MTs在肝癌發(fā)生和發(fā)展中的作用及中醫(yī)藥防治機制＊

方肇勤，梁 超，盧文麗，張園園，彭 磊

（上海中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 上海 201203）

MTs在肝癌發(fā)生和發(fā)展中的作用及中醫(yī)藥防治機制＊

方肇勤＊＊，梁 超，盧文麗，張園園，彭 磊

（上海中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 上海 201203）

本文簡要綜述了近十多年來，本項目組探索金屬硫蛋白家族（Metallothioneins，MTs）在肝癌發(fā)生與發(fā)展中的作用及其中醫(yī)藥防治機制。研究發(fā)現(xiàn)，MTs對于肝癌細胞惡性增殖是必要的，在不同應(yīng)激狀態(tài)下肝癌細胞MTs表達會顯著增加，MTs可能通過上調(diào)肝癌細胞核糖體蛋白等基因的表達發(fā)揮促進其惡性增殖的作用。MTs在肝癌細胞中的過表達，可能直接改變了細胞核內(nèi)離子的平衡，并通過與多基因的相互作用，發(fā)揮促進肝癌細胞惡性增殖基因表達的作用。中醫(yī)藥防治肝癌常用治法方藥可以不同程度地減輕和緩解由二乙基亞硝胺（Diethylnitrosamine，DEN）所造成的肝毒性和損傷作用，降低MTs表達，提示在肝臟保護、抑制其異常增生和肝癌發(fā)展方面十分重要。

原發(fā)性肝癌 金屬硫蛋白 基因表達 RNA干擾 治法 中藥

原發(fā)性肝癌（Hepatocellular Carcinoma，Hcc，簡稱肝癌）是中國重大疾病，居惡性腫瘤死亡率前位，發(fā)病人數(shù)約占全球的55%。由于肝癌的發(fā)生機制十分復雜，以及臨床前基礎(chǔ)與應(yīng)用研究相對薄弱，近年來肝癌各種療法的5年生存率已接近極限，因而對基礎(chǔ)研究提出了愈來愈迫切的要求。

在肝癌防治方面，中醫(yī)藥一直發(fā)揮著十分重要的作用，其優(yōu)勢在對肝臟保護、副作用小、癥狀改善和延長帶瘤生存期等方面。中醫(yī)藥講究辨證論治，針對肝癌患者常見脾氣虛弱、氣滯血瘀、痰熱邪毒等證候，給予健脾益氣、行氣活血、清熱解毒等治法方藥。我們采用這些代表性治法方藥開展了大量的大鼠、小鼠肝癌防治研究，驗證了其療效和特點。

2003年，在自然基金的資助下，本課題組研究發(fā)現(xiàn)，采用DEN誘導大鼠肝癌，至肝臟惡性增殖及肝癌形成階段MT2表達顯著增加，提示MT2與肝癌惡性增殖密切相關(guān)。與肝癌模型組比較，中藥不同治法復方給藥后，對其均呈不同程度的下調(diào)（圖1、圖2）。

本課題組研究還發(fā)現(xiàn)，伴隨MT2上調(diào)，大鼠肝癌（含肝組織）中表達增加的還有結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)錄、DNA結(jié)合等信號通路的基因群，提示MT2可能直接或間接促進了這些通路基因的表達。

MTs是一種普遍存在的一種低分子量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白，在其集團中存在兩個天然鋅（2+），在整個進化過程中高度保守。MTs分為MT1-4類，如：MT2。人類MTs基因位于染色體16q13，含有MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1X、MT2A等10個亞型的編碼區(qū)，有18亞型的多種異構(gòu)體；不同類型的細胞表達不同的MT亞型。MTs在細胞的細胞漿和細胞核中均有分布。

因此，課題組將MTs在肝癌發(fā)生與發(fā)展中的作用作為研究方向，經(jīng)多年探索，一些問題開始明朗起來。簡要介紹如下。

圖1 MT2在DEN誘導大鼠肝癌不同階段的表達

圖2 不同治法對大鼠肝癌MT2的調(diào)節(jié)作用

圖3 MTs RNAi后SMMC7721細胞增殖減緩

1 MTs對于肝癌細胞惡性增殖是必須的

采用RNAi令MTs表達后沉默，會引發(fā)細胞增殖變緩，提示SMMC7721肝癌細胞的惡性增殖依賴該基因（圖3）。

篩選并獲得了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染MTs shRNA質(zhì)粒的單克隆細胞（圖4）。該細胞增殖減緩、貼壁差（圖5），凍存后難以復蘇。再次表明MTs對于肝癌細胞惡性增殖是必須的。

