蝦夷扇貝外套膜膠原蛋白的提取與表征

吳 忠,劉俊榮,田元勇,張 龍,劉金洋

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連116023)

蝦夷扇貝外套膜膠原蛋白的提取與表征

吳 忠,劉俊榮,田元勇,張 龍,劉金洋

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連116023)

為探索蝦夷扇貝Patinopecten yessoensis加工副產(chǎn)物的高附加值利用,從副產(chǎn)物外套膜中提取經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的膠原蛋白,并對(duì)其理化性質(zhì)(分子量、溶解性、黏度、紫外吸收、氨基酸組成)和結(jié)構(gòu)特性(圓二色譜、傅里葉紅外光譜)進(jìn)行研究。結(jié)果表明:外套膜干基中膠原蛋白含量為13.16％;外套膜膠原蛋白分子主要由α亞基和少量的β、γ亞基組成,外套膜膠原蛋白為典型的Ⅰ型膠原;酸溶性膠原蛋白(ASC)和酶溶性膠原蛋白(PSC)均富含甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸;膠原蛋白的變性溫度約為20℃,與其他物種有所差異;PSC的溶解度高于ASC,二者的等電點(diǎn)均在pH為4左右,且二者的鹽溶性變化趨勢相似;紅外光譜表明,PSC和ASC二級(jí)結(jié)構(gòu)間有細(xì)微差異,但胃蛋白酶沒有影響膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu);圓二色譜顯示,ASC的三級(jí)結(jié)構(gòu)比PSC的更加穩(wěn)定,溫度升高會(huì)影響二者的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

蝦夷扇貝;外套膜;理化特性;膠原蛋白

蝦夷扇貝Patinopecten yessoensis隸屬于軟體動(dòng)物門Mollusca、雙殼綱Lamelli branchia、鶯蛤目Pterioida、扇貝科Pectinidae,原產(chǎn)于日本、俄羅斯和朝鮮等海域,為冷水性貝類,現(xiàn)今蝦夷扇貝已成為中國重要的高值經(jīng)濟(jì)貝類養(yǎng)殖品種。

在蝦夷扇貝的加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量副產(chǎn)物,目前,對(duì)這些副產(chǎn)物的利用仍然是困擾行業(yè)發(fā)展的問題之一。外套膜作為主要的副產(chǎn)物,富含蛋白質(zhì),具有較高的開發(fā)價(jià)值。當(dāng)前,國內(nèi)對(duì)外套膜的研究主要集中于開發(fā)發(fā)酵制品[1]、調(diào)味料[2]、生物活性物質(zhì)[3]、水解多肽制品[4]等方面,而對(duì)于外套膜中較為豐富的膠原蛋白的研究則較少,僅劉聰?shù)萚5]研究了外套膜膠原蛋白的酶解物清除超氧陰離子能力。國外對(duì)蝦夷扇貝外套膜膠原蛋白的研究中,Shen等[6]研究了日本產(chǎn)蝦夷扇貝外套膜膠原蛋白分子的分布;Choi等[7]研究了韓國產(chǎn)蝦夷扇貝外套膜膠原蛋白的理化性質(zhì);Mizuta等[8]研究了日本產(chǎn)蝦夷扇貝外套膜膠原蛋白的含量、組織分布和熱變性規(guī)律。國內(nèi)至今對(duì)養(yǎng)殖蝦夷扇貝外套膜膠原蛋白的研究還較為欠缺,為此,本研究中對(duì)蝦夷扇貝外套膜中的膠原蛋白進(jìn)行了探究,以期為蝦夷扇貝外套膜的高附加值利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用活品蝦夷扇貝購于大連市長興水產(chǎn)品交易市場,原料產(chǎn)于春季大連市獐子島海域,運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室后取外套膜,用冰水沖洗后瀝干,切碎備用。

1.2 方法

1.2.1 膠原蛋白含量測定 結(jié)合GB/T 9695.23—2008/ISO 3496:1994和Mizuta等[9]的方法并略做調(diào)整后進(jìn)行試驗(yàn)。

