痛安注射液的化學成分研究（Ⅰ）＊

尚 嬋，李海波，李孟璇，蘇真真，孟兆青，黃文哲，王振中，丁 崗，楊中林，蕭 偉＊＊

（1.中國藥科大學中藥學院 南京 211198；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；3.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室 連云港 222001）

痛安注射液的化學成分研究（Ⅰ）＊

尚 嬋1，李海波2，李孟璇2，蘇真真2，孟兆青2，黃文哲2，王振中2，丁 崗2，楊中林2，蕭 偉2＊＊

（1.中國藥科大學中藥學院 南京 211198；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；3.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室 連云港 222001）

目的：研究痛安注射液中的抗炎活性成分。方法：采用LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型檢測化合物對PGE2抑制活性，綜合應用HP-20大孔吸附樹脂、硅膠柱色譜、ODS柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜、制備及半制備HPLC等色譜方法對活性部位進行分離和純化，根據化合物的光譜數(shù)據和理化性質鑒定化合物的結構。結果：痛安注射液中經HP-20大孔吸附樹脂，95%乙醇洗脫部位為抗PGE2釋放活性部位，從中分離得到17個化合物，分別鑒定為丁香脂素（1）、N-反式阿魏酰酪胺（2）、白屈菜紅堿（3）、青藤堿（4）、黃連堿（5）、血根堿（6）、白屈菜堿（7）、木蘭花堿（8）、別隱品堿（9）、原阿片堿（10）、杜鵑素（11）、二氫血根堿（12）、Heptadec-（9Z）-enoic acid（13）、綠原酸（14）、隱綠原酸（15）、3，5-O-二咖啡酰奎寧酸（16）、4，5-O-二咖啡酰奎寧酸（17）；通過PGE2抑制活性檢測，6個化合物對PGE2具有很好的抑制作用。結論：化合物1-17均為首次從痛安注射液中分離得到，化合物2、5、9、10、11、12對PGE2具有很好的抑制作用。

痛安注射液黃酮生物堿有機酸苯丙素PGE2

痛安注射液由青風藤、白屈菜、漢桃葉三味常用中藥材精制而成，主要用于放化療或非放化療的肺癌、肝癌、胃癌等腫瘤屬血瘀引發(fā)的癌性中度疼痛[1]。其臨床癌痛緩解總有效率達98.04%[2]。本課題組前期對痛安注射液進行了PGE2抑制活性檢測，結果顯示：經HP-20大孔樹脂95%乙醇洗脫部位對PGE2有很好的抑制活性。在此基礎上，本研究對活性部位（95%乙醇洗脫部位TA-4）進行了系統(tǒng)的化學成分研究，從中分離得到了17個化合物，分別鑒定為（1）、N-反式阿魏酰酪胺（2）、白屈菜紅堿（3）、青藤堿（4）、黃連堿（5）、血根堿（6）、白屈菜堿（7）、木蘭花堿（8）、別隱品堿（9）、原阿片堿（10）、杜鵑素（11）、二氫血根堿（12）、Heptadec-（9Z）-enoic acid（13）、綠原酸（14）、隱綠原酸（15）、3，5-O-二咖啡?？鼘幩幔?6）、4，5-O-二咖啡?？鼘幩幔?7）。上述化合物均為首次從痛安注射液中分離得到，通過17個化合物的PGE2抑制活性檢測，結果顯示：化合物2、5、9、10、11、12對PGE2具有很好的抑制作用。

1 實驗材料

高效液相色譜儀Agilent1200（美國安捷倫科技有限公司），BruckerAVANCE400 型核磁共振儀（瑞士Brucker公司），F(xiàn)innigan LCQ Advantage MAX 質譜儀（Thermo Fisher Scientific），R502B型旋轉蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司），SHZ-IIIB循環(huán)水真空泵（臨海市譚氏真空設備有限公司），Agilent 1260制備型高效液相色譜（美國安捷倫科技有限公司），分析高效液相色譜柱為 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，ZORBAXExtend-C18美國安捷倫科技有限公司），制備高效液相色譜柱為C18柱（250 mm×20 mm，5 μm，YMC-PACKODS-A，YMC）。