2 MTs促進肝癌細胞增殖活躍

在SMMC7721細胞培養(yǎng)中，較之增殖不活躍的細胞，增殖活躍細胞的金屬硫蛋白2A（MT2A，MTs的成員之一，是SMMC7721肝癌細胞中高表達的MTs的成員）表達增加，亦提示MT2A對于肝癌細胞惡性增殖是重要的。

圖4 常規(guī)培養(yǎng)的SMMC7721肝癌細胞

圖5 轉(zhuǎn)染MTs RNAi質(zhì)粒的單克隆肝癌細胞

3 MTs具有促進肝癌細胞抵御不同應(yīng)激因子的作用

研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)不同應(yīng)激因子作用體外培養(yǎng)的肝癌細胞，會引發(fā)肝癌細胞的應(yīng)激反應(yīng)，其時MT2A表達顯著增加。表明MT2A在肝癌細胞抵御不同應(yīng)激方面均發(fā)揮著重要的作用。例如：①轉(zhuǎn)染質(zhì)粒擴增后，細胞處于轉(zhuǎn)染后應(yīng)激狀態(tài)，MT2A表達增加；②脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染應(yīng)激，可令MT2A輕度上調(diào)；③氯化鈣應(yīng)激，可令MT2A表達嚴重上調(diào)。

4 MTs對中藥有效成分也具有抵御作用

本課題組觀察了預知子種子乙醇提物、正丁醇萃取物，以及其誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的主要成分皂苷E等對體外肝癌細胞MTs的表達作用，發(fā)現(xiàn)MTs一致出現(xiàn)上調(diào)[1-3]；而非象整體實驗那樣，中藥復方令大鼠肝癌組織MTs表達下調(diào)。

5 肝癌細胞具有復雜的抵御應(yīng)激網(wǎng)絡(luò)，相互補償

當MTs敲除后，另一些抵御應(yīng)激的途徑會激活，如：膽固醇生物合成通路，以及G1到S期、G蛋白信號、炎癥反應(yīng)、糖原代謝、脂肪酸降解通路等。以上表明，肝癌細胞內(nèi)存在復雜的抵御應(yīng)激因子的網(wǎng)絡(luò)，一些分子或通路被抑制，如MTs，另一些分子或通路便會活躍，進行補償。這也是腫瘤難治的機制之一。

6 MTs還可能通過上調(diào)多基因來抵御應(yīng)激因子

表達譜芯片檢測表明，在質(zhì)粒過表達等應(yīng)激條件下，MTs過表達可能會促進核糖體蛋白、DNA復制、mRNA加工結(jié)合、細胞周期等通路基因的表達，諸如RPS10、RPS20、RPS23、RPL19、RPL31，CDC2；促進包括HSP、ATF在內(nèi)的一些抵御應(yīng)激基因的表達；以及促進包括eIF2、RPL在內(nèi)的一些參與基因翻譯基因的表達。而當MTs表達后沉默，這些通路基因的表達便會下調(diào)。

在G418誘導的細胞應(yīng)激時，MTs具有促進細胞周期、G1至S細胞周期反應(yīng)、核糖體蛋白、RNA轉(zhuǎn)錄、核受體等通路基因的表達。而當MTs表達后沉默，這些通路基因的表達量會發(fā)生下調(diào)。這些現(xiàn)象均表明，MTs還可能通過上調(diào)多基因來抵御應(yīng)激。

7 MTs確有上調(diào)核糖體蛋白等基因表達的作用

在多次的重復實驗中，當MTs表達沉默后，一些基因，如若干核糖體蛋白RPL4、RPL11、RPL12、RPL19、RPS23等會出現(xiàn)較為恒定的下調(diào)，表明MTs確有直接或間接地促進這些基因的表達作用。那么，是不是MTs通過促進這些基因的表達來實現(xiàn)促進肝癌細胞的惡性增殖呢？