(1)羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。稱取50 mg羥脯氨酸于100 mL容量瓶中,用水溶解后加入一滴3 mol/L H2SO4,用水定容并于4℃下貯存。取上述溶液5.0 mL定容至500 mL,分別吸取該溶液10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mL于100 mL容量瓶中用水定容,所得標(biāo)準(zhǔn)溶液中羥脯氨酸濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μg/mL,現(xiàn)用現(xiàn)配。取4mL上述溶液于比色管中,加入2mL氯氨T試劑,混合后放置20 min,再加入2.0 mL對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色劑,并于60℃下水浴20 min,取出比色管,用流動(dòng)水冷卻并在室溫下放置30 min,而后采用721分光光度計(jì)于558 nm處測定吸光值。羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for hydroxyproline(Low ry method)

(2)樣品的測定。取100 g閉殼肌與100 g外套膜分別絞混均勻,取4 g樣品置于100 mL錐形瓶中,而后加入30 mL 3 mol/L H2SO4,置于130℃烘箱中消化3.5 h,趁熱過濾,采用10 mL 3 mol/L H2SO4洗脫至250 mL容量瓶中后定容,重復(fù)以上操作。測得的羥脯氨酸含量乘以換算系數(shù)10.23[10],即為膠原蛋白含量。

1.2.2 外套膜膠原蛋白的提取 采用Shen等[6]的方法并做調(diào)整。取20 g外套膜加入20倍體積的0.1 mol/LNaOH,攪拌過夜,而后以10 000g離心20 min,取沉淀,此堿洗步驟重復(fù)3次,以脫除非膠原蛋白組分和膠原蛋白酶。所得沉淀用蒸餾水洗至中性,采用10倍體積的0.5 mol/L乙酸攪拌溶解2 d,以12 000g離心20 min,所得上清液加入NaCl至終濃度為0.7 mol/L,使膠原蛋白鹽析,沉淀即為酸溶性膠原蛋白(ASC),將ASC采用適量0.5 mol/L乙酸復(fù)溶后透析完全,而后凍干。

在ASC提取后的殘余沉淀中加入豬胃蛋白酶以提取酶溶性膠原蛋白(PSC),酶與底物質(zhì)量比為1∶20,4℃下酶解3 d,溶液以12 000g離心20 min,在上清液中加入NaCl至終濃度為0.7 mol/L,使膠原蛋白鹽析,離心回收沉淀,沉淀即為PSC。

上述所有操作均在4℃條件下進(jìn)行。

1.2.3 膠原蛋白的氨基酸組成分析 采用楊婷婷[11]的方法并做調(diào)整。準(zhǔn)確稱取25 mg樣品(塊狀需粉碎)于消解管中,加入5mL 6mol/LHCl封口,于烘箱(110℃)中水解24 h。水解后樣品于蒸發(fā)皿中水浴蒸干。用衍生緩沖液將蒸干后的物質(zhì)洗脫并定容至25 mL。樣品衍生:采用濾膜濾取2 mL衍生溶液并轉(zhuǎn)至10mL容量瓶中,加入1mL氨基酸衍生試劑后于60℃下水浴1 h,再用平衡緩沖液定容,濾取適量定容后的溶液上樣備用。

1.2.4 不同pH下膠原蛋白的溶解性 參考Zeng等[12]的方法并做調(diào)整。用0.5 mol/L乙酸配制濃度為1.5 mg/mL的膠原蛋白溶液,分別取5 mL溶液于離心管中,采用6 mol/L NaOH和6 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為1.00～10.00,誤差為±0.03,加入蒸餾水使溶液體積至10 mL,pH保持不變,在4℃下攪拌30 min,以13 000g冷凍離心20 min。采用Folin-酚法測定上清中蛋白含量。

膠原蛋白相對(duì)溶解度=(某pH下蛋白的溶解度/最高溶解度)×100％。

1.2.5 不同NaCl濃度下膠原蛋白的溶解性 參考Zeng等[12]的方法并做調(diào)整。各取5 mL 1.5 mg/mL膠原蛋白溶液7份,分別加入5 mL濃度為0、2％、4％、6％、8％、10％、12％的NaCl溶液,至終濃度為0、1％、2％、3％、4％、5％、6％,NaCl濃度相當(dāng)于0、10、20、30、40、50、60 g/L。溶液在4℃下攪拌30 min,而后以13 000g冷凍離心20 min,采用Folin-酚法測定上清中蛋白含量。