硅膠薄層色譜板（青島海洋化工廠分廠），制備薄層硅膠板和柱色譜硅膠（100-200、200-300目，青島海洋化工廠分廠），HP-20 大孔樹脂（日本Mitsubishi-Chemical公司），Sephadex LH-20填料（瑞典Amersham Biosciences公司），反相ODS柱色譜填料（40 μm，日本YMC公司），色譜甲醇和乙腈（美國Tedia試劑公司），小鼠巨噬細胞系（RAW264.7，中國中醫(yī)科學院），Thermo Scientific BB15型CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Electron公司），Nikon TS100型倒置顯微鏡ZW-A型微量振蕩器（常州國華儀器有限公司），PGE2ELISA kit（瑞士Enzo Life Sciences公司，批號：06241415D），0.25% Trypsin-EDTA（美國Gibco公司，批號：1697785），DMSO（上海晶純生化科技股份有限公司，批號：40399），脂多糖（南京大治生物科技有限公司），F(xiàn)BS（美國GEMINI公司，批號：A79E00G），DMEM/ HIGH GLUCOSE（美國Thermo scientific公司，批號：NAH1441）。其余所用試劑均為分析純，購自廣東光華科技股份有限公司、國藥集團化學試劑有限公司。痛安注射液（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號140601）。

2 提取分離

取痛安注射液成品濃縮液1246g，用適量水溶解后經HP-20 大孔樹脂吸附，用乙醇-水（水、 50%、70% 及95%乙醇）梯度洗脫，得到水洗脫部位TA-1（603.88 g），50%乙醇洗脫部位TA-2（145.97 g），70%乙醇洗脫部位TA-3（58.27 g），95%乙醇洗脫部位TA-4（67.01 g）。取TA-4（65 g）進行硅膠柱色譜分離， 氯仿-甲醇（100:0、98:2、 95:5、 92:8、90:10、85:15、80:20、70:30、50:50、30:70、0:100）梯度洗脫共得到12個組分Fr. 1-12。Fr. 1（0.6 g）經Sephadex LH-20 柱色譜及反相 HPLC 分離，得到化合物1（4.72 mg），2（2.21 mg），12（3.12 mg），F(xiàn)r. 2（1.68 g）經反相 HPLC 分離，得到化合物3（5.53 mg），5（3.78 mg），6（2.23 mg），8（2.10 mg），9（6.25 mg），11（2.78 mg），14（3.75 mg），F(xiàn)r. 4（29 g）經反復硅膠、 ODS及反相 HPLC 分離，得到化合物13（8.43 mg），7（1.36 g）、4（5.88 mg）、10（100.73 mg）、15（3.28 mg）、16（2.33 mg）、17（6.10 mg）、18（4.7 mg）。

3 結構鑒定

化 合 物1：白 色 針 狀 結 晶；ESI-MS m/z: 441[M+Na]+，1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ: 6.59（4H，s，H-2′，H-2″，H-6′，H-6″），5.51 （4H，brs，4′-OH，4″-OH），4.75（2H，brd，J = 4.5 Hz，H-2，H-6），4.29（2H，dd，J = 6.57Hz，J = 7.04 Hz，H-4，H-8），3.89（2H，dd，J = 3.8Hz，J = 9.2 Hz，H-4，H-8），3.10（12H，s，4×OCH3），3.10（2H，m，H-1，H-5）；13C-NMR （100 MHz，CD3OD）δ:147.38（C-3），147.38（C-5），134.53（C-1），132.33（C-4），102.93（C-2），102.93（C-6），86.3（C-7），72.03（C-9），56.61（C-3-OCH3），56.61（C-5-OCH3），54.58（C-8）。以上數(shù)據與文獻報道一致[3]，故鑒定化合物1為丁香脂素。

化合物2：無色油狀；ESI-MS m/z: 314[M+H]+，1H-NMR（400 MHz， CD3OD）δ:7.42（1H，d，J=15.45 Hz，H-7），7.08（1H，d，J=1.64Hz，H-2），7.03（2H，d，J=8.28Hz，H-2′，H-6′），7.01（1H，dd，J=8.45Hz，J=1.5Hz，H-6），6.77（1H，d，J=8.83Hz，H-5），6.70（2H，d，J=8.71Hz，H-3′，H-5′），6.39（1H，d，J=15.98Hz，H-8），3.84（3H，s，3-OCH3），3.45（2H，t，J=7.24Hz，H-8′），2.74（2H，t，J=7.48Hz，H-7′）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ:169.17（C-9），156.93（C-4′），149.84（C-4），149.27（C-3），142.04（C-7），131.27（C-1′），130.74（C-2′，C-6′），128.23（C-1），123.22（C-6），118.68（C-8），116.44（C-5），116.25（C-3′，C-5′），111.46（C-2），56.34（C-3-OCH3），42.55（C-8′），35.8（C-7′）。以上數(shù)據與文獻報道一致[4]，故鑒定化合物2為N-反式阿魏酰酪胺。