8 MTs可能通過上調(diào)核糖體蛋白等基因發(fā)揮促進肝癌細胞惡性增殖的作用

本課題組采用RNAi方法，檢測RPL4、RPL11、RPL12、RPL19、RPS23等5個基因?qū)毎麗盒栽鲋车淖饔谩０l(fā)現(xiàn)當分別令這些基因表達沉默后，細胞增殖確被抑制；而且這些基因的表達沉默，或?qū)ζ渌恍┗虻谋磉_發(fā)生影響。

RPL4敲除后細胞增殖減緩，提示RPL4有助于細胞增殖（圖6）；RPL4敲除后，伴隨的是MT2A、RPL11、RPL12、RPL19、RPS23等不同程度下調(diào)，提示RPL4還有助于這些基因的表達（圖7）。

RPL11敲除后細胞增殖減緩，提示該基因有助于細胞增殖（圖8）；RPL11敲除后，伴隨的是幾乎所有基因上調(diào)（圖9）。

RPL12敲除后細胞增殖減緩，提示該基因有助于細胞增殖（圖10）；RPL12敲除后對MT2A、RPL19、RPL11、RPS23等基因的表達，沒有顯著的影響；RPL4例外（圖11）。

RPL19敲除后細胞增殖放緩，提示該基因有助于細胞增殖（圖12）；RPL19敲除后伴隨的是MT2A、RPL11下調(diào)，提示RPL19可能會促進MT2A、RPL11的表達（圖13）。

RPS23敲除后細胞增殖放緩，提示該基因有助于細胞增殖（圖14）；RPS23敲除后伴隨的是RPL11下調(diào)，其余上調(diào)；提示RPS23具有促進RPL11的表達；而抑制MT2A、RPL12、RPL19等基因的表達（圖15）。

以上研究結(jié)果表明：RPL4、RPL11、RPL12、RPL19、RPS23等基因表達確有促進腫瘤細胞惡性增殖的作用，亦即這些基因?qū)τ谀[瘤細胞惡性增殖是必須的。其中，RPL4、RPL19還顯示出對多基因具有促進其表達的作用，即還可能具有調(diào)節(jié)有關(guān)基因表達調(diào)節(jié)的作用。

9 MTs可能的復雜作用機制

圖6 RPL4表達沉默后對細胞增殖的影響

圖7 RPL4表達沉默后對有關(guān)基因表達的影響

圖8 RPL11表達沉默后對細胞增殖的影響

圖9 RPL11表達沉默后對有關(guān)基因表達的影響

圖10 RPL12表達沉默后對細胞增殖的影響

圖11 RPL12表達沉默后對有關(guān)基因表達的影響

期間，我們還不斷跟蹤國內(nèi)外有關(guān)MTs研究的進展[4-22]，觀察到：①MTs參與了細胞內(nèi)金屬穩(wěn)態(tài)和代謝，其表達改變與金屬毒性和代謝、許多疾病有關(guān)；②MTs作為鋅指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的金屬庫，在炎癥和細胞增殖等過程中起到重要作用等，負調(diào)節(jié)細胞凋亡；③大多數(shù)MT亞型的表達可以被各種物質(zhì)所誘導，例如：金屬、細胞因子和激素等。MTs基因敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)，MTs為不僅對金屬的毒性和氧化應(yīng)激具有保護作用，而且對化學和輻射致癌等因素均具有重要的保護作用；④MTs還與其它蛋白發(fā)生互作用。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，MT2與巨蛋白和相關(guān)受體相互作用，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)蛋白質(zhì)相互作用，通過與巨蛋白或/和脂蛋白受體相關(guān)蛋白受體互作用，與鐵蛋白和牛血清白蛋白相互作用。有實驗證據(jù)表明，哺乳動物MT與3種蛋白間存在互作用，而已知這3種蛋白突變結(jié)構(gòu)和故障是直接與腫瘤發(fā)生相關(guān)的：兩個轉(zhuǎn)錄因子（p53和NF-κB）和PKC μ蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導。⑤MTs在癌證增殖和耐藥性中發(fā)揮作用，并已被廣泛地作為多種腫瘤進展和耐藥性的分子標記。