膠原蛋白相對(duì)溶解度=(某NaCl濃度下蛋白的溶解度/最高溶解度)×100％。

1.2.6 膠原蛋白的紫外光譜分析(UV) 用0.5 mol/L乙酸溶液配制1 mg/mL膠原蛋白溶液,用紫外分光光度計(jì)在190～400 nm區(qū)間內(nèi)掃描并記錄。

1.2.7 膠原蛋白的熱變性 通過測定膠原蛋白溶液黏度的變化來測定其變性溫度。本試驗(yàn)中采用Zhang等[13]的方法并做適當(dāng)調(diào)整。用0.5 mol/L乙酸配制0.1％的膠原蛋白溶液,將黏度計(jì)和循環(huán)水浴鍋聯(lián)用,在溫度為8～30℃下測定膠原蛋白黏度的變化,升溫速度為2℃/min。以溫度為橫坐標(biāo)、相對(duì)黏度為縱坐標(biāo),繪制黏度變化曲線。

1.2.8 傅里葉紅外光譜掃描(FT-IR) 采用Kiew等[14]的方法并做適當(dāng)調(diào)整。稱取1 mg膠原蛋白干品,加入200 mg KBr手動(dòng)壓片,采用傅里葉紅外光譜儀在400～4000 cm-1波數(shù)區(qū)間內(nèi)掃描,掃描信號(hào)累加32次,儀器分辨率為0.5 cm-1。

1.2.9 遠(yuǎn)紫外圓二色譜(CD)分析 樣品處理參考Pati等[15]和Ogawa等[16]的方法并做調(diào)整。將膠原蛋白溶解于0.5 mol/L乙酸中并稀釋至1 mg/mL,于15、30、45℃水浴中加熱30 min。采用圓二色譜儀(日本JASCO)在波長為190～250 nm遠(yuǎn)紫外區(qū)掃描,掃描速度2 nm/s,石英比色皿采用0.1 cm光程。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外套膜膠原蛋白的分布與特性

2.1.1 外套膜和閉殼肌的膠原蛋白含量 從表1可見,外套膜濕基和干基中膠原蛋白含量分別為2.006％和13.163％,閉殼肌濕基和干基中膠原蛋白含量分別為0.234％和0.936％,可見在外套膜中膠原蛋白含量較為豐富。Mizuta等[8]研究表明,月份、緯度和海域的差異會(huì)影響外套膜膠原蛋白的含量,且隨月份的變化,蝦夷扇貝外套膜濕基和干基中膠原蛋白含量分別在0.98％～1.72％和7.7％～12.6％之間波動(dòng);Ebitani等[17]研究表明, 6—10月,Monbetsu和Yakumo兩個(gè)海域中蝦夷扇貝外套膜濕基中膠原蛋白含量變化分別為1.5％～1.8％和1.3％～2.0％。

表1 蝦夷扇貝外套膜和閉殼肌肌肉中的膠原蛋白含量Tab.1 Collagen content of adductor and mantlemuscle in yesso scallopPatinopecten yessoensis％

2.1.2 外套膜膠原蛋白分子量分布 圖2為外套膜中酸溶性膠原蛋白(ASC)和酶溶性膠原蛋白(PSC)的分子量分布規(guī)律。從ASC圖譜中可明顯發(fā)現(xiàn),蝦夷扇貝外套膜的膠原蛋白屬于典型的Ⅰ型膠原蛋白,具有明顯的α、β和γ3種多肽鏈,且ASC呈現(xiàn)較高的純度。另外,從PSC圖譜可以發(fā)現(xiàn),PSC具有與ASC相同的肽鏈組分(α、β和γ),但是3個(gè)多肽鏈均發(fā)生輕度降解,除α、β和γ肽鏈外,還出現(xiàn)一些低分子條帶。在酶法提取過程中,胃蛋白酶將各肽鏈的端肽切除[18],同時(shí)也不排除多肽鏈發(fā)生部分降解,在PSC圖譜出現(xiàn)的多條低分子蛋白條帶,就是被剪切下的端肽、小部分肽鏈降解組分[19]和胃蛋白酶組分。

