鐵皮石斛多糖提取工藝優(yōu)化研究

吳 迪，蔡成崗,2,3，沙如意,2,3

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310023)

鐵皮石斛多糖提取工藝優(yōu)化研究

吳 迪1，蔡成崗1,2,3，沙如意1,2,3

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310023)

多糖為鐵皮石斛中的主要有效成分，高效浸出有利于其進(jìn)一步利用。以水為溶劑，對影響鐵皮石斛多糖提取的時(shí)間、溫度及料液質(zhì)量比等因素進(jìn)行了優(yōu)化研究，并應(yīng)用苯酚-硫酸法和DNS法考察了鐵皮石斛提取液總糖和單糖的提取率，多糖提取率由兩者之差計(jì)算得出。單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，料液質(zhì)量比1∶120、浸提溫度70 ℃、浸提時(shí)間90 min時(shí)提取鐵皮石斛多糖效果最好，在此工藝條件下，鐵皮石斛多糖提取率為55.2%。

鐵皮石斛；多糖;提取工藝；單因素實(shí)驗(yàn)；正交實(shí)驗(yàn)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是中國傳統(tǒng)名貴中藥，歷代古籍醫(yī)書均有記載。《本草綱目》載：“俗方最以補(bǔ)虛，主治傷中，除痹下氣，補(bǔ)五臟虛勞贏瘦，強(qiáng)陰益精；厚腸胃，補(bǔ)內(nèi)絕不足，逐皮膚邪熱瘁氣，治男子腰腳軟弱，健陽，補(bǔ)腎益力，壯筋骨，暖水臟，輕身延年等”；《本昌思辨錄》認(rèn)為,石斛，為腎藥，為肺藥，為腸胃藥[1]。鐵皮石斛具養(yǎng)胃生津、潤肺止咳、滋陰清熱、清音明目之功效，含有多糖、生物堿、菲類、聯(lián)芐類、芴酮化合物、糖苷類、氨基酸等藥理成分[2-8]。多糖作為鐵皮石斛的主要有效成分，藥理作用包括增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、抗氧化、抗衰老、降血糖、養(yǎng)陰生津和抑制腫瘤等[9-15]。

近年來，鐵皮石斛人工栽培面積逐步擴(kuò)大，受到廣泛的關(guān)注。其藥用主要成分多糖的提取對于鐵皮石斛的高效利用和產(chǎn)品開發(fā)具有重要意義。目前，國內(nèi)有研究人員針對鐵皮石斛多糖采用水法提取[16]、酶法提取[17-19]、超聲波提取[20]等，其中酶法及超聲提取法較直接水提法效果更好，多糖質(zhì)量濃度因鐵皮石斛采收季節(jié)及生長年份不同而存在一定的差異；在提取實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，采用正交實(shí)驗(yàn)[21]和響應(yīng)面分析[16，19]等設(shè)計(jì)方法，獲得了較佳的提取工藝。因鐵皮石斛主要在中國栽培，國外對其研究報(bào)道較少。鑒于目前鐵皮石斛多糖提取工藝條件存在一定的差異，本研究為探討鐵皮石斛中多糖的質(zhì)量濃度，采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)方法對鐵皮石斛多糖進(jìn)行了提取的工藝優(yōu)化研究，以期為掌握鐵皮石斛中多糖的質(zhì)量濃度并為后續(xù)多糖的構(gòu)效關(guān)系等研究提供一定的參考。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鐵皮石斛，購自市場，為3年生鐵皮石斛鮮條。葡萄糖、濃硫酸、苯酚、酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、亞硫酸氫鈉等均為分析純，購自華東醫(yī)藥股份有限公司器材化劑分公司；水為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

水浴鍋，江蘇金壇良友實(shí)驗(yàn)儀器廠；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國希格瑪(SIGMA)公司；粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)(UV-5500PC)，上海元析儀器有限公司；電子天平(PL303)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 提取工藝

石斛鮮條→切碎→60 ℃烘干→磨粉→過篩→稱樣→水浴提取→定容→離心→上清液備用→糖質(zhì)量濃度測定。

1.4 糖濃度測定

單糖質(zhì)量濃度測定采用DNS法[22](3,5-二硝基水楊酸比色法)，總糖質(zhì)量濃度測定采用苯酚-硫酸法[23]，多糖提取率以總糖提取率減去單糖提取率進(jìn)行計(jì)算。

