Medpor自體組織化生物相容性研究

盛 陽(yáng)，樊東力

Medpor自體組織化生物相容性研究

盛 陽(yáng)，樊東力

目的觀察Medpor自體組織化后生物相容性的變化。方法 將Medpor補(bǔ)片植入SD大鼠腹部皮下進(jìn)行自體組織化，4 w后將自體組織化Medpor補(bǔ)片取出備用，按隨機(jī)原則在背部左、右側(cè)分別植入自體組織化Medpor補(bǔ)片或普通Medpor補(bǔ)片。20處植入自體組織化Medpor補(bǔ)片為A組，20處植入普通Medpor補(bǔ)片為B組。植入2 w后取出補(bǔ)片，行石蠟包埋、切片、HE染色、CD31免疫組化染色及Masson染色，進(jìn)行生物相容性的評(píng)價(jià)。結(jié)果HE染色、Masson染色觀察結(jié)果顯示，A組組織長(zhǎng)入充滿補(bǔ)片孔隙，B組組織長(zhǎng)入深度約為補(bǔ)片33%；CD31免疫組化染色結(jié)果顯示，植入后2 w，實(shí)驗(yàn)組的微血管密度計(jì)數(shù)顯著大于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論Medpor補(bǔ)片自體組織化后再次植入機(jī)體靶向部位，可在較短時(shí)間內(nèi)與機(jī)體組織建立緊密聯(lián)系，融合能力較普通Medpor補(bǔ)片強(qiáng)，對(duì)于早期血管化有一定的作用，提高了Medpor補(bǔ)片在血供缺乏部位的生物相容性。

Medpor補(bǔ)片；自體組織化；生物相容性；大鼠

耳廓再造的方法是一期植入擴(kuò)張器，二期于術(shù)中放入支架，利用耳部擴(kuò)張的皮膚覆蓋完成耳廓再造。目前使用肋軟骨作為支架為臨床上較廣泛使用的技術(shù)[1]。但手術(shù)會(huì)在供區(qū)產(chǎn)生永久性缺陷[2]，且移植軟骨有被吸收和變形的可能。因此，生物材料被考慮作為支架用于耳廓再造，Medpor就是其中較好的一種。但該材料仍存在一定問(wèn)題，如耳部組織皮膚薄、血供差，不利于支架快速血管化[3]，增加了支架外露、感染的可能性。

Medpor補(bǔ)片具有相互交通的特殊孔結(jié)構(gòu)[4]，這種多孔特性允許血管、軟組織長(zhǎng)入，可減少感染發(fā)生率，提高材料與組織結(jié)合的強(qiáng)度[5]。新生血管長(zhǎng)入支架孔隙，可降低支架外露、感染等并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)。因此，快速和足夠的血管化是支架植入成功的必不可少的條件[6]。因此，本研究構(gòu)建自體組織化Medpor補(bǔ)片模型，再移植到靶向部位，應(yīng)用HE、Masson染色以及CD31免疫組織化學(xué)染色，觀察自體組織化材料的相關(guān)組織學(xué)變化，評(píng)價(jià)其生物相容性，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性成年SD大鼠20只，體質(zhì)量200～250 g，由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，并統(tǒng)一進(jìn)行三級(jí)飼養(yǎng)。動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK-（軍）2012-0013，SCXK（渝）2012-0005。

1.2 主要材料 Medpor補(bǔ)片(POREX公司，美國(guó))；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（武漢博士德生物有限公司，中國(guó)）；Masson染色試劑（福建邁新生物有限公司，中國(guó)）；CD31抗體（ab119339，abcam，英國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 Medpor補(bǔ)片自體組織化 將20只SD大鼠以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定，腹部備皮，消毒鋪巾，于腹部正中作約1 cm長(zhǎng)切口，逐層分離，形成約3 cm×3 cm大小囊腔。將消毒備用Medpor補(bǔ)片（10 mm×10 mm×0.85 mm）植入囊腔，縫合、消毒，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3.2 對(duì)照實(shí)驗(yàn) 補(bǔ)片植入腹部4 w后，20只大鼠全身麻醉，腹、背部備皮，消毒鋪巾，從大鼠腹部取出20塊自體組織化Medpor補(bǔ)片放入PBS液中備用。背部消毒鋪巾，在脊柱兩側(cè)2 cm處皮膚各作一長(zhǎng)約1 cm切口，按隨機(jī)原則在背部左、右側(cè)分別植入自體組織化Medpor補(bǔ)片或普通Medpor補(bǔ)片，縫合傷口、消毒包扎。20處植入自體組織化Medpor補(bǔ)片為A組，20處植入普通Medpor補(bǔ)片為B組。

1.3.3 標(biāo)本取材及處理 對(duì)照實(shí)驗(yàn)2 w后，取出補(bǔ)片及周?chē)s1 mm范圍的皮下組織，進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色、Masson染色、免疫組化（CD31）染色。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 組織形態(tài)學(xué)觀察 將取出補(bǔ)片及周?chē)M織，行石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察相關(guān)組織學(xué)變化。