對(duì)于ASC而言,其γ鏈的相對(duì)分子質(zhì)量高于220 000,β鏈約為220 000,α鏈在105 000左右。ASC的相對(duì)分子質(zhì)量分布與合浦珠母貝Pinctada fucata閉殼肌、紫貽貝Mytilus galloprovincialis、條紋隔貽貝Septifer virgatus軟體部、蝦夷扇貝閉殼肌、長牡蠣Crassostrea gigas閉殼肌與外套膜、麗文蛤Meretrix lusoria外套膜膠原蛋白[9],以及海蜇Rhopilema asamushi[20]膠原蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分布相似,與日本蝦夷扇貝外套膜中膠原蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分布相同[6-7]。

注:M為MarkerNote:M,Marker圖2 外套膜膠原蛋白的分子量分布Fig.2 M olecular weight distribution of scallop mantle collagen

2.1.3 外套膜膠原蛋白的紫外光譜掃描分析 圖3為外套膜膠原蛋白(ASC和PSC)的紫外掃描圖譜。從圖3可知,ASC和PSC均在234 nm處有最大特征吸收,這主要是由C=O基團(tuán)中電子的n→π*躍遷產(chǎn)生的。外套膜膠原蛋白的紫外特征吸收和水產(chǎn)動(dòng)物Ⅰ型膠原蛋白一致,如斑點(diǎn)叉尾鮰Ictaluruspunctaus[21]、羅非魚Oreochromisniloticus[12]、刺參Apostichopus japonisus[22]、中華鱉Pelodiscus sinensis[23]。紫外光譜的苯丙氨酸和酪氨酸的吸收帶在波長250～290 nm之間,而外套膜膠原蛋白在這個(gè)范圍內(nèi)吸收較弱,表明膠原蛋白中芳香族氨基酸含量較低,膠原蛋白純度較高。

圖3 外套膜膠原蛋白紫外光譜掃描圖譜Fig.3 Ultraviolet spectrum of scallop mantle

2.1.4 外套膜膠原蛋白的氨基酸組成 從表2可見:ASC中主要氨基酸組成依次為Gly 15.336％、Glu 10.373％、Pro 6.736％、Hyp 5.706％、Asp 5.465％、Arg 5.120％、Ala 3.266％;PSC的主要氨基酸組成依次為Gly 11.391％、Glu 8.042％、Asp 6.385％、Pro 5.623％、Hyp 3.694％、Arg 3.097％、Ala 2.679％?，F(xiàn)有對(duì)貝類外套膜膠原蛋白的研究報(bào)道不多,Choi等[7]對(duì)韓國產(chǎn)蝦夷扇貝外套的研究表明,其主要氨基酸組成為Gly 23％、Glu 14％、Pro 9％、Asp 9％、Hyp 8％、Arg 7％、Ala 4％;Shen等[6]對(duì)日本北海道產(chǎn)蝦夷扇貝外套膜膠原蛋白的研究表明,其氨基酸中Gly為33.1％、Glu為11.1％。本研究中,PSC和ASC中的氨基酸含量與Choi[7]、Shen等[6]研究結(jié)果有一定差異。首先,不排除產(chǎn)地因素對(duì)外套膜氨基酸組成的影響,不同產(chǎn)地因生長環(huán)境及餌料組成的差異對(duì)扇貝生長的影響不能忽視;此外,因處理方式不同,所得膠原蛋白的化學(xué)組分也存在一定差異,本研究中PSC的提取原料來自于ASC提取后的沉淀,此沉淀仍混有膠原蛋白酶解后的端鏈、微量雜蛋白和胃蛋白酶,而Choi[7]、Shen等[6]已將酶解后的端鏈和胃蛋白酶脫除。

表2 蝦夷扇貝外套膜ASC和PSC的氨基酸組成Tab.2 Am ino acid composition of acid soluble collagen and pepsin soluble collagen from mantle of yesso scallopPatinopecten yessoensis％