1.4.1 DNS法

分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于25 mL試管中，分別準(zhǔn)確加入DNS試劑2 mL，沸水浴加熱2 min，流水冷卻，用水補(bǔ)足到25 mL，在540 nm波長下測定吸光度值，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立方程。

1.4.2 苯酚硫酸法

分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，各以水補(bǔ)至2.0 mL，然后先后加入1.0 mL苯酚(5%質(zhì)量濃度)和5.0 mL濃硫酸，混合后靜置10 min，搖勻并于室溫下放置20 min，于490 nm下測定吸光度值，空白實(shí)驗(yàn)以1.0 mL水代替樣品進(jìn)行，并繪制吸光度為縱坐標(biāo)、葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。

1.5 單因素實(shí)驗(yàn)

1.5.1 料液質(zhì)量比的確定

精密稱取0.2 g鐵皮石斛粉末，在浸提溫度60 ℃、浸提時(shí)間90 min條件下，研究1∶90、1∶120和1∶150料液質(zhì)量比對提取效果的影響。

1.5.2 浸提溫度的確定

精密稱取0.2 g鐵皮石斛粉末，在最佳料液質(zhì)量比條件下，以蒸餾水為溶劑，在50、70、90 ℃溫度下浸提90 min，測定提取效果。

1.5.3 浸提時(shí)間的確定

精密稱取0.2 g鐵皮石斛粉末，在最佳料液質(zhì)量比和浸提溫度條件下，以蒸餾水為溶劑，研究浸提時(shí)間60、90、120 min對鐵皮石斛多糖提取效果的影響。

1.6 正交實(shí)驗(yàn)

以單因素實(shí)驗(yàn)得出的最佳料液質(zhì)量比、浸提溫度和浸提時(shí)間為中心點(diǎn)，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，因素和水平如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

水平料液質(zhì)量比A浸提溫度/℃B浸提時(shí)間/minC11∶90506021∶120709031∶15090120

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1 DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線

DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.742x+ 0.015(R2=0.998，R為相關(guān)系數(shù))，該線性方程說明在圖1所示的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.1.2 苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.876x+0.027(R2=0.997)，該線性方程說明在圖2所示的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

圖1 DNS法測定還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for reducing carbohydrate analysis by DNS method

圖2 苯酚-硫酸法測定總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for total carbohydrate analysis by phonel-sulfate method

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 料液質(zhì)量比對鐵皮石斛多糖提取率的影響

選擇料液質(zhì)量比1∶90，1∶120，1∶150三個(gè)水平，考查不同料液質(zhì)量比對鐵皮石斛多糖提取率的影響，將所有提取液定容至250 mL后離心，多糖提取率用百分?jǐn)?shù)表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 料液質(zhì)量比對提取效果的影響Table 2 Effects of substrate and liquid ratio on extraction results

由表2可見，料液質(zhì)量比的增加會(huì)增加鐵皮石斛多糖的溶出量。當(dāng)料液質(zhì)量比為1∶120時(shí)，總糖提取率和單糖提取率均最高，多糖提取率也達(dá)到最高值51.3%。由此結(jié)果可知，料液質(zhì)量比為1∶120時(shí)提取效果最好。

2.2.2 浸提溫度對鐵皮石斛多糖提取率的影響

選擇浸提溫度50、70、90 ℃三個(gè)水平，考查不同浸提溫度對鐵皮石斛多糖提取率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 浸提溫度對提取效果的影響Table 3 Effects of temperature on extraction results

由表3可知，浸提效果隨著溫度升高呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，當(dāng)浸提溫度為70 ℃時(shí)，鐵皮石斛總糖提取率和單糖提取率均最高，多糖提取率也達(dá)到最高值54.8%。但隨著溫度的升高，多糖的提取率卻有所下降，故浸提溫度為70 ℃時(shí)鐵皮石斛多糖提取效果最好。

2.2.3 浸提時(shí)間對鐵皮石斛多糖提取率的影響

浸提時(shí)間選擇60、90、120 min三個(gè)水平，考查不同浸提時(shí)間對鐵皮石斛多糖提取率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 浸提時(shí)間對提取效果的影響Table 4 Effects of time on extraction results

由表4可見,浸提時(shí)間的增加會(huì)增加多糖的溶出量，但并不是浸提時(shí)間越長，提取效果越好，當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到120 min時(shí)，鐵皮石斛多糖提取率反而降低，僅34.6%。當(dāng)浸提時(shí)間為90 min時(shí)，鐵皮石斛總糖提取率和單糖提取率均最高，多糖提取率也達(dá)到最高值52.7%。故浸提時(shí)間初步定為90 min。