圖12 RPL19表達沉默后對細胞增殖的影響

圖13 RPL19表達沉默后對有關(guān)基因表達的影響

圖14 RPS23表達沉默后對細胞增殖的影響

圖15 RPS23表達沉默后對有關(guān)基因表達的影響

10 結(jié)論和思考

在肝癌細胞處于應(yīng)激狀態(tài)時，如：各種治療、變性、修復等，MTs會表達增加，并向細胞核內(nèi)遷移，直接改變了細胞核內(nèi)離子的濃度與平衡，發(fā)揮其對基因表達的調(diào)節(jié)作用。MTs可能還通過與多基因的互作用，發(fā)揮其對基因表達的調(diào)節(jié)作用。MTs直接或間接地促進了包括核糖體蛋白在內(nèi)的多基因、多通路相關(guān)基因的表達，進而促進了肝癌細胞的惡性增殖。整體動物實驗中，中藥常用治法方藥可以不同程度地減輕和部分緩解由DEN所造成的肝毒性和損傷作用，從而使得大多肝細胞的應(yīng)激得到一定程度地緩解，MTs表達下降；而并非直接下調(diào)肝癌細胞的MTs表達。這一實驗結(jié)果還提示，在臨床肝癌的防治過程中，應(yīng)重視肝臟的保護和炎癥的控制，以杜絕其由慢性炎癥向異常增生、肝癌轉(zhuǎn)變和發(fā)展，且提高患者的生存質(zhì)量；這對改善和糾正肝癌組織周邊微環(huán)境，提高肝癌療效也是十分重要的；這也表明，中藥在肝癌綜合治療中具有十分重要的作用。

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3 任紅艷,方肇勤,梁超.預知子籽對多種肝癌細胞惡性增殖的抑制作用研究.遼寧中醫(yī)雜志,2015,42(3)：459-461,插圖I,II.

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Abstract:It is a brief review of our research on the role of metallothioneins (MTs) in the occurrence and development of hepatocellular carcinoma (Hcc) in more than a decade, and the mechanism of prevention and treatment for Hcc in the field of TCM. It was found that MTs were required for the malignant proliferation of Hcc cells and their expressions significantly increased under different levels of stress. MTs may exert their effects on promoting proliferation via increasing ribosomal protein gene or other gene expressions. The over-expressions of MTs directly altered the balance of ions in the cell nucleus, and interacted on the genes promoting malignant proliferation. Hepatotoxicity and hepatic damage caused by DEN were reduced and relieved to different extents by the representative formula or constitute, which under the common therapeutic principle, by which MTs expressions were down-regulated as well. In conclusion, both effects above are important in the liver protection, inhibition of hyperplasia and carcinogenesis.

The Role of Metallothioneins (MTs) in the Occurrence and Development of Hepatocellular Carcinoma and Mechanism Behind the Prevention and Treatment of Traditional Chinese Medicine

Fang Zhaoqin, Liang Chao, Lu Wenli, Zhang Yuanyuan, Peng Lei
(School of Basic Medical Sciences, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)

Hepatocellular carcinoma, metallothionein, gene expression, RNAi, therapy, traditional Chinese medicine

10.11842/wst.2016.12.004

R2-03

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-11-16

修回日期：2016-12-15

＊ 國家自然科學基金委面上項目（81273641）：MTs在肝癌細胞應(yīng)激反應(yīng)中的作用及不同治法調(diào)節(jié)機制的研究，負責人：方肇勤；國家自然科學基金委面上項目（30973703）：若干中醫(yī)治法下調(diào)基因沉默后肝癌細胞動力學基因表達譜分析，負責人：方肇勤；國家自然科學基金委面上項目（30672574）：采用RNAi檢測若干與中醫(yī)治法相關(guān)肝癌高表達新基因的作用，負責人：方肇勤；國家自然科學基金委面上項目（30271576）：不同治法對大鼠肝癌后基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控的進一步研究，負責人：方肇勤。

＊＊ 通訊作者：方肇勤，教授，博士生導師，主要研究方向：中醫(yī)證候與辨證論治基礎(chǔ)研究。