2.1.5 外套膜膠原蛋白溶解度的變化 從圖4-A可知,ASC和PSC在不同pH下的溶解度變化趨勢相似,PSC的溶解度總體上高于ASC,這主要是由于胃蛋白酶將膠原蛋白的端肽切除和微量降解使得分子量降低,導(dǎo)致PSC溶解性高于ASC。ASC和PSC的溶解度在pH為1～3時(shí)幾乎沒有變化,在pH為4時(shí)則均為最低,這表明二者的等電點(diǎn)在pH為4左右。與外套膜膠原蛋白不同,有學(xué)者研究表明,脊椎動(dòng)物魚類如褐藍(lán)子魚Siganus fuscescens、南方舵魚Kyphosus bigibbus、鳶鲼Myliobatis tobijei、赤魟Dasyatisakajei、光魟Dasyatis laevigatus[24]、狹鱈Theragra chalcogramma魚皮[25]和軍曹魚Rachycentron canadum[19]魚皮膠原蛋白等電點(diǎn)均在pH為7左右。而對(duì)于無脊椎動(dòng)物膠原蛋白等電點(diǎn)的研究尚未發(fā)現(xiàn)。外套膜膠原蛋白和魚皮間等電點(diǎn)的差異可能源于物種、提取方法等因素。

從圖4-B可知,ASC和PSC在不同NaCl濃度下的溶解度變化趨勢相似,PSC的溶解度總體上高于ASC,這與對(duì)脊椎動(dòng)物魚類[24-25]的研究結(jié)果相似。隨著NaCl濃度的升高,ASC溶解度急劇下降,在濃度達(dá)到30 g/L時(shí)最低;而PSC在NaCl濃度為10～20 g/L時(shí)溶解度急劇下降,濃度高于30 g/L時(shí),大部分PSC析出。膠原蛋白鹽溶性的變化因魚種的差異而不同,如鳙Hypophthalmichthys nobilis和軍曹魚[19]膠原蛋白溶解度在NaCl濃度為40 g/L時(shí)最低,而褐藍(lán)子魚、南方舵魚、鳶鲼、赤魟、光魟[24]、狹鱈魚皮[25]膠原蛋白則在NaCl濃度為60 g/L時(shí)最低。

圖4 pH和NaCl濃度對(duì)外套膜ASC和PSC溶解度的影響Fig.4 Influences of pH and NaCl concentration on solubility ofmantle ASC and PSC

2.1.6 外套膜膠原蛋白的熱變性 從圖5可知, ASC和PSC相對(duì)黏度隨溫度升高而降低,這是黏度隨溫度變化的一般規(guī)律。當(dāng)相對(duì)黏度降為50％時(shí),此時(shí)的溫度即為膠原蛋白的變性溫度。由圖5可知,ASC和PSC的變性溫度均為20℃左右,低于韓國蝦夷扇貝外套膜膠原蛋白(27.4℃)[7]和日本產(chǎn)蝦夷扇貝外套膜膠原蛋白(30～35℃)[8]變性溫度,同時(shí)也低于大部分脊椎動(dòng)物膠原蛋白的變性溫度,如草魚(28.4℃)、大眼鯛(28.7℃)、豬皮(37℃)、日本鱸魚(26.5℃)膠原蛋白,但高于真鱈(15℃)[26]和阿拉斯加狹鱈(16.8℃)[27]膠原蛋白變性溫度,這些差異性來源于物種、生活環(huán)境和地域的不同。ASC熱變性溫度略高于PSC,藍(lán)點(diǎn)馬鮫Scomberomorous niphonius皮和骨的膠原蛋白也具有此特點(diǎn)[28],ASC在12℃前相對(duì)黏度幾乎沒有變化,而PSC卻在下降,這進(jìn)一步說明ASC的熱穩(wěn)定性高于PSC。

圖5 外套膜ASC和PSC相對(duì)黏度隨溫度的變化規(guī)律Fig.5 Relative viscosity variation in ASC and PSC w ith tem perature changes

2.2 外套膜膠原蛋白的結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 膠原蛋白傅里葉紅外光譜掃描分析 圖6為蝦夷扇貝ASC和PSC的FT-IR掃描圖譜,從中可以觀察到膠原蛋白的幾個(gè)特征吸收峰,包括酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ帶,這與斑點(diǎn)叉尾鮰[21]、鯰Hybrid clariassp.[14]魚皮和老鼠尾部[29]的膠原蛋白相同。

注:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、A、B分別為膠原蛋白紅外特征吸收峰Note:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,A and B represents characteristic peaks of collagen圖6 外套膜ASC和PSC傅里葉紅外光譜圖譜Fig.6 Fourier transform infrared spectroscopy of m antle ASC and PSC