化合物3：淡黃色粉末；ESI-MS m/z:348[M]+，1H-NMR（400 MHz， DMSO-d6）δ: 10.09（2H，s，H-6），8.85（1H，d，J=8.83Hz，H-10），8.79（1H，d，J=8.26 Hz，H-11），8.46（1H，s，H-4），8.27（1H，d，J=8.86Hz，H-9），8.27（1H，d，J=8.86 Hz，H-12），7.82（1H，s，H-1），6.35（2H，d，-OCH2O-），4.97（3H，s，8-OCH3），4.20（3H，s，7-OCH3），4.15（3H，s，N-CH3）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ:152.68（C-6），151.26（C-4），149.89（C-2），149.01（C-3），148.98（C-8），146.35（C-7），127.98（C-12），127.98（C-10a），126.55（C-10b），124.78（C-6a），120.88（C-4a），118.75（C-10），117.22（C-11），105.31（C-1），103.28（C-4b），102.78（C-2，3-OCH2O-），101.25（C-9），61.98（C-7-OCH3），58.58（C-8-OCH3），51.15（C-N-OCH3）。以上數(shù)據與文獻報道一致[5]，故鑒定化合物3為白屈菜紅堿。

化合物4 ：白色針晶；ESI-MS m/z:330[M+H]+，1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ:10.74（1H，s，OH），6.74（1H，d，J=8.46Hz，H-2），6. 62（1H，d，J=8.18 Hz，H-1），5.35（1H，s，br，W1/2 =2.0 Hz，H-8），4. 35（1H，d，J=15.12Hz，5-He），3.85（3H，s，2-OCH3），3.51（3H，s，7-OCH3），3.15（1H，m，H-9），3.05（1H，m，H-14），3.01（1H，m，10-He），2.77（1H，dd，J=5.15，17.28Hz，10-Ha），2.57（1H，d，J=15.28Hz，5-Ha），2.42（1H，m，16-He），2.33（3H，s，NH3），2.12（1H，m，16-Ha），1.93（2H，m，H-15）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ:192.27（C-6），153.12（C-7），146.26（C-3），145.18（C-4），125.47（C-11），120.56（C-12），118.98（C-1），110.72（C-8），110.26（C-2），58.71（C-9），56.39（C-3-OCH3），55.28（C-7-OCH3），48.5（C-16），47.49（C-5），42.25（C-14），39.05（C-13），33.53（C-15），24.83（C-10）。以上數(shù)據與文獻報道一致[6，7]，故鑒定化合物4為青藤堿。

化 合 物5：黃 色 棱 晶；ESI-MS m/z:320[M]+，1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ:9.95（1H，s，H-8），8.96（1H，s，H-13），8.03（1H，d，J=7.66 Hz，H-11），7.82（1H，d，J= 8.43 Hz，H-12），7.79（1H，s，H-1），7.08 （1H，s，H-4），6.53（2H，brs，-OCH2O-），6.17（2H，brs，-OCH2O-），4.88（2H，dd，J =6.2，6.0 Hz，H-6），3.20（2H，dd，J= 6.2，6.0 Hz，H-5）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ:149.78（C-3），147.06（C-2），144.55（C-8），147.70（C-10），143.84（C-9），136.84（C-13a），132.33（C-12a），130.56（C-4a），121.73（C-13），121.04（C-11，12），120.98（C-8a），111.64（C-13b），108.42（C-4），105.3（C-1），104.47（-OCH2O-），102.08（-OCH2O-），55.08（C-6），26.25（C-5）。以上數(shù)據與文獻報道一致[8]，故鑒定化合物 5為黃連堿。