2.3 鐵皮石斛多糖提取的最佳工藝條件

本研究以鐵皮石斛多糖為指標(biāo)，以單因素實(shí)驗(yàn)中獲得的最適提取條件為基礎(chǔ)，再以正交實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)中以水為提取溶劑，確定料液質(zhì)量比、浸提時(shí)間和浸提溫度對提取效果的影響。取鐵皮石斛粉末0.2 g，按照設(shè)定的方法提取后定容至250 mL并離心，測定總糖和單糖的提取率，以兩者之差作為多糖提取率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Table 5 Results of orthogonal experiment

實(shí)驗(yàn)號(hào)ABC總糖提取率/%單糖提取率/%多糖提取率/%111176．037．138．9212277．836．641．2313374．832．742．1421284．534．350．2522390．040．050．0623187．838．249．6731374．634．939．7832187．848．938．9933273．941．542．4K1j122．2128．8127．4K2j149．8134．1133．8K3j120．9130．0131．7K1j/340．742．942．5K2j/349．944．744．6K3j/340．343．343．9極差R9．200．422．12最佳組合A2C2B2

由正交實(shí)驗(yàn)極差分析可知，因素主次順序?yàn)锳、C和B，影響結(jié)果的因素依次為料液質(zhì)量比、浸提時(shí)間和浸提溫度。最佳組合是A2C2B2，即提取工藝參數(shù)料液質(zhì)量比為1∶120，浸提溫度為70 ℃，浸提時(shí)間為90 min(圖3)。按照正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，鐵皮石斛多糖得率為55.2%。

3 結(jié) 語

圖3 因素、水平對多糖提取效果的影響Fig.3 Effects of factors and levels on extraction results of polysaccharide

鐵皮石斛作為名貴中藥材具有多種功能，多糖為其主要有效成分。目前，研究人員采用水法、酶法和超聲波提取等手段進(jìn)行了提取工藝研究，結(jié)果存在一定的差異。本研究采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)的方法對鐵皮石斛多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有利于獲得選定的各個(gè)因素對提取效果的影響。在此基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察各個(gè)因素之間的相互作用。單因素和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明，料液質(zhì)量比1∶120，浸提溫度70 ℃，提取時(shí)間90 min時(shí)多糖提取效果最好。單因素和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，可能是因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中選擇的各因素水平之間差值較大，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以將各因素的水平值進(jìn)一步細(xì)化。正交實(shí)驗(yàn)還說明，對鐵皮石斛中多糖提取效果影響的因素大小依次為料液質(zhì)量比、浸提時(shí)間和浸提溫度，在最佳條件下鐵皮石斛多糖提取率為55.2%。后續(xù)研究需要在確定鐵皮石斛原料、水分含量的基礎(chǔ)上，結(jié)合其他輔助提取手段，進(jìn)一步對最佳提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上開展鐵皮石斛多糖的分離和結(jié)構(gòu)分析等方面的繼續(xù)研究工作，以便為鐵皮石斛的綜合利用和精深加工尋找科學(xué)依據(jù)。

[1] 國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典：一部[S]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：265．

[2] 黃民權(quán)，阮金月．6種石斛屬植物水溶性多糖的單糖組分分析[J]．中國中醫(yī)藥雜志，1997，22(2)：74．

[3] 楊虹，王順春，王崢濤，等．鐵皮石斛多糖的研究[J]．中國藥學(xué)雜志，2004，39(4)：254．

[4] 董群，方積年．多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用[J]．中國藥學(xué)雜志，2001，36(10)：649．

[5] FRNAZ G. Polysaecharides in pharmacy: current applications and future concepts[J]. Plant Medical, 1989, 55(6): 493.

[6] XIANG L, STEPHEN SZE C W, NG T B, et al. Polysaccharides ofDendrobiumofficinaleinhibit TNF-alpha-induced apoptosis in A-253 cell line[J]. Inflammation Research, 2013, 62(3):313.