膠原蛋白的特征吸收峰的詳細(xì)說明見表3。酰胺A帶主要反映了N-H伸縮振動(dòng),一般情況下, N-H自由伸縮振動(dòng)在3400～3440 cm-1有吸收峰[30],而本試驗(yàn)中ASC與PSC在3330 cm-1附近有吸收峰,據(jù)Doyle等[30]報(bào)道,當(dāng)多肽中NH基團(tuán)參與氫鍵的形成時(shí)吸收峰波數(shù)會(huì)降低,一般在3300 cm-1波數(shù)附近;ASC和PSC的酰胺B帶吸收波數(shù)分別為2958 cm-1和2959 cm-1,這主要反映了CH2非對(duì)稱伸縮振動(dòng),在2855、2853 cm-1處反映了CH2對(duì)稱伸縮振動(dòng)[15];酰胺Ⅰ帶的特征吸收一般在1600～1700 cm-1,ASC和PSC在1657、1658 cm-1處的吸收峰為酰胺Ⅰ帶,主要是由肽骨架中C=O伸縮與COO-形成的氫鍵引起的[15],酰胺Ⅰ帶反映了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的敏感區(qū)域[31];由N-H彎曲振動(dòng)和C-N伸縮振動(dòng)引起的酰胺Ⅱ帶一般在1550～1600 cm-1有最大吸收,ASC和PSC的酰胺Ⅱ帶吸收峰分別為1536 cm-1和1533 cm-1,酰胺Ⅱ帶向低波數(shù)遷移表明蛋白分子中氫鍵的存在[32];酰胺Ⅲ帶吸收峰在1220～1320 cm-1,是由N-H彎曲振動(dòng)和C-N伸縮振動(dòng)所引起,在酰胺Ⅲ帶和1450 cm-1間有強(qiáng)烈的吸收峰,這表明ASC和PSC具有穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)[33-34]。

表3 紅外光譜中ASC和PSC基團(tuán)峰位置及振動(dòng)方式Tab.3 Peak locations and assignment for ASC and PSC in FT-IR

2.2.2 膠原蛋白圓二色譜分析 圖7為外套膜ASC和PSC的圓二色譜圖譜。圓二色譜反映了膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[15]。從圖7可知,ASC和PSC圖譜的趨勢相似,且與膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)圖譜相似。ASC和PSC分別在222～224、202～210 nm處有最大和最小摩爾橢圓率,不同溫度處理后的膠原蛋白圓二圖譜一致交叉在212 nm左右。在15℃時(shí),ASC和PSC最小摩爾橢圓率均出現(xiàn)在206 nm處,在30、45℃時(shí)藍(lán)移至202 nm附近,且隨溫度升高摩爾橢圓率不斷增大;各溫度下,ASC和PSC的最大摩爾橢圓率均出現(xiàn)在222 nm處。ASC和PSC在15℃時(shí)橢圓率最大,且隨溫度的升高橢圓率不斷降低,表明在30、45℃時(shí)膠原蛋白發(fā)生變性,這與黏度變化相符,且膠原蛋白的熱變性是不可逆的。以上結(jié)論與對(duì)多須石首魚Pogonias cromis、羊頭鯛Archosargus probatocephalus魚皮[16]和拉魚巴Catla catla魚鱗膠原蛋白[15]的研究結(jié)果相同。。

圖7 在15、30、45℃時(shí)ASC和PSC的圓二色譜圖譜Fig.7 CD spectra ofm antle ASC and PSC at 15,30℃,and 45℃

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,蝦夷扇貝外套膜與其他無脊椎貝類相同,含有較豐富的膠原蛋白(13％),具有典型的Ⅰ型膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu),其熱變性溫度在20℃左右,等電點(diǎn)在pH為4左右。ASC與PSC二者在純度、熱穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)等方面具有部分差異。與國外同類研究結(jié)論相比,中國蝦夷扇貝外套膜膠原蛋白的熱穩(wěn)定性有較大差異,有待進(jìn)一步研究探索

[1]孔繁東,丁琦,祖國仁,等.扇貝裙邊醬油的開發(fā)與研究[J].中國釀造,2008(5):57-60.