化合物6：橙紅色針晶；ESI-MS m/z:332[M]+，1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ:8.79（1H，d， J=9.6 Hz，H-11），8.64（1H，d，J=8.63 Hz，H-12），8.30（1H，s，H-4），8.27（1H，d，J=8.2Hz，H-10），7.95（1H，s，H-1），7.77（1H，d，J=8.2Hz，H-9），6.61（1H，s，-OCH2O-），6.35（2H，s，-OCH2O-），6.11（1H，s，-OCH2O-），5.45（1H，s，H-6），4.92（3H，s，N-CH3）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ:150.4（C-3），149.19（C-2），147.97（C-8），146.72（C-7），131.93（C-12a），131.75（C-4a），131.75（C-4b），127.62（C-10a），126.13（C-12），120.74（C-10b），120.38（C-11），119.34（C-10），117.8（C-6a），109.94（C-9），106.2（C-1），105.36（-OCH2O-），105.36（-OCH2O-），104.71（C-4），103.24（C-6），52.56（N-CH3）。以上數(shù)據與文獻報道一致[9]，故鑒定化合物 6為血根堿。

化合物7：白色結晶；ESI-MS m/z:354[M+H]+，1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ: 6.86（1H，d，J=7.28Hz，H-9），6.78（1H，d，J=8.0Hz，H-10），6.77（1H，s，H-4），6.69（1H，s，H-1），6.00（1H，d，J=1.27Hz，-OCH2O-），5.98（1H，d，J=1.27Hz，-OCH2O-），5.95（1H，d，J=1.70Hz，-OCH2O-），5.93（1H，d，J=1.31Hz，-OCH2O-），4.21（1H，brs，W1/2=7.9Hz，H-11），4.08（1H，d，J=15.85Hz，H-6a），3.63（1H，brs，H-14），3.49（1H，d，J=15.72Hz，H-6），3.12（1H，d，J=17.5Hz，H-12a），3.11（1H，dd，J=17.5，4.3Hz，H-12b），3.05（1H，t，J=2.25Hz，H-13），2.30（3H，s，N-CH3）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ:149.8（C-8），147.12（C-3），147.01（C-2），144.48（C-7），132.41（C-10a），129.65（C-4a），127.08（C-12b），121.91（C-10），118.35（C-6a），113.08（C-4），110.25（C-9），108.42（C-1），102.77（C-7，8-OCH2O-），102.55（C-2，3-OCH2O-），74.23（C-11），64.11（C-14），54.47（C-6），42.7（N-CH3），42.1（C-12a）。以上數(shù)據與文獻報道一致[10]，故鑒定化合物 7為白屈菜堿。

化合物8：淡黃色粉末；ESI-MS m/z:342[M]+，1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ: 6.65（1H，d，J=8.22Hz，H-8），6.45（1H，s，H-3），6.43（1H，d，J=4.38Hz，H-9），4.92（2H，d，J=5.76Hz，H-6α），3.82（3H，s，10-OCH3），3.74（3H，s，2-OCH3），3.56（1H，m，H-5β），3.41（1H，m，H-5α），3.22（3H，s，N-CH3-β），3.13（1H，m，H-4β），3.13（1H，m，H-7β），2.89（1H，m，H-4α）3.13（1H，m，H-7β），3.75（3H，s，N-CH3-α），2.55（1H，m，H-7α）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ:153.21（C-2），151.85（C-10），150.88（C-1），149.83（C-11），126.12（C-7a），123.71（C-11a），123.58（C-1a），121.11（C-1b），117.18（C-8），115.93（C-3a），110.65（C-9），109.51（C-3），71.13（C-6α），62.38（C-5α），56.42（N-CH3-β），56.09（N-CH3-α），54（C-10-OCH3），43.64（C-2-OCH3），31.7（C-7α），24.71（C-4α）。以上數(shù)據與文獻報道一致[11]，故鑒定化合物 8為木蘭花堿。

化 合 物9：白 色 塊 狀 結 晶；ESI-MS m/z: 370[M+H]+，1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ: 6.94（1H，s，H-1），6.91（1H，d，J=8.22Hz，H-11），6.79（1H，d，J=8.66Hz，H-12），6.62（1H，s，H-4），5.93（2H，s，-OCH2O-）， 3.84（3H，s，10-OCH3），3.76（3H，s，9-OCH3），3.29（2H，s，H-8），2.49（2H，dd，H-5），2.49（2H，s，H-13），2.48（2H，dd，H-6），1.54（3H，s，N-CH3）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ:192.89（C-14），161.12（C-9），146.98（C-10），144.21（C-2），147.12（C-3），135.79（C-14a），129.77（C-12a），128.78（C-8a），127.6（C-12），110.5（C-11），110.12（C-4），109.22（C-4a），107.98（C-1），100.82（C-2，3-OCH2O-），56.77（C-6），50.12（C-8），60.39（C-9-OCH3），55.5（C-10-OCH3），46.8（C-13），39.98（N-OCH3），30.79（C-5）。以上數(shù)據與文獻報道一致[5]，故鑒定化合物9為別隱品堿。