[7] 何鐵光，楊麗濤，李楊瑞，等．鐵皮石斛原球莖多糖DCPPla-1的理化性質(zhì)及抗腫瘤活性[J]．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007，19(4)：578．

[8] 蔣玉蘭，羅建平．藥用石斛多糖藥理活性及化學(xué)結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展[J]．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22(12)：2986．

[9] 何鐵光，楊麗濤，李楊瑞，等．鐵皮石斛原球莖多糖DCPP3c-1的分離純化及結(jié)構(gòu)初步分析[J]．分析測試學(xué)報(bào)，2008，27(2)：143．

[10] 羅慧玲，蔡體育，陳巧倫，等．石斛多糖增強(qiáng)臍帶血和腫瘤病人外周血LAK細(xì)胞體外殺傷作用的研究[J]．癌癥，2000，19(12)：1124．

[11] 張紅玉，戴關(guān)海，馬翠，等．鐵皮石斛多糖對S180肉瘤小鼠免疫調(diào)節(jié)功能的影響[J]．浙江中醫(yī)雜志，2009，44(5)：380．

[12] 李欽，陳愛君，張信岳．鐵皮石斛顆粒增強(qiáng)免疫功能作用研究[J]．中藥藥理與臨床，2008，24(1)：53．

[13] 張中建，閻小偉．鐵皮石斛制劑免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]．食品研究與開發(fā)，2004，25(2)：34．

[14] 夏春東，廖學(xué)才，李守良，等．石斛藥用概述[J]．實(shí)用中醫(yī)藥雜志，1998，14(4)：45．

[15] 郭勇，程曉磊．石斛在惡性腫瘤治療中的作用[J]．浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，17(7)：454．

[16] 黃曉君，聶少平，王玉婷，等．鐵皮石斛多糖提取工藝優(yōu)化及其成分分析[J]．食品科學(xué)，2013，34(22)：21．

[17] 尚喜雨．水提法·酶法提取鐵皮石斛多糖的比較研究[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(18)：9787．

[18] 張利，范明才，馮喜文，等．鐵皮石斛中石斛多糖與石斛堿的纖維素酶法提取研究[J]．化學(xué)研究與應(yīng)用，2011，23(3)：356．

[19] 胡建楣，李靜玲，馮鵬，等．Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化鐵皮石斛中多糖復(fù)合酶法提取工藝[J]．中藥材，2014，37(1)：130．

[20] 葉余原．超聲法提取鐵皮石斛多糖工藝的研究[J]．中藥材，2009，32(4)：617．

[21] 王培培，魯芹飛，陳建南，等．正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化鐵皮石斛多糖的提取工藝[J]．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2012，23(11)：2781．

[22] 張媛媛，張彬．苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法測定綠茶茶多糖的比較研究[J]．食品科學(xué)，2016，37(4)：158．

[23] 趙凱，許鵬舉，谷廣燁．3，5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量的研究[J]．食品科學(xué)，2008，29(8)：534．

Optimization of polysaccharide extraction conditions ofDendrobiumofficinaleKimura et Migo

WU Di1, CAI Chenggang1,2,3, SHA Ruyi1,2,3
(1.School of Biological and Chemical Engineering, Zhejiang University of Science and Technology,Hangzhou 310023, China;2.Zhejiang Provincial Key Laboratory for Chemical and Biological Processing Technology of Farm Produce, Hangzhou 310023, China; 3.Zhejiang Collaborative Innovation Center of Chemical and Biological Manufacturing for Agricultural Biological Resources, Hangzhou 310023, China)

Polysaccharide is the most important functional ingredient inDendrobiumofficinaleKimura et Migo, and it is important to extract the polysaccharides efficiently for the utilization ofD.officinaleKimura et Migo. The extraction conditions such as extraction time, extraction temperature and the ratio of substrate to extraction solution of polysaccharide fromD.officinaleKimura et Migo by water using single factor and orthogonal experiments were optimized.The extraction ratio of polysaccharide was calculated by subtract between the total polysaccharide and monosaccharide, which were analyzed by phenol sulfuric acid method and DNS method, respectively.The single factor experiments results showed that the ratio of substrate to water of 1∶120, extraction temperature of 70 ℃ and extraction time of 90 min are the optimal conditions, which are also of the optimal extraction conditions of orthogonal experiments. The identified experiments showed that under the optimal conditions the maximal extraction quantity is of 55.2%.

DendrobiumofficinaleKimura et Migo; polysaccharide; extraction technology; single factor experiment; orthogonal experiment

10.3969/j.issn.1671-8798.2016.06.006

2016-10-22

國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201611057014)；浙江科技學(xué)院科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(702103E03)

吳 迪(1994— )，男，浙江省湖州人，2014級(jí)生物工程專業(yè)本科生。

蔡成崗，副教授，博士，主要從事食品生物技術(shù)研究。

R284.2

A

1671-8798(2016)06-0444-06