[2]鄭麗,汪秋寬.扇貝加工廢棄物海鮮調(diào)味料的加工利用[J].水產(chǎn)科學(xué),2005,24(1):34-37.

[3]崔金會(huì).蝦夷扇貝裙邊水解蛋白的制備工藝與生物活性研究[D].青島:中國科學(xué)院研究生院(海洋研究所),2012.

[4]汪濤,曾慶祝,謝智芬.內(nèi)肽酶與端肽酶水解扇貝邊蛋白質(zhì)工藝的研究[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,18(2):125-129.

[5]劉聰,趙前程,李智博,等.扇貝裙邊膠原蛋白酶解物清除超氧陰離子能力的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2009,28(3): 338-341.

[6]Shen Xuanyi,Hideyuki K,Koretaro T.Characterization ofmolecular species of collagen in scallop mantle[J].Food Chemistry, 2007,102(4):1187-1191.

[7]Choi JH,Behnam S,Kim SM.Physico-biochemical characteristics of scallop mantle collagen soluble in pepsin[J].Journal of Agricultural Science and Technology,2013,15(2):293-302.

[8]Mizuta S,Nakanishi Y,Shiraishi M,et al.Properties of scallop mantle collagen:its content,tissue distribution and thermal behavior[J].Fisheries Science,2007,73(6):1353-1361.

[9]Mizuta S,Miyagi T,Nishimiya T,et al.Partial characterization of collagen in several bivalvemolluscs[J].Food Chemistry,2004,87 (1):83-88.

[10]Mizuta S,Miyagi T,Nishimiya T,et al.Partial characterization of collagen inmantle and adductor of pearl oyster(Pinctada fucata) [J].Food Chemistry,2002,79(3):319-325.

[11]楊婷婷.采捕后活品蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)的風(fēng)味變化[D].大連:大連海洋大學(xué),2014.

[12]Zeng Shaokui,Zhang Chaohua,Lin Hong,et al.Isolation and characterisation of acid-solubilised collagen from the skin of Nile tilapia(Oreochromis niloticus)[J].Food Chemistry,2009,116 (4):879-883.

[13]Zhang Yan,Liu Wentao,Li Guoying,et al.Isolation and partial characterization of pepsin-soluble collagen from the skin of grass carp(Ctenopharyngodon idella)[J].Food Chemistry,2007,103 (3):906-912.

[14]Kiew P L,Mashitah M D.Isolation and characterization of collagen from the skin ofMalaysian catfish(HybridClariassp.)[J]. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 2013,56(4):441-450.

[15]Pati F,Adhikari B,Dhara S.Isolation and characterization of fish scale collagen of higher thermal stability[J].Bioresource Technology,2010,101(10):3737-3742.

[16]Ogawa M,Moody M W,Portier R J,et al.Biochemical properties of black drum and sheepshead seabream skin collagen[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2003,51(27):8088-8092.

[17]Ebitani K,Narita M,Takahashi H,et al.Fundamental investiga-tion for effective utilization of collagen in scallop mantle[C]// Annu Rep Hokkaido Abashiri Fish Exp Sta.Tokyo:Tokai University Press,2003:93-96.

[18]˙Zelechowska E,Sadowska M,Turk M.Isolation and some properties of collagen from the backbone of Baltic cod(Gadusmorhua) [J].Food Hydrocolloids,2010,24(4):325-329.

[19]Zeng Shaokui,Yin Juanjuan,Yang Shuqi,et al.Structure and characteristics of acid and pepsin-solubilized collagens from the skin of cobia(Rachycentron canadum)[J].Food Chemistry, 2012,135(3):1975-1984.

[20]Nagai T,Worawattanamateekul W,Suzuki N,et al.Isolation and characterization of collagen from rhizostomous jellyfish(Rhopilema asamushi)[J].Food Chemistry,2000,70(2):205-208.

[21]Liu Haiying,Li Ding,Guo Shidong.Studies on collagen from the skin of channel catfish(Ictalurus punctatus)[J].Food Chemistry,2007,101(2):621-625.

[22]王哲平,劉淇,曹榮,等.溫度對(duì)刺參膠原蛋白結(jié)構(gòu)和分子量變化的影響[J].漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展,2011,32(6):80-84.