化合物10：白色粉末；ESI-MS m/z:354[M+H]+，1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ:6.90（1H，s，H-1），6.70（1H，s，H-4），6.67（1H，d，J = 7.9 Hz，H-11），6.64（1H，d，J=7.9 Hz，H-12），5.95（2H，s-OCH2O-），5.92 （2H，s，-OCH2O-），3.78（2H，brs，H-13），3.57（2H，brs，H-8），2.89（2H，m，H-5），2.53（2H，m，H-6），1.92（3H，s，N-CH3）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ:194.9（C-14），148.16（C-3），146.47（C-2），146.15 （C-9），146.04（C-10），136.27（C-4a），132.89（C-14a），129.11（C-12a），125.22（C-12），118.02（C-8a），110.62（C-4），108.3（C-1），106.89（C-11），101.35（-OCH2O-），101（-OCH2O-），57.95（C-6），50.99（C-8），46.61（C-13），41.46（-NCH3），31.92（C-5）。以上數(shù)據與文獻報道一致[9]，故鑒定化合物10為原阿片堿。

化合物11：白色粉末；ESI-MS m/z:299 [MH]-，1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ: 7.33（2H，d，J=8.21 Hz，H-2′，6′），6.84（2H，d，J=8.21 Hz，H-3′，5′），5.30（1H，dd，J= 12.28，3.23 Hz，H-2），3.08（1H，dd，J=16.8，12.8 Hz，H-3a），2.72（1H，dd，J=17.2，2.8 Hz，H-3b），2.00（3H，s，6-CH3），1.99（3H，s，8-CH3）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ:198.53（C-4），164.26（C-9），160.42（C-5），159.46（C-7），158.98（C-4′），131.68（C-1′），128.96（C-2′，6′），116.46（C-3′，5′），104.91（C-6），104.21（C-10），103.39（C-8），80.19（C-2），44.24（C-3），8.3（6-CH3），7.56（8-CH3）。以上數(shù)據與文獻報道一致[12]，故鑒定化合物11為杜鵑素。

化 合 物12：無 色 針 狀 結 晶；ESI-MS m/z: 334[M+H]+，1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ:7.77（1H，d，J=8.66Hz，H-11），7.56（1H，s，H-4），7.53（1H，d，J=9.38Hz，H-12），7.40（1H，d，J=8.27 Hz，H-10），7.30（1H，s，H-1），6.95（1H，d，J=8.3 Hz，H-9），6.13（2H，s，-OCH2O-2，3），6.09（2H，s，-OCH2O-7，8），4.12（2H，s，H-6），2.50（3H，s，N-CH3）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ:148.00（C-2），147.35（C-3），146.99（C-8），144.37（C-7），141.96（C-4b），130.52（C-12a），128.73（C-10a），126.46（C-4a），125.81（C-10b），124.03（C-12），120.36（C-11），116.38（C-10），112.90（C-6a），107.35（C-9），104.31（C-1），101.43（-OCH2O-7，8），101.30（-OCH2O-2，3），99.83（C-4），47.97（C-6），41.37（N-Me）。以上數(shù)據與文獻報道一致[13]，故鑒定化合物12為二氫血根堿。

化合物13：白色粉末；ESI-MS m/z: 269[M+H]+，1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ: 5.35（2H，d，J= 4.57，11.1Hz，H-9，H-10），2.22（2H，d，J=8.4 Hz，H-2），2.01（4H，m，J=5.56 Hz，H-8，H-11），1.63（2H，m，J=6.9 Hz，H-3），1.31-1.26（18H，brm，9×CH2），0.88（3H，t，J=6.78 Hz，H-18）；13C-NMR（63 MHz，CDCl3）δ:175.39（C-1），129.94（C-9），129.90（C-10），35.94（C-2），31.92（C-15），29.79，29.61，29.56，29.54，29.49，29.33，27.23（C-8，C-11），25.55（C-3），22.7（C-16），14.12（C-17）。以上數(shù)據與文獻報道一致[14]，故鑒定化合物13為Heptadec-（9Z）-enoic acid。