1.4.2 纖維化及膠原沉積 切片行Masson染色，光鏡下觀察補(bǔ)片及周?chē)M織纖維化及膠原沉積情況。

1.4.3 微血管密度 將切片免疫組織化學(xué)(CD31)染色后，光鏡下觀察孔隙內(nèi)纖維化程度及微血管密度，血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后出現(xiàn)棕黃色顆粒定性為陽(yáng)性著色。微血管密度判定標(biāo)準(zhǔn)：在50倍光鏡下找到血管密度較為集中的區(qū)域；于100倍光鏡下進(jìn)行微血管數(shù)目計(jì)數(shù)，含有紅細(xì)胞的血管計(jì)為1個(gè)，取5個(gè)高倍視野下的微血管計(jì)算平均值，即為血管密度計(jì)數(shù)(microvessel density，MVD)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料行正態(tài)性檢驗(yàn)，當(dāng)不滿足時(shí)，行對(duì)數(shù)正態(tài)變換，統(tǒng)計(jì)描述用x±s表示，組間比較用成組t檢驗(yàn)，假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 兩組大鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好，傷口均未見(jiàn)異常。肉眼觀察，A組Medpor補(bǔ)片與周?chē)M織結(jié)合緊密牢固，外周可見(jiàn)致密透明纖維囊，表面有較多新生血管，內(nèi)部可見(jiàn)大量組織長(zhǎng)入；B組Medpor補(bǔ)片周?chē)梢?jiàn)透明致密膜形成，表面有微血管血管生成，內(nèi)部有部分組織長(zhǎng)入。

2.2 HE染色觀察 A組鏡下觀察可見(jiàn)組織長(zhǎng)入充滿補(bǔ)片孔隙(圖1A)，補(bǔ)片外表面出現(xiàn)密集的纖維血管組織，其中含有較豐富的新生血管(圖1B)；B組組織長(zhǎng)入深度約為補(bǔ)片1/3(圖1C)，補(bǔ)片外表面可見(jiàn)較為稀疏的纖維組織，其中新生血管較少((圖1D)。兩組補(bǔ)片外周均可見(jiàn)成纖維細(xì)胞層，由于邊緣刺激，成纖維細(xì)胞層在補(bǔ)片邊緣略有增加。無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)跡象。

圖1 植入2 w后，鏡下觀察組織長(zhǎng)入及補(bǔ)片外表面新生血管情況（HE ×50和×100）

2.3 CD31免疫組化染色觀察 A組補(bǔ)片周?chē)蔆D31陽(yáng)性染色的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量顯著增多，且分布較為均勻（圖2A）；B組補(bǔ)片周?chē)鶦D31陽(yáng)性染色的血管內(nèi)皮細(xì)胞略有增加，纖維組織淡染呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖2B）。

2.4 Masson染色觀察 兩組補(bǔ)片外表面均有纖維囊包裹，膠原蛋白沉積于細(xì)胞層外。纖維血管組織由外表面向補(bǔ)片中心生長(zhǎng)。A組組織填滿補(bǔ)片孔隙內(nèi)部（圖3A）;B組組織細(xì)胞浸潤(rùn)深度約為補(bǔ)片1/3（圖3B）。

2.5 微血管密度 植入后2 w，實(shí)驗(yàn)組的微血管密度計(jì)數(shù)（7.10±1.85）顯著大于對(duì)照組(3.10±0.74)（t= 3.7862，P<0.01）。

3 討論

耳廓再造的方法是一期植入擴(kuò)張器，二期于術(shù)中放入支架，再利用耳部擴(kuò)張的皮膚作為覆蓋物完成耳廓再造。因肋軟骨屬自體組織，不發(fā)生排斥反應(yīng)，故仍為目前最經(jīng)典和廣泛使用的支架。但這種手術(shù)方式也有諸多缺陷，如供區(qū)在術(shù)后產(chǎn)生永久性缺陷，可能發(fā)生軟骨吸收、扭曲變形等。

圖2 植入2 w后，CD31陽(yáng)性染色的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量（免疫組織化學(xué)染色 ×100）

圖3 植入2 w后，組織長(zhǎng)入及微血管情況（Masson染色 ×50）

Medpor補(bǔ)片已成功地應(yīng)用于各種面部骨骼的重建和改善。它的優(yōu)點(diǎn)是：（1）具有良好生物相容性，其特殊孔型結(jié)構(gòu)允許血管、軟組織長(zhǎng)入，減少感染發(fā)生率，提高材料與組織的結(jié)合強(qiáng)度；（2）具有較好硬度的同時(shí)兼顧了可塑性，易于雕刻，再造耳廓外形逼真；（3）不吸收，長(zhǎng)期結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。在耳再造術(shù)中，快速和足夠的血管化是支架植入成功的必不可少的條件，然而，耳部覆蓋組織薄，血供較差，不利于快速血管化，易導(dǎo)致支架植入失敗。因此，改善支架早期血管化是現(xiàn)階段研究的重點(diǎn)。