[23]陸劍鋒,萬全,殷章敏,等.中華鱉裙邊膠原蛋白的提取及其特征[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2010,34(6):981-988.

[24]Bae I,Osatomi K,Yoshida A,et al.Biochemical properties of acid-soluble collagens extracted from the skins of underutilised fishes[J].Food Chemistry,2008,108(1):49-54.

[25]閆鳴艷.狹鱈魚皮膠原蛋白結(jié)構(gòu)和物理特性的研究[D].青島:中國海洋大學(xué),2009.

[26]Rigby B J.Amino-acid composition and thermal stability of the skin collagen of the Antarctic ice-fish[J].Nature,1968,219: 166-167.

[27]Kimura S,Ohno Y,Miyauchi Y,et al.Fish skin type I collagen: wide distribution of anα3subunit in teleosts[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Comparative Biochemistry, 1987,88(1):27-34.

[28]Li Zhongrui,Wang Bin,Chi Changfeng,et al.Isolation and characterization of acid soluble collagens and pepsin soluble collagens from the skin and bone of Spanish mackerel(Scomberomorous niphonius)[J].Food Hydrocolloids,2013,31(1):103-113.

[29]Sionkowska A.Modification of collagen films by ultraviolet irradiation[J].Polymer Degradation and Stability,2000,68(2):147-151.

[30]Doyle B B,Bendit E G,Blout E R.Infrared spectroscopy of collagen and collagen-like polypeptides[J].Biopolymers,1975,14 (5):937-957.

[31]Liu Dasong,Liang Li,Regenstein JM,et al.Extraction and characterisation of pepsin-solubilised collagen from fins,scales, skins,bones and swim bladders of bighead carp(Hypophthalmichthys nobilis)[J].Food Chemistry,2012,133(4):1441-1448.

[32]Ahmad M,Benjakul S.Extraction and characterisation of pepsinsolubilised collagen from the skin of unicorn leatherjacket (Aluterusmonocerous)[J].Food Chemistry,2010,120(3):817-824.

[33]Guzzi Plepis A M D,Goissis G,Das-Gupta D K.Dielectric and pyroelectric characterization of anionic and native collagen[J]. Polymer Engineering&Science,1996,36(24):2932-2938.

[34]Matmaroh K,Benjakul S,Prodpran T,et al.Characteristics of acid soluble collagen and pepsin soluble collagen from scale of spotted golden goatfish(Parupeneus heptacanthus)[J].Food Chemistry, 2011,129(3):1179-1186.

Extraction and characterization of collagen from yesso scallopPatinopecten yessoensismantle

WU Zhong,LIU Jun-rong,TIAN Yuan-yong,ZHANG Long,LIU Jin-yang
(College of Food Science and Engineering,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

Themantle collagen were extracted and its physicochemical properties includingmolecularweight,solubility,viscosity,ultraviolet(UV)absorption,and amino acid composition and structural characteristics(CD,FTIR)were studied in yesso scallopPatinopecten yessoensisin order to explore the high value-added use of scallop byproducts.The results showed that there was 13.16％of collagen in drymantle.Collagen moleculeswere primarily consisted ofαsubunit and a small amountofβ,γsubunits,and the peptidemolecularweightwas reduced because the pepsin removed the telopeptide of subunits.Mantle collagen was characterized by a typical type I collagen, whose acid soluble collagen(ASC)and enzymatic soluble collagen(PSC)were rich in glycine,glutamic acid, proline and hydroxyproline.The collagen had denatured temperature of about 20℃,and was different from collagens of other species in that PSC had a higher solubility than ASC did.They had isoelectric point of pH 4 and the similar salt solubility.Fourier transform infrared spectroscopy revealed that there was subtle difference in secondary structure between PSC and ASC.However,pepsin did not affect the triple helical structure of the collagen.Circular dichroism spectrum indicated that the ASC had more stable tertiary structure than PSC and that increase in temperature undermined the tertiary structure.

Patinopecten yessoensis;mantle;physicochemical property;collagen

Q954.4

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.06.016

2095-1388(2016)06-0678-07

2015-06-02

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31271980)

吳忠(1988—),男,碩士研究生。E-mail:wuzhong6837@163.com

劉俊榮(1963—),女,博士,教授。E-mail:ljunrong@dlou.edu.cn