化合物14：白色無定形粉末；ESI-MS m/z:377[M+Na]+，353 [M-H]-，1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ:7.60（1H，d，J=15.88Hz，H-β），7.14（1H，d，J=2.1Hz，H-2′），6.96（1H，dd，J=8.35，2.10 Hz，H-6′），6.78（1H，d，J=8.5 Hz，H-5′），6.36（1H，d，J= 15.79 Hz，H-α），5.26（1H，dd，J=9.1，8.6，4.1 Hz，H-5），4.20（1H，brs，H-3），3.76（1H，dd，J=8.23，3.21Hz， H-4），2.19（2H，m，H-2），1.99（2H，m，H-6）。以上數(shù)據與文獻報道一致[15]，故鑒定化合物14為綠原酸。

化合物15：白色無定形粉末；ESI-MS m/z: 377[M+Na]+，353 [M-H]-，1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ:7.64（1H，d，J=15.85 Hz，H-β），7.28（1H，d，J=1.85 Hz，H-2′），6.96（1H，dd，J=8.21，1.79Hz，H-6′），6.82 （1H，d，J=8.21 Hz，H-5′），6.40（1H，d，J=15.88 Hz，H-α），4.79（1H，dd，J=11.91，3.0 Hz，H-4），4.29（1H，m，H-3），4.29（1H，m，H-5），2.25（2H，m，H-2），1.98（2H，m，H-6）。以上數(shù)據與文獻報道一致[16]，故鑒定化合為15為隱綠原酸。

化合物16：淡黃色無定形粉末；ESI-MS m/ z: 539[M+Na]+，515 [M-H]-，1 H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ:7.66（1H，d，J=15.78Hz，H-3′），7.57（1H，d，J=15.78Hz，H-3″），7.17（2H，br，d，J=2.02Hz，H-5′，5″），6.87（2H，d，J=8.15Hz，H-8′，8″），6.78（2H，d，J=8.15，1.9 Hz，H-9′，9″），6.34（1H，d，J=15.85 Hz，H-2′），6.25（1H，d，J=15.85 Hz，H-2″），5.43 （2H，m，H-3，5），3.66（1H，dd，J=6.52，3.2 Hz，H-4），2.29（2H，m，H-2），2.08（2H，m，H-6）。以上數(shù)據與文獻報道一致[17]，故鑒定化合物16 為 3，5-O-二咖啡?？鼘幩?。

化合物17：淡黃色無定形粉末；ESI-MS m/ z: 539[M+Na]+，515 [M-H]-，1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ: 7.58（1H，d，J=15.85Hz，H-3′），7.49（1H，d，J=15.85Hz，H-3″），6.99（2H，d，J=2.0Hz，H-5′，5″），6.94（1H，dd，J=8.15，2.0 Hz，H-9′），6.93（1H，dd，J = 8.2，2.0Hz，H-9″），6.79（1H，d，J=8.19 Hz，H-8″），6.75（1H，d，J=8.2 Hz，H-8′），6.20（1H，d，J =15.85Hz，H-2′），6.08（1H，d，J=15.85 Hz，H-2″），5.53 （1H，m，H-5），5.09（1H，dd，J=8.7，2.0Hz，H-4），4.37（1H，d，J=6.5，3.1Hz，H-3），2.37-2.10（2H，m，H-6），2.34-2.10（2H，m，H-2）。以上數(shù)據與文獻報道一致[18]，故鑒定化合物17 為4，5-O-二咖啡?？鼘幩帷?/p>

圖1 各化合物的抑制率/%

4 化合物對PGE2抑制作用的研究

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）為革蘭氏陰性菌細胞壁的主要組成成分，機體受到感染時，LPS作用于細胞膜受體誘導炎癥因子前列腺素E2（Prostaglandins E2，PGE2）、NO、TNF-α等的釋放，其中PGE2是參與炎癥、疼痛等多種生理病理機制過程的活性物質[19]。研究采用LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型檢測化合物對PGE2抑制活性，化合物的最高測試濃度均為100 nmol·L-1。

