物模型上研究了有機(jī)磷酸酯農(nóng)藥經(jīng)不同途徑染毒的毒代動力學(xué)，例如甲胺磷家兔皮膚染毒［56］、甲氧滴滴涕大鼠灌胃染毒［57］、螨胺磷大鼠靜脈染毒［58］、小鼠靜脈染毒［3H］標(biāo)記氧樂果［59］、大鼠灌胃和靜注敵敵畏染毒［60］的毒代動力學(xué)特征以及菊酯類殺蟲劑等其它農(nóng)藥的毒代動力學(xué)［61-62］。張秀國等［63］還采集中毒患者的生物樣品，研究了敵敵畏的臨床毒代動力學(xué)。研究發(fā)現(xiàn)，敵敵畏在體內(nèi)吸收很快，消除半衰期在1.1～6.7 h；尿排泄量很低，且可能存在腎重吸收的過程，中毒程度與敵敵畏血漿濃度和持續(xù)時間密切相關(guān)。

除了毒代動力學(xué)研究，農(nóng)藥代謝與毒性的相關(guān)性以及種屬差異等的研究也受到關(guān)注。魏霞等［64］研究了水胺硫磷的代謝轉(zhuǎn)化和毒代動力學(xué)特性，觀察到水胺硫磷在大鼠肝微粒體孵育液中能快速消除，生成毒性更高的氧化脫硫產(chǎn)物水胺氧磷，后者抑制乙酰膽堿酯酶的IC50比水胺硫磷低4個數(shù)量級，提示水胺氧磷可能是大鼠體內(nèi)產(chǎn)生毒性的主要成分。隨后，莊笑梅和魏霞等［65］應(yīng)用人肝微粒體進(jìn)一步研究了代謝酶介導(dǎo)的水胺硫磷生物活化和解毒。研究發(fā)現(xiàn)，水胺硫磷氧化脫硫的生物活化反應(yīng)由CYP3A4，1A2和2D6等多個CYP同工酶介導(dǎo)，但氧化脫硫不是水胺硫磷在人肝微粒體的主要代謝途徑，羧酸酯酶介導(dǎo)的水解反應(yīng)才是其在人肝的主要代謝途徑，生成的產(chǎn)物低毒或無毒。機(jī)制研究表明，水胺硫磷對人肝微粒體羧酸酯酶和CYP酶介導(dǎo)的水解或氧化反應(yīng)的親和力有很大差別，消除半衰期分別是5.2和90 min。結(jié)果提示，水胺硫磷在大鼠和人體中可能經(jīng)歷不同的代謝轉(zhuǎn)化過程，人肝具有較大的解毒能力。因此，在評價水胺硫磷的人體健康風(fēng)險(xiǎn)時，大鼠不是適宜的動物模型。

近年來，隨著國家和民眾對環(huán)境和食品安全的關(guān)注，環(huán)境污染物和食品添加物的毒理學(xué)研究和安全性評價得以重視，污染物在機(jī)體中的吸收、分布蓄積、代謝消除和排泄的研究和報(bào)道逐漸增多。除了應(yīng)用嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物評價重金屬鉛［66］、多溴聯(lián)苯類［67-68］和雙酚A［69］等的毒代動力學(xué)或組織攝取分布外，我國研究人員還在魚、鰍類以及扇貝等生物體內(nèi)外，研究了鹵代芴［70］、硫代硫酸酯［71］、有機(jī)氯殺蟲劑［72］、多溴聯(lián)苯醚［73］和苯并芘［74］的毒代動力學(xué)、組織蓄積和代謝轉(zhuǎn)化等。為了更好的評估化學(xué)毒物或環(huán)境污染物的風(fēng)險(xiǎn)，我國學(xué)者還應(yīng)用PBTK模型模擬或預(yù)測動物暴露水平和器官蓄積，研究毒代與毒效的相關(guān)性。例如，王陽等［75］建立了包含氣體交換室（肺）、脂肪、充分灌注室、不充分灌注室和肝等5個房室的PBTK模型，各房室內(nèi)化學(xué)物的濃度變化率由質(zhì)量守恒微分方程表達(dá)，通過模擬受試者7.5 h暴露于59 ppm和261 ppm氯乙烯后的呼出氣濃度，并與文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行比較，對模型進(jìn)行了驗(yàn)證。隨后，應(yīng)用模型模擬預(yù)測了成人連續(xù)6 h暴露于100 ppm氯乙烯后的肝和靜脈血濃度，以及氯乙烯肝代謝量的經(jīng)時變化曲線。他們還應(yīng)用PBTK模型模擬預(yù)測苯暴露人群在環(huán)境暴露水平下的體內(nèi)分布和代謝轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)，以預(yù)測得到的總代謝量為內(nèi)劑量，采用多階模型，由劑量-反應(yīng)函數(shù)推算苯代謝產(chǎn)物引起的職業(yè)工人苯暴露后的致癌風(fēng)險(xiǎn)，為職業(yè)性苯暴露的風(fēng)險(xiǎn)評估和危害管控，提供了科學(xué)依據(jù)［76］。其他研究報(bào)道還有應(yīng)用PBTK模型比較鎘及重金屬混合物在大鼠體內(nèi)的分布［77］，以及應(yīng)用生理的毒代和毒效聯(lián)合模型，模擬預(yù)測苯并芘在扇貝消化腺的分布濃度和毒理效應(yīng)［74］。上述研究展示了PBPK模型在毒代動力學(xué)模擬預(yù)測和人體風(fēng)險(xiǎn)評估中的良好應(yīng)用前景。

綜上所述，30年來我國的毒物代謝和毒代動力學(xué)研究在技術(shù)方法和研究的深度和廣度上都有顯著的進(jìn)步，這些研究不僅有助于認(rèn)識和理解有毒有害物質(zhì)的毒理學(xué)特征和作用機(jī)制，也為毒物損傷防護(hù)和中毒救治提供科學(xué)依據(jù)。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和我國在安全和健康方面持續(xù)增長的需求，可以期望，我國的毒物代謝和毒代動力學(xué)的研究和應(yīng)用將會進(jìn)一步的發(fā)展和提高，并在國家化學(xué)安全、、臨床用藥安全、環(huán)境和食品安全以及中藥現(xiàn)代化等方面發(fā)揮越來越重要的作用。

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Thirty years of research on toxicant metabolism and toxicokinetics in China

LI Hua
（Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850,China）

Toxicant metabolism and toxicokinetics are an integrated part of toxicology.They study the absorption，targeted distribution，metabolic detoxicification or bioactivation，excretion and elimination of toxic substances after the body′s exposure via different routes，and also evaluate the effects of various factors on the disposition of poisons.The results of the studies provide essential data on the relation?ships between exposure kinetics and toxicological effect and their mechanisms.They also help to find possible targets of intoxication or detoxicification pathways，which can lead to efficient countermea?sures.In this review，the author summarized the thirty years of progress and features of the research on toxicant metabolism and toxicokinetics in China.

toxicokinetics;metabolism;chemical warfare agent;toxic herbal drug;pesticide; environmental pollutant

LI Hua，E-mail：amms_hli@126.com

R99

A

1000-3002-（2016）12-1333-10

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.12.012

Foundation item：The project supported by National Science and Technology Major Project of China（2008ZXJ09006001）；and National Science and Technology Major Project of China（2015ZX09J15104）

2016-12-02接受日期：2016-12-14）

（本文編輯：齊春會）

國家科技重大專項(xiàng)（2008ZXJ09006001）；國家科技重大專項(xiàng)（2015ZX09J15104）

李 樺，E-mail:amms_hli@126.com