目前改善生物支架血管化方法有多種，如將特定的生長(zhǎng)因子或特定細(xì)胞涂抹于支架表面。在重建顯微外科中發(fā)展出預(yù)制的方法，在此方法中，支架被植入比缺陷位置更能促進(jìn)新生血管生成的 “供區(qū)”組織。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間預(yù)植后，擁有廣泛血管網(wǎng)絡(luò)的支架將會(huì)被轉(zhuǎn)移到“受區(qū)”組織[7]。由于自體細(xì)胞將材料自體組織化，可避免產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)將Medpor補(bǔ)片預(yù)先埋植于大鼠皮下，構(gòu)建自體組織化Medpor模型，取出后移植到靶向部位。隨后應(yīng)用HE、Masson染色以及CD31免疫組織化學(xué)染色，通過(guò)組織學(xué)分析，觀察自體組織化的血管化效果，評(píng)價(jià)其生物相容性。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)，Medpor補(bǔ)片植入后1 w，組織長(zhǎng)入深度約為0.1 mm，2 w時(shí)為0.6 mm，4 w時(shí)組織充滿材料孔隙，達(dá)到實(shí)驗(yàn)中所需的充分組織化要求。故本實(shí)驗(yàn)Medpor補(bǔ)片自體組織化時(shí)間為4 w。血管生成是由血管生成誘導(dǎo)因子和抑制因子共同介導(dǎo)的一個(gè)多細(xì)胞參與的多步驟過(guò)程。CD31在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)，而在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中則不然。CD31已被證實(shí)為敏感的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記，是血管生成的一個(gè)較為敏感的指標(biāo)。免疫組化研究使用這些指標(biāo)來(lái)比較植入物內(nèi)血管生成情況。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A組Medpor補(bǔ)片與周?chē)M織結(jié)合緊密牢固，內(nèi)部可見(jiàn)大量組織長(zhǎng)入，表面纖維組織含有較豐富的新生血管；B組Medpor補(bǔ)片表面纖維組織稀疏，新生血管較少。免疫組化研究結(jié)果顯示，A組MVD值顯著大于B組。表明自體組織化Medpor補(bǔ)片植入靶向部位2 w后即可與機(jī)體組織建立緊密聯(lián)系，融合能力較普通Medpor補(bǔ)片強(qiáng)，生物相容性好。

本實(shí)驗(yàn)所采用的自體組織化方法簡(jiǎn)便易行，可操作性強(qiáng)，便于臨床推廣，手術(shù)效果佳，但需要二次手術(shù)，存在相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，且成本偏高，手術(shù)周期長(zhǎng)。在整形外科耳廓再造術(shù)中，患者預(yù)先埋入擴(kuò)張器，如同時(shí)進(jìn)行支架自體組織化，可能會(huì)減少二期手術(shù)后由于組織薄血供差，支架出現(xiàn)外露、感染、移位的情況?？偟膩?lái)說(shuō)，材料自體組織化的方法對(duì)臨床工作具有參考意義，但具體細(xì)節(jié)尚需進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

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Establishment and biocompatibility of ectopic prefabricated vascularized porous polyethylene(Medpor)

Sheng Yang,Fan Dongli Department of Plastic and Cosmetic Surgery,Xinqiao Hospital of the Third Military Medical University, Chongqing,400037,China

ObjectiveTo observe the changes in the biocompatibility of ectopic prefabricated vascularized porous polyethylene (Medpor).MethodsMedpor patches were randomly implanted into the abdomen of 20 rats subcutaneously for the establishment of ectopic prefabricated vascularization.Four weeks later,Medpor patches with ectopic prefabricated vascularization were taken out.Those Medpor patches or ordinary Medpor patches were randomly implanted into the right or left side of the back.The 20 sides implanted with ectopic prefabricated vascularized Medpor patches were group A,and the other 20 sides implanted with normal Medpor patches were group B.Two weeks after the implantation,the patches were taken out and received paraffin imbedding,slicing,HE staining,CD31 immunohistochemical staining,and Masson staining.The biocompatibility was evaluated.ResultsHE and Masson staining results demonstrated that group B showed partial fibrovascularization extended toward the center of the implants(33%),while group A showed fibrovascularization extended to the center of the implants(100%).The CD31 immunohistochemical staining showed two weeks after the implantation,the microvessel density of group B was significantly less than that of group A (P＜0.05).ConclusionConnection between porous polyethylene (Medpor)and surrounding tissues can be established quickly after ectopic prefabricated vascularization. Ectopic prefabricated vascularized Medpor can increase the biocompatibility of the parts where blood supply is weak.

Medpor;ectopic prefabricated vascularization;biocompatibility;rat

R 318/617

A

1004-0188（2016）04-0367-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.04.007

2016-01-24）

400037重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院整形美容科