實驗設空白對照組、溶劑對照組、模型組和樣品組4組，陽性藥塞來昔布（3 300 nmol·L-1）做對照。取對數(shù)期的RAW264.7細胞，用0.25%胰酶消化，用培養(yǎng)基稀釋細胞密度為1×105個/mL，每孔400 μL均勻接種于24孔板中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h形成細胞單層。棄培養(yǎng)液，給藥組分別加入稀釋后的化合物，每組3復孔。空白對照組加入無血清的培養(yǎng)基，溶劑對照組加入含0.1%DMSO的無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱中孵育1 h后，模型組和給藥組每孔加入終濃度為1 μg·mL-1LPS，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。收集細胞上清，按Elisa試劑盒說明書檢測PGE2含量。抑制率的計算公式如下：

抑制率=（模型組PGE2的平均含量－樣品組PGE2的平均含量）/（模型組PGE2的平均含量－溶劑組PGE2的平均含量）×100%

各化合物的抑制率見圖1，由圖可見，化合物二氫血根堿、別隱品堿、N-反式阿魏酰酪胺、血根堿、黃連堿、白屈菜紅堿、丁香脂素、木蘭花堿、原阿片堿、對PGE2的抑制作用較好，Heptadec-（9Z）-enoic acid、白屈菜堿、青藤堿、3，5-O-二咖啡?？鼘幩?、4，5-O-二咖啡酰奎寧酸、綠原酸、隱綠原酸對PGE2有一定的抑制作用。

5 討論

本研究采用現(xiàn)代化學與藥理學相結合的方法對痛安注射液進行了系統(tǒng)的化學成分分析，綜合應用各種色譜分離手段分離鑒定了17個化合物，所有化合物均為首次從痛安注射液中分離得到，并采用LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型對所分離到的17化合物進行了PGE2抑制活性檢測。結果顯示，生物堿類化合物對PGE2有較好的抑制活性，該類化合物可能是痛安注射液鎮(zhèn)痛抗炎的主要藥效物質。這在一定程度上揭示了該產品發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的物質基礎，為探討生物堿類成分對復方藥效的貢獻提供了依據。本研究也為后期痛安注射液指紋圖譜的指認以及建立與功效相關聯(lián)的質量控制方法奠定了一定的基礎，同時也為抗炎鎮(zhèn)痛相關新藥研發(fā)和相關有效成分發(fā)現(xiàn)奠定了基礎。

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Chemical Constituents from Tong An Injection (I)

Shang Chan1, Li Haibo2, Li Mengxuan2, Su Zhenzhen2, Meng Zhaoqing2, Huang Wenzhe2, Wang Zhenzhong2, Ding Gang2, Yang Zhonglin2, Xiao Wei2
(1. China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China; 2. Jiangsu Kanion Parmaceutical Co. Ltd., Lianyungang 222001, China; 3. State Key Laboratory of New-Tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China)

This study aimed at investigating the antiviral constituents from the active fractions of Tong-An (TA) injection. In this study, the active constituents of TA injection were screened by LPS-induced PGE2productionmode to detect the contents of PGE2. The chemical constituents were isolated by HP-20 macroporous resin, silica gel column chromatography, ODS column chromatography, Sephadex LH-20 column chromatography and preparative and semi-preparative HPLC. The structures were identified by spectral data and physicochemical property. As a result, the 95% ethanol eluate of TA injection on the macroporous adsorption resin column was proved to be the active fraction of TA injection. Seventeen compounds were isolated from TA injection and identified as syringaresinol (1), N-Trans-Feruloyltyramine (2), chelerythrine (3), sinomenine (4)，coptisine (5), sanguinarine (6), chelidoniny (7), magnoflorine (8), allocryptopine (9), protopine (10), farrerol (11), dihydrosanguinarine (12), heptadec-(9Z)-enoic acid (13), chlorogenic acid (14), cryptochlorogenin acid (15), 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (16) and 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (17). PGE2inhibitory activities of these compounds were determined, among which six compounds presented inhibitory activities against PGE2. It was concluded that all the isolated compounds from TA injection were firstly reported with the favorable inhibitory activities of compounds 2, 5, 9, 10, 11, 12 against PGE2.

Tong-An injection, flavonoids, alkaloid, organic acids, phenylpropanoids, prostaglandin E2

10.11842/wst.2016.12.016

R284.1

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2016-09-30

修回日期：2016-10-19

＊ 江蘇省自然科學基金委青年基金項目（BK20140441）：基于活性成分追蹤分離及快速檢識分析新策略的中藥復方藥效物質基礎研究，負責人：李海波。

＊＊ 通訊作者：蕭偉，本刊編委，研究員級高級工程師，博士，主要研究方向：中藥新藥的研究與開發(fā)。